王曉 張凌云

原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)的主要致死病因之一[1]。目前手術(shù)是早期肝癌的有效治療手段,但大部分患者確診時已經(jīng)是中晚期[2]。雖然凋亡相關(guān)的治療方法取得一定的效果,但是仍然達不到臨床期望療效[3]。鐵死亡是新近發(fā)現(xiàn)的一種鐵離子依賴的程序性細(xì)胞死亡方式。癌細(xì)胞表現(xiàn)出的代謝特點和對鐵的依賴性使鐵死亡誘導(dǎo)劑治療腫瘤成為可能,促進鐵死亡的發(fā)生可有效干預(yù)腫瘤進展[4-6]。鐵死亡過程中伴隨著細(xì)胞內(nèi)大量鐵離子的累積、谷胱甘肽消耗、脂質(zhì)過氧化及脂質(zhì)活性氧的產(chǎn)生。鐵離子、氨基酸代謝及脂質(zhì)過氧化等相關(guān)的信號通路影響鐵死亡的發(fā)生[7, 8]。谷胱甘肽過氧化物酶 4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、 溶質(zhì)載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)、線粒體相關(guān)凋亡誘導(dǎo)因子2(apoptosis-inducing factor mitochondria-associated 2,AIFM2)、長鏈脂酰輔酶A合成酶4(acyl-CoA synthetase long-chain family member 4,ACSL4)、核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是鐵死亡通路的關(guān)鍵調(diào)控基因[4, 6, 9]。本研究運用生物信息學(xué)分析鐵死亡通路關(guān)鍵基因在肝癌中的表達,以及其與臨床預(yù)后、免疫調(diào)控的關(guān)系,為進一步優(yōu)化肝癌的治療方案及鐵死亡的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、基因表達水平分析

運用在線數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn)對鐵死亡通路關(guān)鍵基因在人肝癌組織及正常肝組織中的mRNA表達水平進行對比分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

二、基因改變頻率分析

采用cBioPortal數(shù)據(jù)庫(http://www.cbioportal.org)分析肝癌患者鐵死亡通路關(guān)鍵基因改變的情況。

三、預(yù)后分析

采用在線工具Kaplan-Meier生存曲線(http://www.kmplot.com)和GEPIA數(shù)據(jù)庫評估鐵死亡通路關(guān)鍵基因表達水平的預(yù)后價值。

四、免疫浸潤細(xì)胞分析

TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)在線數(shù)據(jù)庫分析肝癌患者鐵死亡通路關(guān)鍵基因與免疫細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)性。

五、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)性分析

TIDE(http://tide.dfci.harvard.edu/contact/)在線數(shù)據(jù)庫分析鐵死亡通路關(guān)鍵基因與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的相關(guān)性。

結(jié) 果

一、鐵死亡通路關(guān)鍵基因在肝癌中的表達

采用GEPIA在線數(shù)據(jù)庫分析鐵死亡通路5個關(guān)鍵基因(GPX4、SLC7A11、AIFM2、ACSL4、Nrf2)在肝癌組織中的mRNA表達水平。5個關(guān)鍵基因在腫瘤組織中的mRNA表達量均高于正常組織。但是與正常組織相比,GPX4、SLC7A11、AIFM2、Nrf2這4個基因在腫瘤組織中的mRNA表達量升高差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。肝癌組織中ACSL4的mRNA表達量高于正常組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

圖1 鐵死亡通路關(guān)鍵基因在GEPIA數(shù)據(jù)庫中的表達

二、鐵死亡通路關(guān)鍵基因的基因突變

常見的基因突變有基因擴增、缺失突變、插入突變、移碼突變、點突變、框內(nèi)突變等。運用在線數(shù)據(jù)庫cBioPortal分析鐵死亡通路關(guān)鍵基因(GPX4、SLC7A11、AIFM2、ACSL4、Nrf2)的改變。結(jié)果顯示以上基因改變主要包括基因擴增、缺失突變、點突變(錯義突變)、框內(nèi)突變。GPX4及SLC7A11均存在0.8%的缺失突變。AIFM2、ACSL4、Nrf2均存在擴增突變,其中Nrf2擴增突變頻率最高且突變類型最為豐富,包括基因擴增、框內(nèi)突變、點突變(錯義突變)、缺失突變四種類型,見圖2。

圖2 鐵死亡通路關(guān)鍵基因表達在肝癌中的改變

三、鐵死亡通路關(guān)鍵基因在肝癌中的預(yù)后價值

Kaplan-Meier生存分析顯示,GPX4高表達時肝癌患者的無進展生存期明顯升高,預(yù)示著肝癌患者有較好的預(yù)后(HR=0.68,P=0.014 );而SLC7A11 高表達時肝癌患者的總生存期短(HR=2.41,P=5.3e-07),且與無進展生存期呈負(fù)相關(guān)(HR=1.79,P=0.00043),在Stage Ⅰ-Ⅲ的肝癌患者中,隨著腫瘤分期的升高,SLC7A11的表達量逐漸升高,以上結(jié)果均提示高表達SLC7A11與肝癌患者的不良預(yù)后相關(guān),見圖3。

圖3 鐵死亡通路關(guān)鍵基因表達與肝癌患者臨床資料的相關(guān)性分析

四、鐵死亡通路關(guān)鍵基因與機體免疫系統(tǒng)的關(guān)系

通過TIMER數(shù)據(jù)庫分析鐵死亡通路關(guān)鍵基因與機體免疫系統(tǒng)的關(guān)系。SLC7A11在肝癌中的表達與B細(xì)胞(Cor=0.185,P=5.68e-04)、CD8+T淋巴細(xì)胞(Cor=0.136,P=1.18e-02)、CD4+T淋巴細(xì)胞(Cor=0.128,P=1.73e-02)、巨噬細(xì)胞(Cor=0.21,P=9.62e-05)、中性粒細(xì)胞(Cor=0.293,P=2.89e-08)和樹突狀細(xì)胞(Cor=0.244,P=5.51e-06)的浸潤呈正相關(guān);Nrf2的高表達與B細(xì)胞(Cor=0.153,P=4.34e-03)、CD8+T淋巴細(xì)胞(Cor=0.138,P=1.04e-02)、CD4+T淋巴細(xì)胞(Cor=0.297,P=1.92e-08)、巨噬細(xì)胞(Cor=0.244,P=5.06e-06)、中性粒細(xì)胞(Cor=0.389,P=6.55e-14)和樹突狀細(xì)胞(Cor=0.261,P=1.02e-06)的浸潤也呈正相關(guān)(P<0.05)。未發(fā)現(xiàn)其他鐵死亡通路關(guān)鍵基因與機體免疫浸潤細(xì)胞之間的相關(guān)性,見圖4。

圖4 鐵死亡通路關(guān)鍵基因表達與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性的分析

五、鐵死亡通路關(guān)鍵基因與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)性分析

TIDE在線數(shù)據(jù)庫分析顯示無論AIFM2的表達水平如何變化,CTL水平對患者預(yù)后影響不變,提示AIFM2與CTL數(shù)量沒有顯著相關(guān)性,見圖5。

圖5 鐵死亡通路關(guān)鍵基因表達與CTL相關(guān)性分析

討 論

誘導(dǎo)鐵死亡可產(chǎn)生顯著的抗腫瘤作用,尤其對具有耐藥特性及對傳統(tǒng)治療反應(yīng)性低的腫瘤具有良好的治療作用,目前已經(jīng)成為腫瘤治療的潛在有效方法之一[6, 10]。鐵死亡本質(zhì)上是由于鐵過載造成的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧累積而引起的細(xì)胞死亡,它與細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡相關(guān),目前已知多個關(guān)鍵基因?qū)﹁F死亡的調(diào)控有著決定性的作用[9, 10]。

GPX4主要是通過消耗谷胱甘肽清除脂質(zhì)活性氧抑制鐵死亡,多數(shù)鐵死亡誘導(dǎo)劑通過抑制GPX4活性直接導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生,因此GPX4表達在鐵死亡中發(fā)揮著極為關(guān)鍵的作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)GPX4在肝癌中存在著低頻率的缺失突變,進一步通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),高表達GPX4后,肝癌的無進展生存期升高,暗示了GPX4在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。相關(guān)研究顯示GPX4在包括肝癌在內(nèi)的多種實體瘤中表達均升高,可能發(fā)揮著促癌的作用[10]。

谷胱甘肽是GPX4參與抗氧化的必要底物,而其合成依賴于氨基酸的轉(zhuǎn)運[12]。研究表明SLC7A11是胱氨酸轉(zhuǎn)運體的重要組成部分,在多種惡性腫瘤中過表達,能夠抑制鐵死亡、促進腫瘤發(fā)展[13],與本研究的結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)SLC7A11在肝癌組織中表達量高于癌旁組織,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;高表達SLC7A11的患者總生存期及無病生存期明顯低于低表達SLC7A11的患者,此外SLC7A11與多種免疫細(xì)胞浸潤存在顯著相關(guān)性,如T細(xì)胞、B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等,說明SLC7A11與肝癌患者的免疫微環(huán)境調(diào)控相關(guān),以上結(jié)果提示SLC7A11參與肝癌的進展,可能是肝癌治療中有效的靶點及預(yù)后因子。

AIFM2是一個被新發(fā)現(xiàn)的鐵死亡抑制基因,通過還原細(xì)胞膜上的輔酶Q10阻止脂質(zhì)過氧化代償GPX4缺失引起的鐵死亡,也稱為鐵死亡抑制蛋白1(ferroptosis suppressor protein 1, FSP1)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)AIFM2在肝癌中的突變主要是擴增突變,且隨著腫瘤分期的升高,AIFM2表達量逐漸升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義,相關(guān)性分析顯示AIFM2不影響體內(nèi)CTL水平,其表達與肝癌免疫治療無明顯的相關(guān)性。以上結(jié)果提示AIFM2可能參與肝癌的發(fā)生發(fā)展,其基因擴增有可能參與肝癌的惡性生物學(xué)行為,但是在生存預(yù)后分析及免疫相關(guān)分析中未見明顯陽性結(jié)果,需要擴大樣本量進一步驗證。

ACSL4正常生理狀態(tài)下分布于生成類固醇的組織和器官,如腎上腺和卵巢,參與磷脂酰乙醇胺或磷脂酰肌醇等易氧化膜磷脂的合成,促進多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化,從而促進鐵死亡發(fā)生[15, 16]。本研究發(fā)現(xiàn)ACSL4在肝癌中表達明顯升高,存在低頻率的基因擴增,但ACSL4的表達沒有預(yù)測價值。

Nrf2是調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激的核心轉(zhuǎn)錄因子, 通過與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合,激活下游調(diào)節(jié)鐵和脂質(zhì)活性氧代謝相關(guān)基因從而抑制鐵死亡[17, 18]。本研究分析結(jié)果提示Nrf2的基因擴增頻率較高,另外Nrf2與T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞浸潤存在顯著正相關(guān),以上結(jié)果提示Nrf2可能參與到肝癌患者的免疫微環(huán)境調(diào)控相關(guān),也說明鐵死亡代謝通路在一定程度上參與到機體免疫系統(tǒng)的調(diào)控中。此外,Nrf2高表達的患者總生存期較長,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義,其預(yù)后價值還需要在更多的標(biāo)本進行分析。

綜上所述,鐵死亡通路的關(guān)鍵基因除了調(diào)控腫瘤鐵死亡,還能夠在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用,具有一定的預(yù)測價值,此外肝癌患者中部分鐵死亡通路關(guān)鍵基因的改變能夠影響人體的免疫微環(huán)境,提示其可以應(yīng)用到瘤免疫治療或鐵死亡聯(lián)合療法中。本研究結(jié)果豐富了鐵死亡通路關(guān)鍵基因的潛在應(yīng)用價值,為優(yōu)化鐵死亡治療策略及腫瘤聯(lián)合治療方法的研發(fā)提供新的依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。