李丹，程天印

（1.邵陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，湖南 邵陽 422000；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

山莓（Rubus corchorifolius L.F.）為屬薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus. L）植物，在我國分布廣泛，其野生資源尤以長江流域最為豐富[1]。據(jù)《本草綱目》《名醫(yī)別錄》《食療本草》《本草拾遺》等多部古籍記載，山莓的根、莖、葉、果實(shí)均可入藥，且用藥部位不同，藥效也有所差異[2,3]。根據(jù)有關(guān)研究表明，山莓葉中含有多種有效成分，本實(shí)驗(yàn)擬以山莓葉中總黃酮為研究對象，對其提取工藝進(jìn)行探討和優(yōu)化，為下一步研究大孔樹脂富集山莓葉總黃酮工藝打好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、無水乙醇（C2H5OH,A.R）、亞硝酸鈉（NaNO2，A.R）、硝酸鋁（Al（NO3）3，A.R）A.R、氫氧化鈉（NaOH，A.R）。

1.1.2 主要儀器

JY98-3D 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、恒溫水浴鍋、UV-VIS 分光光度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮的測定方法

采用Al(NO3)3絡(luò)合分光光度法，應(yīng)用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH 反應(yīng)體系，用不加NaNO2的樣品液作空白對照溶液。

1.2.2 乙醇回流提取山莓葉黃酮

1.2.2.1 乙醇濃度對山莓葉黃酮得率的影響

精確稱量干山莓葉粉末6 份，每份2.00 g，在60℃溫度下，按1∶20 的固液比，分別以40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇濃度回流提取山莓葉粉末1 h，重復(fù)提取一次，合并提取液至100mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度線，分別測定這6 份提取物中的山莓葉黃酮含量。

1.2.2.2 固液比對山莓葉黃酮得率的影響

精確稱量取干山莓葉粉末4 份，每份2.00g，在60℃的溫度下，用80%濃度的乙醇分別以1∶5、1∶10、1∶20、1∶40 的固液比回流提取山莓葉粉末1 h，重復(fù)提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度線，分別測定這4 份不同固液比提取物中的山莓葉黃酮含量。

1.2.2.3 提取溫度對山莓葉黃酮得率的影響

精確稱量干山莓葉粉末4 份，每份2.00 g，用80%濃度的乙醇、1∶10 的固液比，分別在50℃、65℃、80℃、95℃的溫度下回流提取山莓葉粉末1 h，重復(fù)提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度線，分別測定不同回流提取溫度下4 份提取物中的山莓葉黃酮含量。

1.2.2.4 提取時間對山莓葉黃酮得率的影響

精確稱量干山莓葉粉末4 份，每份2.00 g，在80℃溫度下，用80%濃度的乙醇以1∶10 的固液比，分別回流提取山莓葉粉末1、2、3、4 h，重復(fù)提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度線，分別測定這4 份不同回流提取時間的提取物中山莓葉黃酮的含量。

1.2.2.5 回流提取正交試驗(yàn)

分別精確稱量干山莓葉粉末2.00 g，在上述單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對影響提取得率的乙醇濃度、固液比、提取溫度、提取時間四因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，運(yùn)用L9(34)正交表篩選山莓葉黃酮回流提取的最佳工藝。

1.2.3 超聲波提取山莓葉黃酮

1.2.3.1 超聲時間的選擇

精確稱量山莓葉粉末5 份，每份2.00 g，在40℃溫度下，用80%濃度的乙醇、以1∶25 的固液比超聲提取山莓葉粉末5、15、25、35、45 min，重復(fù)提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度線，分別測定這5 份不同超聲提取時間的提取物中山莓葉黃酮的含量。

1.2.3.2 固液比的影響

精確稱量山莓葉粉末6 份，每份2.00 g，在40℃溫度下，用80%濃度的乙醇分別以1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 的固液比超聲提取山莓葉粉末35 min，重復(fù)提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度線，分別測定這6 份提取物中山莓葉黃酮的含量

1.2.3.3 乙醇濃度的影響

精確稱量山莓葉粉末5 份，每份2.00 g，在40℃溫度下，按1∶25 的固液比，分別用50%、60%、70%、80%、90%濃度的乙醇超聲提取山莓葉粉末35 min，重復(fù)提取一次，合并提取液至100 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度線，分別測定這5 份提取物中山莓葉黃酮的含量。

1.2.3.4 溫度的影響

精確稱量山莓葉粉末5 份，每份2.00g，用80%濃度的乙醇以1∶25 的固液比，分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的溫度下超聲提取山莓葉粉末35 min，重復(fù)提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度線，分別測定這5 份提取物中山莓葉黃酮的含量。

1.2.3.5 超聲提取正交試驗(yàn)

分別精確稱量干山莓葉粉末2.00 g，在上述單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對影響提取得率的提取時間、固液比、乙醇濃度、溫度四因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，運(yùn)用L9(34)正交表篩選山莓葉黃酮超聲波提取的最佳工藝。

圖1 不同乙醇濃度回流提取對山莓葉黃酮得率的影響

1.2.4 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇回流提取山莓葉黃酮

2.1.1 乙醇濃度對黃酮得率的影響

在60℃溫度下，按1∶20 的固液比，分別以40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇濃度回流提取山莓葉粉末1 h，重復(fù)提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度線，分別測定各提取物中的黃酮含量。

圖2 不同固液比回流提取對山莓葉黃酮得率的影響

從圖1 可以看出，在固料比、提取溫度、提取時間均相同的條件下，乙醇濃度與山莓葉黃酮得率成正比，山莓葉黃酮浸出率隨乙醇濃度升高而升高，但當(dāng)乙醇濃度超過80%以后，山莓葉黃酮得率增加不明顯。

2.1.2 固液比對黃酮得率的影響

圖3 不同溫度回流提取對山莓葉黃酮得率的影響

用80%濃度乙醇分別以1∶5、1∶10、1∶20、1∶40 的固液比回流提取山莓葉粉末1 h，重復(fù)提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度線，分別測定這4 份不同固液比提取物中的山莓葉黃酮含量。

從圖2 中可以看出，當(dāng)固液比在1∶5 到1∶10 之間時，隨著固液比的增加，黃酮提取率增加明顯，但超過1∶10 之后，黃酮的提取率增加緩慢。

2.1.3 回流提取溫度對黃酮得率的影響

用80%濃度的乙醇與山莓葉粉末以1∶10 的固液比，分別在50℃、65℃、80℃、95℃的溫度下回流提取1 h，重復(fù)提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度線，分別測定這4 份不同溫度提取物中的山莓葉黃酮含量。

試驗(yàn)顯示，在50℃～80℃時，黃酮得率隨溫度的升高而明顯增加，但提取溫度為95℃時，黃酮得率低于在80℃時的提取率，故選擇80℃為最佳提取溫度。

2.1.4 回流提取時間對黃酮得率的影響

在80℃溫度下，用80%濃度的乙醇與山莓葉粉末以1∶10 的固液比，分別回流提取1、2、3、4 h，重復(fù)提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度線，分別測定這4 份不同回流提取時間的提取物中山莓葉黃酮的含量。結(jié)果見圖4。

試驗(yàn)結(jié)果表明，提取時間為3 h 時，山莓葉黃酮得率最高，延長提取時間黃酮得率反而降低。

2.1.5 回流提取正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

圖4 不同時間回流提取對山莓葉黃酮得率的影響

根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)，對影響回流提取山莓葉黃酮得率的乙醇濃度、固液比、提取溫度、提取時間4 個因素進(jìn)行四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，運(yùn)用SPSS 13.0 數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析。結(jié)果見表1。

由表2 的結(jié)果可知，山莓葉黃酮回流提取最佳的提取工藝條件為A3B2C3D3。由極差大小確定主次因素為A＞D＞B＞C，即乙醇濃度＞提取時間＞固液比＞提取溫度。對各因素進(jìn)行多重比較發(fā)現(xiàn)：70%、80%、90%三個濃度的乙醇在提取率上呈現(xiàn)極顯著差異，提取效果最佳的乙醇濃度為90%；提取時間上，提取4 小時得率高于前兩者；固液比以1：10 時效果最好；提取溫度以95℃為最佳。

2.2 超聲波提取山莓葉黃酮

2.2.1 超聲時間的選擇

表1 乙醇回流提取因素水平表

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

在40℃溫度下，用80%濃度的乙醇、以1∶25的固液比分別超聲提取5、15、25、35、45 min，重復(fù)提取一次，合并兩次提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度線，分別測定這5 份不同超聲提取時間的提取物中山莓葉黃酮的含量。

表3 方差分析表

由圖5 可以看出，在其他提取條件相同的情況下，山莓葉黃酮得率隨著超聲時間的增加而增加，但超過35 min 后增加不明顯，故超聲時間選擇35 min。

圖5 超聲時間對山莓葉黃酮得率的影響

2.2.2 固液比的選擇

用80%濃度的乙醇分別以1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 的固液比超聲提取山莓葉粉末35 min，重復(fù)提取一次，合并提取液至100mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度線，分別測定這6 份提取物中山莓葉黃酮的含量。

從圖6 可知，乙醇濃度、提取溫度、提取時間等提取條件相同的情況下，山莓葉黃酮得率隨固液比增大（液體體積增大）而提高，而當(dāng)固液比增大到1∶25 時，山莓葉黃酮得率提高不再明顯，故固液比選擇1∶25。

圖6 不同固液比超聲提取對山莓葉黃酮得率的影響

2.2.3 乙醇濃度的選擇

在40℃溫度下，按1∶25 的固液比，分別用50%、60%、70%、80%、90%濃度的乙醇超聲提取山莓葉粉末35 min，重復(fù)提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度線，分別測定這5 份提取物中山莓葉黃酮的含量，結(jié)果見圖7。

由圖7 看出，在其他提取條件相同的情況下，山莓葉黃酮提取得率隨乙醇濃度增大而提高，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%后則提高不再明顯，故選擇80%的乙醇濃度為最佳超聲提取濃度。

2.2.4 超聲溫度的選擇

用80%濃度的乙醇以1∶25 的固液比，分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的溫度下超聲提取山莓葉粉末35 min，重復(fù)提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度線，分別測定這5 份提取物中山莓葉黃酮的含量，結(jié)果見圖8。

圖7 不同乙醇濃度超聲提取對山莓葉黃酮得率的影響

圖8 不同溫度超聲提取對山莓葉黃酮得率的影響

表4 乙醇超聲提取因素水平表

由上表可以看出，山莓葉黃酮的提取率隨著溫度升高而提高，達(dá)到40℃后黃酮提取率提高不明顯，且溫度過高可破壞黃酮結(jié)構(gòu)，故選擇40℃為最佳提取溫度。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 方差分析表

2.2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)，對影響超聲波提取山莓葉黃酮得率的4 個因素：超聲時間、固液比、乙醇濃度和超聲溫度進(jìn)行四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，運(yùn)用SPSS13.0 數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析。結(jié)果見表4。

由表5 的結(jié)果可知，山莓葉黃酮超聲波提取的最佳工藝條件為A3B2C3D3。由極差大小確定主次因素為A＞C＞B＞D，即超聲時間＞乙醇濃度＞固液比＞超聲溫度。對各因素進(jìn)行多重比較發(fā)現(xiàn)：超聲時間對黃酮提取得率有極顯著影響，35 分鐘時超聲提取得率最好；用1∶20 的固液比提取得率要極顯著優(yōu)于1∶15 和1∶25；70%、80%、90%三個乙醇濃度中90%的濃度提取得率最高；超聲溫度對提取效果的影響最小，50℃時提取效果最好。

3 討論

本試驗(yàn)選用乙醇為提取劑，對山莓葉總黃酮進(jìn)行提取。單因素考察顯示：（1）受乙醇濃度的影響，山莓葉黃酮得率隨乙醇濃度增大而提高，超過一定濃度后則黃酮得率提高不明顯，因此需選擇適當(dāng)?shù)奶崛舛?，既能滿足提取得率較高，又不浪費(fèi)試劑。（2）受固液比的影響，山莓葉粉末與乙醇提取液的固液比增大黃酮得率也隨之升高，但超過一定值后黃酮得率增加不明顯，究其原因概為當(dāng)固液比達(dá)到一定比例后，溶劑已將黃酮類物質(zhì)充分溶出，再增大固液比提取得率亦不會有太大變化。從節(jié)約成本出發(fā)，也避免溶劑用量過大而導(dǎo)致濃縮時間延長，提取應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)墓桃罕?。?）受提取溫度的影響，山莓黃酮得率會隨提取溫度升高而提高，但溫度超過一定值后得率不升反降，究其原因?yàn)?，黃酮類物質(zhì)會隨溶液溫度升高而提高分子無規(guī)則熱運(yùn)動，加速從細(xì)胞中溶出，因此在提取過程中增加溫度有利于黃酮物質(zhì)的提取。但同時，其他雜質(zhì)溶出率也會隨著溫度的升高而也增大，且過高的溫度會氧化破壞黃酮類物質(zhì)，從而影響黃酮得率。（4）受提取時間的影響，按照一般規(guī)律，浸提的時間越久浸提會越完全，但雜質(zhì)的浸出也會同時增加，再加上黃酮類物質(zhì)在高溫下性質(zhì)不穩(wěn)定，如果處于高溫狀態(tài)下過久反而使其因被氧化而得率下降。

為確定最佳提取條件，本試驗(yàn)還根據(jù)單因素試驗(yàn)對影響黃酮得率的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別確定了回流提取和超聲波提取的最佳工藝條件：用95%的乙醇在95℃下以1∶10 的固液比加熱回流提取4 h；用90%的乙醇在50℃下以1∶20 的固液比超聲提取35 min。

對比加熱回流提取法和超聲波提取法的優(yōu)缺點(diǎn)，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在提取溶劑用量上，加熱回流提取法比超聲波提取法所需提取溶劑少，得率也略高于超聲波提取法；在提取時間上，超聲波提取法占優(yōu)勢，且操作較簡便；在設(shè)備上，回流提取法所用設(shè)備簡單，容易普及，且影響因素少[4-6]。兩種提取方法各有所長，也各有不足，在應(yīng)用中可結(jié)合實(shí)際情況選擇適宜的方法。