艾 蓉 張 春 悅曼芳 鄒華文 吳忠義,*

玉米轉錄因子對非生物逆境脅迫的應答

艾 蓉1,2,**張 春2,**悅曼芳2鄒華文1,*吳忠義2,*

1長江大學農(nóng)學院, 湖北荊州 434025;2北京市農(nóng)林科學院 / 生物技術研究所 / 農(nóng)業(yè)基因資源與生物技術北京市重點實驗室, 北京 100097

AP2/ERF (APETALA2/ethylene-responsive factor)轉錄因子是植物中最大的轉錄因子家族之一, 在調(diào)控植物生長發(fā)育和響應逆境脅迫等方面起重要作用。探究玉米(L.) AP2/ERF家族基因功能將為玉米新種質(zhì)創(chuàng)制提供重要的基因資源。本研究克隆獲得了(Gene ID: 103647485)基因, 利用生物信息學分析、實時熒光定量PCR等技術對該基因的基本特性、組織表達特性及響應逆境脅迫表達模式等進行了分析; 對轉基因擬南芥株系進行了相應逆境脅迫處理和表型鑒定。結果顯示: 該基因只包含1個外顯子, cDNA全長為792 bp, 編碼263個氨基酸; ZmEREB211蛋白分子量為27.9 kD, 理論等電點為6.01, 具有AP2家族所特有的保守結構域;基因在玉米根系中的表達量最高, 且在幼根中的表達量高于成熟根中的表達量; 同時該基因在脫水、高鹽、干旱和低溫等處理條件下均有不同程度的誘導表達。在分別含有不同濃度梯度的NaCl、甘露醇(mannitol)和茉莉酸(jasmonic acid, JA)的1/2 MS培養(yǎng)基上, 轉基因擬南芥株系的根長顯著長于野生型。在干旱和高鹽處理下, 盆栽轉基因擬南芥株系較野生型株系表現(xiàn)出更強的耐受性, 且苗期的綠葉數(shù)顯著多于野生型, 過氧化物酶(POD)活性和葉綠素含量均顯著高于野生型。研究表明可能參與調(diào)控玉米根系生長發(fā)育, 對高鹽、干旱、滲透等逆境脅迫及JA激素處理均能起到正向的調(diào)控作用。本研究為進一步解析在玉米中的生物學功能提供了重要的參考依據(jù)。

玉米;; 轉錄因子; 異源表達; 根系; 逆境脅迫

植物在生長過程中會遇到多種環(huán)境脅迫, 干旱、澇漬、高溫、鹽堿、低溫等逆境均會影響植物正常生長, 為了生存, 植物已建立起多種響應機制來調(diào)節(jié)體內(nèi)的生理活動[1-2]。轉錄因子(transcription factor, TF)又稱為反式作用因子, 在植物生長發(fā)育和響應逆境脅迫等過程中具有重要調(diào)控作用[3]。從蛋白質(zhì)結構方面分析, 典型的植物轉錄因子由4個部分組成: DNA結合區(qū)(DNA binding domain)、轉錄調(diào)控區(qū)(transcription regulation domain)、寡聚化位點區(qū)(oligomerization site)和核定位信號區(qū)(nuclear loca-lization signal)[4]。DNA結合區(qū)由一段60～100個氨基酸序列組成。轉錄調(diào)控區(qū)有轉錄激活的結構域和轉錄抑制的結構域2類。寡聚化位點區(qū)所含有的氨基酸序列具有高度保守的特點, 為轉錄因子相互作用提供一個功能區(qū)域。核定位信號區(qū)是一個短肽序列, 賴氨酸和精氨酸殘基較多, 與受體蛋白相結合, 在親核蛋白的幫助下引導整個蛋白通過核孔進入細胞核[5-6]。轉錄因子通過調(diào)控下游逆境相關基因的表達從而改善植物對逆境脅迫的抵抗能力, 因此, 轉錄因子在植物抗逆研究中有著至關重要的作用。植物中約有58個轉錄因子家族, 其中有6個主要的轉錄因子家族: AP2/ERF、bHLH、MYB、NAC、WRKY和bZIP, 被發(fā)現(xiàn)參與植物生長發(fā)育調(diào)控和生物與非生物應激響應, 作為植物防御的主要調(diào)節(jié)因子, 這些轉錄因子的表達和活性受到各種轉錄和轉錄后調(diào)控以及翻譯后修飾的影響[7-8]。

AP2/ERF家族轉錄因子是參與植物非生物脅迫反應的最大轉錄因子家族之一, 該家族轉錄因子的特征是含有1～2段約60個氨基酸殘基組成的AP2/ERF結構域, 該結構域由3條β-折疊(負責DNA結合)和1個α-螺旋基序組成[9]?；贏P2結構域外保守基序的變異和存在, 確定了幾個具有不同DNA親和力的亞家族, 將其分為AP2 (APETALA2)、ERF (ethylene-responsive factor)、DREB (dehydration- responsive element-binding protein)、RAV (related to ABI3/VP1)和Soloist五個亞家族[10]。AP2亞家族含有2個AP2/ERF結構域; ERF和DREB亞家族含有1個AP2/ERF結構域; RAV亞家族含有1個AP2/ERF結構域和1個B3結構域; Soloist亞家族含有1個AP2/ERF結構域, 每個亞家族成員識別不同的順式作用元件, 并擁有其他分子功能所需的額外特定保守基序, 如蛋白間的相互作用和磷酸化[11]。ERF亞家族蛋白可以與一個被稱為乙烯響應(ERE)元件的保守AGCCGCC序列結合, 該序列不僅參與調(diào)節(jié)植物非生物脅迫反應中的基因表達, 而且與植物抗性基因的調(diào)節(jié)密切相關[12], 而DREB亞家族蛋白與順式作用的DRE/CRT元件相互作用, 該元件具有應激誘導基因啟動子中a/GCCGAC的核心基序, 以調(diào)節(jié)基因表達, 并對植物激素如乙烯、ABA等作出反應[13-14]。Nakano等[15]對擬南芥進行全基因組分析, 鑒定出147個AP2/ERF轉錄因子, 其中, AP2亞家族基因18個, DREB與ERF亞家族基因122個, RAV亞家族基因6個。異源表達擬南芥表現(xiàn)出更高的鹽脅迫耐受性, 該基因參與ABA信號轉導、促使脯氨酸生物合成和活性氧清除基因的表達增強; 在棉花中, 沉默導致棉花對鹽脅迫的敏感性增強[16]。Tang等[17]發(fā)現(xiàn)在擬南芥中異源表達增強了擬南芥對鹽和寒冷的耐受性。Xie等[18]發(fā)現(xiàn)油菜素類固醇信號負調(diào)控擬南芥AP2/ERF轉錄因子基因, 通過激活干旱反應基因和促進脫落酸介導的氣孔關閉正調(diào)控干旱響應。大豆基因和受到鹽、干旱和茉莉酸等多種脅迫處理的誘導, 異源表達或轉基因煙草也表現(xiàn)出對鹽脅迫更高的耐受性[19-20]。在水稻中, 異源表達增加了其對鹽脅迫的敏感性[21]?？梢哉{(diào)控干旱響應基因表達, 過表達顯著提高水稻的耐旱性, 并具有更高的光合效率[22]。枸橘和是2個受冷脅迫誘導的AP2/ERF家族轉錄因子, 對抵御冷脅迫具有重要調(diào)控作用[23]。玉米(L)作為單子葉植物功能基因組學研究的重要模式植物之一, 對植物分子生物學的研究具有重要意義。然而,基因在玉米響應非生物脅迫中的分子機制研究仍十分有限。在玉米中, Zhang等[24]對基因進行了全面的分析, 包括它們的系統(tǒng)發(fā)育關系、基因結構、保守基序、順式元件、染色體分布、基因復制、進化機制和可能的調(diào)控網(wǎng)絡分析, 為進一步探究基因在玉米生長發(fā)育和適應非生物脅迫中的功能和調(diào)控機制奠定了基礎。Hao等[25]研究發(fā)現(xiàn)基因啟動子區(qū)含有與植物生長發(fā)育、激素和非生物脅迫相關的元件, 可能參與植物發(fā)育以及對鹽和干旱脅迫的響應。Wang等[26]發(fā)現(xiàn)過表達能夠顯著增加葉綠素含量和抗氧化酶活性, 并調(diào)節(jié)激素信號和脅迫應答基因的表達, 從而增強玉米幼苗的耐旱性。綜上,基因家族陸續(xù)在棉花、擬南芥、大豆、水稻、柑橘等植物中被報道出來, 但在玉米中開展功能研究的還比較少。實驗室前期通過轉錄組測序(RNA-seq)鑒定了玉米根系生長發(fā)育的關鍵調(diào)控基因, 我們對玉米生長發(fā)育過程中的4個關鍵時期(六葉期(V6)、十二葉期(V12)、抽雄期(VT)和乳熟期(R3))進行了根系表型鑒定和轉錄組測序分析, 篩選到26個在相鄰時期間均顯著差異表達的轉錄因子基因[27], 其中包含一個AP2/ERF家族成員基因。為了驗證該基因對玉米根系生長發(fā)育的調(diào)控機制及是否參與對非生物逆境脅迫的響應, 本研究克隆了玉米基因, 研究了該基因的表達模式, 以及在干旱、高鹽、脫水、低溫等逆境脅迫下的表達情況, 將該基因在擬南芥中進行異源表達, 利用轉基因擬南芥株系進行相關抗逆研究, 旨在深入了解AP2/ERF蛋白家族的生理功能, 為玉米抗逆遺傳改良和新種質(zhì)創(chuàng)制提供新思路和新的基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

玉米自交系B73 (本實驗室保存及繁種); 野生型擬南芥(Col-0); 大腸桿菌Trans1 T1購自北京全式金生物技術有限公司; 農(nóng)桿菌GV3101購于北京酷萊博科技有限公司; RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒購于北京擎科生物技術有限公司; 過氧化物酶活性檢測試劑盒、葉綠素含量檢測試劑盒等購于北京索萊寶科技有限公司; 限制性內(nèi)切酶等購自北京百靈克生物科技有限責任公司; 2×Phanta Max Master Mix等高保真酶購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 植物種植與脅迫處理

將B73玉米種子播種于大田, 待成苗后, 分別取三葉一心時期的幼葉、幼根, 抽雄期的根、莖、葉、雄穗與花絲, 授粉1周后的幼胚, 用于組織差異表達分析。對于逆境脅迫處理, 挑選飽滿的自交系B73種子進行發(fā)芽, 出苗后挑選長勢一致的玉米幼苗移入水培桶中。分別設置對照組、滲透處理組、高鹽處理組、脫水處理組和冷處理組, 每組設置6個水培桶, 每桶放置3株玉米幼苗, 各設3個生物學重復。B73幼苗正常生長至三葉一心時期分別進行滲透(0.2 mol L–1甘露醇)、高鹽(0.2 mol L–1NaCl)、脫水(玉米幼苗整株取出, 吸水紙擦干表面水分, 室溫放置, 自然脫水)、冷(4℃)處理。分別取各處理0、1、2、5、10和24 h的地上部和根, 液氮速凍后置于–80℃凍存。對于激素脅迫處理, 將B73玉米種子播種于花盆中, 對照組與激素處理組每組各設3盆, 每盆播種20粒。觀察玉米幼苗生長至三葉一心時期, 分別噴灑0.1 mmol L–1濃度的茉莉酸(jasmonic acid, JA)、脫落酸(abscisic acid, ABA)、赤霉素(gibberellins, GA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D)溶液, 使溶液均勻覆蓋整個玉米幼苗后包裹保鮮膜, 分別取各處理的0、1、3、5和10 h后的葉片, 液氮速凍后置于–80℃凍存。

1.3 玉米總RNA提取及ZmEREB211基因克隆

按照植物總RNA提取試劑盒說明提取玉米根組織的總RNA, 逆轉錄得到cDNA。設計引物pZmEREB211-F和pZmEREB211-R, 以cDNA為模板進行PCR擴增, 用2×Phanta Max Master Mix高保真酶進行擴增, 反應程序為: 95℃預變性3 min; 95℃變性15 s, 60℃退火15 s, 72℃延伸30 s, 35個循環(huán); 72℃終延伸5 min, 獲得全長。

1.4 ZmEREB211生物信息學分析

通過ProtParam工具(http://web.expasy.org/ protparam/)分析編碼氨基酸的數(shù)目, 蛋白相對分子量、等電點等理化性質(zhì); 應用SPOMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)預測蛋白質(zhì)二級結構; 應用SWISS-MODEL (https://www.swissmodel.expasy. org/)預測其空間結構; 應用TMHMM2.0 (http://www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)對氨基酸序列進行跨膜分析; 通過NCBI CDD (https://www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html)分析該基因的保守結構域。使用PlantCARE (http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)網(wǎng)站進行啟動子區(qū)順式作用元件分析。

表1 本實驗中所用的引物

1.5 ZmEREB211基因的表達模式分析

按照植物總RNA提取試劑盒說明提取玉米葉片RNA, 逆轉錄后得到的cDNA。以cDNA作為模板進行實時熒光定量PCR (qPCR)分析。設計特異引物pZmEREB211RT-F、pZmEREB211RT-R及內(nèi)參基因特異引物pGAPDHRT-F、pGAPDHRT-R用于組織差異表達、脅迫處理下基因的表達量分析; 使用BIO-RAD CFX96 Real-Time System qPCR儀進行實時熒光擴增。每組實驗設3個生物學樣本, 每個生物學樣本各設3個技術重復, 數(shù)據(jù)為3個生物學重復平均值±標準誤。應用2–??Ct方法分析基因的表達模式。組織特異性表達分析以花絲中表達量記為1。逆境處理表達量分析以對照(0 h)在地上部和根中的表達量計為1。

1.6 植物異源表達載體pYBA1132: ZmEREB211的構建及擬南芥遺傳轉化

1.6.1 異源表達載體構建 參照王莉等[28]的方法構建異源表達載體, 設計引物pZmEREB211-F、pZmEREB211-R擴增獲得基因的編碼區(qū)片段。擴增產(chǎn)物回收后無縫克隆至pYBA1132- bar-EGFP表達載體中獲得重組質(zhì)粒, 將重組質(zhì)粒轉化大腸桿菌后, 挑取陽性單克隆提質(zhì)粒后進行酶切驗證, 酶切正確的質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序正確的質(zhì)粒轉入農(nóng)桿菌菌株GV3101中, 挑取單克隆進行菌液PCR鑒定。

1.6.2 擬南芥遺傳轉化 培養(yǎng)含有pYBA1132: ZmEREB211重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株, 利用浸花法[29]侵染擬南芥花序。收取擬南芥種子, 干燥后置于4℃春化備用。將種子撒播于基質(zhì)中, 噴施濃度為0.5‰的草銨膦篩選后獲得T1代轉基因擬南芥單株。提取T1代株系葉片基因組DNA為模板, 利用引物pZmEREB211-F、pZmEREB211-R進行PCR檢測, 對轉基因擬南芥株系進行單株收種并加代直至獲得T4代純合植株。

1.7 轉基因擬南芥株系的表型分析

1.7.1 轉基因擬南芥在1/2 MS培養(yǎng)基中不同逆境和激素處理的表型分析 將野生型和轉基因擬南芥種子用0.3% NaClO (有效氯)消毒10 min后, 點播于1/2 MS培養(yǎng)基上, 豎直放置于擬南芥溫室中培養(yǎng)7 d, 挑選根長和生長狀態(tài)一致的野生型和轉基因擬南芥幼苗, 分別移栽到含不同濃度NaCl、甘露醇、JA和ABA的1/2 MS固體培養(yǎng)基上[30]。NaCl濃度梯度為0、0.10、0.15和0.18 mol L–1; 甘露醇濃度梯度為0、0.15、0.20和0.30 mol L–1; JA濃度梯度為0、50、75和100 μmol L–1; ABA濃度梯度為0、10、25和50 μmol L–1 [31]。野生型和轉基因擬南芥各5株, 各設置3個生物學重復, 豎直放置于擬南芥溫室中培養(yǎng), 7 d后拍照并用ImageJ軟件統(tǒng)計根長。

1.7.2 土壤中轉基因擬南芥植株的表型分析及生理指標的測定 選取1/2 MS培養(yǎng)基上生長8～10 d且生長狀態(tài)一致的轉基因擬南芥及野生型對照植株移栽至土壤中, 分別設置對照組、干旱組、鹽處理組, 每組4盒, 每盒移植4株幼苗, 各組設3個生物學重復、3個技術重復。幼苗在品氏基質(zhì)(PINDSTRUP)中生長3周后, 對照組進行正常澆水處理; 對干旱組進行自然干旱處理4周后和覆水處理24 h后分別觀察表型及取樣; 對鹽處理組澆灌300 mmol L–1NaCl進行脅迫處理1周后觀察表型并統(tǒng)計綠葉率。表型觀察后, 根據(jù)試劑盒說明書測定植株的過氧化物酶活性和葉綠素含量。

2 結果與分析

2.1 ZmEREB211基因序列及其生物信息學分析

基因僅含有一個外顯子, 編碼序列全長為792 bp, 編碼263個氨基酸。通過保守結構域分析發(fā)現(xiàn), 該基因含有AP2家族所特有的保守結構域(圖1-A)。生物信息學分析表明其蛋白分子量為27.9 kD, 理論等電點為6.01。二級結構分析表明,中不規(guī)則卷曲所占比例最大為52.85%, 其次是α螺旋35.74%, 應用TMHMM2.0分析發(fā)現(xiàn)該蛋白不具跨膜結構(圖1-B)?？臻g結構預測結果如圖1-C所示。對基因啟動子上游2 kb序列進行在線分析, 發(fā)現(xiàn)該序列含有與生長發(fā)育、激素響應、光反應等功能相關的順式作用元件MSA-like、GCN4-motif、ABRE、AuxRR-core、TGACC-motif、G-box等(圖1-D)。

2.2 ZmEREB211在玉米中的組織差異表達分析

分別提取玉米三葉期的幼根、幼葉, 抽雄期根、莖、葉、雄穗與花絲以及授粉1周后的幼胚等組織的總RNA, 逆轉錄獲得cDNA后進行qPCR分析。結果如圖2所示,在玉米不同組織中的表達量存在較大的差異, 將抽雄期花絲中的表達量記為1,在玉米幼根中的表達量最高, 約為抽雄期花絲中表達量的7.2倍; 其次是抽雄期的根和莖, 分別為5.7倍和1.4倍; 其他組織的表達量均低于花絲, 雄穗和幼胚中的表達量最低。結果表明基因主要在玉米根系中表達, 且在幼根中的表達量最高, 推測該基因可能參與調(diào)控玉米根系生長發(fā)育。

2.3 逆境脅迫下ZmEREB211基因的表達分析

以脅迫處理0 h后的表達量記為1。在脫水處理下,在地上部的表達量下調(diào), 直至處理24 h后的表達量上調(diào), 約為對照的3.3倍; 其在根中的表達量迅速下調(diào), 且一直處于受抑制狀態(tài)(圖3-A)。在鹽處理下,在地上部的表達量下調(diào); 在鹽處理2 h后,在地上部的表達量上調(diào), 約為對照的1.5倍, 隨后下調(diào), 直至處理24 h后, 在地上部的表達量上調(diào)至最大, 約為對照的36.8倍;在根中的表達量一直處于下調(diào)狀態(tài)(圖3-B)。在甘露醇處理下,在地上部的表達量呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)又下調(diào)的變化趨勢, 其中處理5 h后,在地上部的表達量達到最高, 約為對照的19.0倍; 在根中表達量下調(diào), 隨后上調(diào), 在甘露醇處理5 h后上調(diào)至最大, 約為對照的0.8倍(圖3-C)。在4℃冷處理下,在地上部的表達量下調(diào), 在處理24 h后,在地上部的表達量上調(diào), 約為對照的2.2倍; 在根中的表達量呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)又下調(diào)的變化趨勢(圖3-D)。由此推測可能參與響應脫水、高鹽、滲透以及低溫等脅迫。

圖1 ZmEREB211生物信息學分析

A: 保守結構域分析; B: 跨膜結構預測; C: 蛋白空間結構預測; D: 啟動子區(qū)順式作用元件分析。

A: the conserved domain analysis; B: the transmembrane structure prediction; C: protein tertiary structure prediction; D: the analysis of cis-acting elements in promoter region.

圖2 ZmEREB211在玉米不同組織中的相對表達量

不同小寫字母表示差異顯著(< 0.05)。

Different lowercase letters are significantly different at the 0.05 probability level.

圖3 ZmEREB211在不同非生物脅迫下的相對表達量

A～D:分別在脫水、高鹽、滲透、低溫處理后的表達量。

A–D: the relative expression level ofgenes after dehydration, high salt, osmotic, and low temperature treatments.

2.4 ZmEREB211基因在激素脅迫處理條件下的表達分析

如圖4所示, 將0 h的表達量記為1, 在4種不同激素的處理條件下,的表達量呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。在JA處理1 h后的表達量下調(diào), 隨后在處理3 h后上調(diào)并達到最高, 約為對照的5.5倍。在ABA處理1 h后的表達量上調(diào), 約為對照的2.3倍,隨后一直下調(diào), 至處理10 h后表達量僅為對照的0.03倍。在2,4-D處理1～5 h后,的表達量不斷下降, 在處理10 h后上調(diào), 約為對照的4.8倍。在GA處理下,先呈現(xiàn)連續(xù)上調(diào)表達趨勢, 直至處理3 h后表達量最高, 約為對照的8.9倍, 隨后下調(diào)。上述結果表明,的表達均不同程度地受到激素脅迫的影響。推測可能參與JA、ABA、2,4-D和GA等激素的誘導響應。

圖4 ZmEREB211在玉米不同激素處理中的相對表達量

*:< 0.05; **:< 0.01.

2.5 轉基因擬南芥株系PCR和qPCR檢測

提取草銨膦抗性植株葉片DNA進行PCR檢測, 結果如圖5-A所示, 有6個轉基因擬南芥株系含有目的基因, 依次編號為L-1、L-2、L-3、L-4、L-5和L-6, 陰性對照和野生型均無目的條帶。對6個株系進行qPCR檢測, 結果如圖5-B所示, 發(fā)現(xiàn)L-3、L-4、L-5株系的表達量較高, 后續(xù)的抗逆性分析選用這3個株系進行。

2.6 轉ZmEREB211基因擬南芥株系在1/2 MS培養(yǎng)基上脅迫處理分析

2.6.1 轉基因擬南芥株系的耐鹽脅迫分析 在0 mol L–1NaCl濃度下, 野生型和轉基因擬南芥均能正常生長, 主根長度無明顯差異。在0.1 mol L–1NaCl濃度下, 野生型和轉基因擬南芥均能正常生長, 其中有2個轉基因株系的根長長于野生型擬南芥的根長(圖6-E)。在0.15 mol L–1NaCl濃度下, 與野生型擬南芥相比, 3個轉基因擬南芥株系均表現(xiàn)出更高的耐受性, 主根更長, 且差異顯著(<0.05) (圖6-E)。在0.18 mol L–1NaCl濃度下, 野生型和轉基因擬南芥均不能正常生長, 植株萎蔫, 葉片發(fā)黃, 主根不生長。由此推測基因對一定濃度的鹽脅迫起到重要的耐受調(diào)控作用。

圖5 T4代擬南芥PCR檢測和qPCR檢測

A: T4代轉基因擬南芥PCR檢測; B: T4代轉基因擬南芥qPCR檢測。M: DL2000 marker; N: 陰性對照; W: 水對照; WT: 野生型擬南芥; L-1～L-6: T4代轉基因擬南芥株系; *:< 0.05; **:< 0.01。

A: PCR detection of T4generation; B: qPCR detection of T4generation; M: DL2000 marker; N: negative control; W: water control; WT: wild-type; L-1–L-6: T4 transgeniclines; *:< 0.05; **:< 0.01.

圖6 不同鹽濃度下轉基因擬南芥株系根長比較

A～D分別為0、0.1、0.15和0.18 mol L–1鹽處理的生長情況; E: 不同鹽濃度下擬南芥株系平均主根長度; WT: 野生型擬南芥; L-3、L-4、L-5: 轉擬南芥株系; 標尺為1.5 cm; *:< 0.05; **:< 0.01。

A–D indicate the seedling growth under the NaCl concentrations of 0, 0.1, 0.15, and 0.18 mol L–1, respectively. E: the average main root length ofunder different salt concentrations; WT: wild type; L-3, L-4, and L-5:transgeniclines; Bar: 1.5 cm; *:< 0.05; **:< 0.01.

2.6.2 轉基因擬南芥株系的耐滲透脅迫分析 在0 mol L–1甘露醇濃度下, 野生型和轉基因擬南芥植株均能正常生長, 主根長度無明顯差異。在0.15 mol L–1甘露醇濃度下, 野生型和轉基因擬南芥均能正常生長, 轉基因擬南芥與野生型擬南芥的主根長無顯著差異(圖7-E)。在0.2 mol L–1甘露醇濃度下, 轉基因擬南芥的根長比野生型擬南芥長, 且其中2個轉基因株系的根長較對照的根長差異呈極顯著水平(<0.01) (圖7-E)。在0.3 mol L–1甘露醇濃度下, 擬南芥葉片出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象, 但轉基因擬南芥株系均比野生型生長狀態(tài)更好, 主根長無顯著差異(圖7-E)。推測基因可能參與滲透脅迫響應。

2.6.3 轉基因擬南芥株系在JA和ABA處理下的分析 在0 mol L–1JA濃度下, 野生型和轉基因擬南芥均能正常生長, 主根長度無明顯差異。在50 μmol L–1和75 μmol L–1JA濃度下, 野生型和轉基因擬南芥均生長遲緩, 側根數(shù)減少, 野生型和轉基因擬南芥主根長無明顯差別。在100 μmol L–1JA濃度下, 野生型擬南芥株系的生長受到進一步的抑制, 轉基因擬南芥與野生型擬南芥主根長度有明顯差異, 其中, L-3株系的根長較對照差異呈顯著水平(<0.05), L-4、L-5株系的根長較對照差異均呈極顯著水平(<0.01) (圖8-B)。推測基因對較高濃度的JA激素具有一定的耐受性, 可能參與JA信號轉導途徑。

圖7 不同甘露醇濃度下轉基因擬南芥株系根長比較

A～D 分別為0、0.15、0.2和0.3 mol L–1甘露醇處理的生長情況; E: 不同甘露醇濃度下擬南芥株系平均主根長度?？s寫同圖6; 標尺為1.5 cm; *:< 0.05; **:< 0.01。

A–D indicate the seedling growth under the mannitol concentrations of 0, 0.15, 0.2, and 0.3 mol L–1, respectively. E: the average main root length ofunder different mannitol concentrations. Abbreviations are the same as those given in Fig. 6; Bar: 1.5 cm; *:< 0.05; **:< 0.01.

在0 mol L–1ABA濃度下, 野生型和轉基因擬南芥均能正常生長, 主根長度無明顯差異。在10 μmol L–1ABA濃度下, 野生型和轉基因擬南芥葉片均呈黃色, 野生型和轉基因擬南芥株系主根長度無明顯差別。在25 μmol L–1和50 μmol L–1ABA濃度下, 野生型和轉基因擬南芥葉片均呈黃色, 轉基因擬南芥株系主根長度較野生型短, 且L-3和L-4株系的根長較對照根長差異均為極顯著水平(<0.01) (圖8-D)。推測基因的表達受ABA激素的調(diào)控, 且表現(xiàn)為負向調(diào)控作用。

2.7 轉ZmEREB211擬南芥株系在土壤中的抗逆性分析

2.7.1 轉擬南芥株系在土壤中的耐旱性分析 如圖9-A所示, 在正常培養(yǎng)條件下, 野生型和轉基因擬南芥株系均生長良好, 無明顯表型差異。經(jīng)過干旱處理4周后, 野生型和轉基因擬南芥均出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象, 但野生型擬南芥葉片萎蔫失水程度比轉基因擬南芥更加嚴重, 另外轉基因擬南芥的綠葉率(圖9-B)、過氧化物酶活性(圖9-D)和葉綠素含量(圖9-E)均顯著高于野生型擬南芥。干旱處理實驗組擬南芥進行復水處理24 h后, 野生型擬南芥未恢復綠葉狀態(tài), 復水前后轉基因擬南芥株系的綠葉率(圖9-B, C)均顯著高于野生型擬南芥株系。推測可能通過調(diào)節(jié)過氧化物酶活性響應干旱脅迫。

圖8 不同JA和ABA濃度下轉基因擬南芥株系根長比較

A: 0、50、75和100 μmol L–1JA處理下的生長情況; B: 不同JA濃度下擬南芥株系平均主根長度; C: 0、10、25和50 μmol L–1ABA處理下的生長情況; D: 不同ABA濃度下擬南芥株系平均主根長度?？s寫同圖6; 標尺為1.5 cm; *:< 0.05; **:< 0.01。

A: growth under 0, 50, 75, and 100 μmol L–1JA treatment; B: the average main root length ofunder different JA concentrations; C: growth under 0, 10, 25, and 50 μmol L–1ABA treatment; D: the average main root length ofunder different ABA concentrations. Abbreviations are the same as those given in Fig. 6; Bar: 1.5 cm; *:< 0.05; **:< 0.01.

圖9 土壤中干旱處理下擬南芥株系表型分析

A: 擬南芥表型; B: 干旱處理后綠葉率; C: 復水處理后綠葉率; D: POD活性的測定; E: 葉綠素含量測定?？s寫同圖6; *:< 0.05; **:< 0.01。

A: the phenotype of; B: the rate of green leaves after drought treatment; C: the rate of green leaves after re-water treatment; D: the determination of POD activity; E: the determination of chlorophyll content. Abbreviations are the same as those given in Fig. 6; *:< 0.05; **:< 0.01.

2.7.2 轉擬南芥株系在土壤中的耐鹽性分析 如圖10-A所示, 在正常培養(yǎng)條件下, 野生型和轉基因擬南芥株系生長良好, 無明顯表型差異。經(jīng)過300 mmol L–1NaCl處理7 d后, 野生型擬南芥葉片嚴重萎蔫發(fā)黃, 而轉基因擬南芥含有更多的綠葉(圖10-B), 表現(xiàn)出更健康的生長狀態(tài)。另外, 轉基因擬南芥的過氧化物酶活性(圖10-C)和葉綠素含量(圖10-D)均顯著高于野生型擬南芥。推測可能通過調(diào)節(jié)過氧化物酶活性響應鹽脅迫。

3 討論

干旱、高鹽等非生物逆境脅迫嚴重影響植物的生長發(fā)育和生產(chǎn)力, AP2/ERF家族是植物界中最大的轉錄因子家族之一, 在植物響應各種生物和非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用[32]。本研究克隆了基因, 具有AP2/ERF轉錄因子家族所特有的保守結構域。目前, 其它植物中有許多AP2/ERF家族響應逆境脅迫的報道, 在擬南芥中異源表達羊草可以提高轉基因擬南芥的抗旱和抗鹽能力[33]。在乙烯和高鹽誘導下, 異源表達火龍果基因的擬南芥植株對鹽脅迫的耐受性顯著增強, 同時也表明參與調(diào)控乙烯介導的鹽脅迫耐受過程[34]。這些研究表明, 不同物種中的AP2/ERF轉錄因子對不同逆境的響應存在差異。在玉米不同時期不同組織中表達量不同, 在根中的表達量最高, 且在幼根中的表達量比成熟根中的表達量更高, 說明該基因可能參與調(diào)控玉米根系生長發(fā)育。有研究表明在擬南芥中的同源基因()通過介導JA信號轉導和生長素生物合成, 調(diào)控擬南芥?zhèn)雀纬蒣35]。為了進一步探索該基因在響應玉米非生物脅迫中的作用, 我們對轉基因擬南芥株系進行了抗逆分析, 發(fā)現(xiàn)在分別含有0.1 mol L–1NaCl和0.2 mol L–1甘露醇的1/2 MS培養(yǎng)基中, 轉基因擬南芥根長長于野生型, 且差異顯著(<0.05)。土壤中生長的轉基因擬南芥, 在干旱和含有300 mmol L–1NaCl的高鹽處理下, 較野生型擬南芥生長狀態(tài)更好, 綠葉率更高且差異顯著(<0.05)。在這2種脅迫處理條件下, 轉基因擬南芥株系具有更高的POD活性, 進一步說明在滲透、高鹽和干旱脅迫中可能是一個積極的脅迫響應因子。基因起始密碼子上游2 kb區(qū)域內(nèi)具有與JA激素相關的順式作用元件, 并且在含有100 μmol L–1JA的1/2 MS培養(yǎng)基上, 轉基因擬南芥比野生型擬南芥的根更長, 說明基因響應JA處理, 可能參與JA信號轉導。由此我們推測,基因可能是通過JA信號通路來參與干旱和鹽的脅迫應答。

圖10 土壤中高鹽處理下擬南芥株系表型分析

A: 擬南芥表型; B: 高鹽處理后綠葉率; C: POD活性的測定; D: 葉綠素含量的測定?？s寫同圖6; *:< 0.05; **:< 0.01。

A: the phenotype of; B: the rate of green leaves after high salt treatment; C: the determination of POD activity; D: the determination of chlorophyll content. Abbreviations are the same as those given in Fig. 6; *:< 0.05; **:< 0.01.

4 結論

本研究克隆了基因, 對其進行了生物信息學分析、組織差異表達分析和轉基因擬南芥株系表型鑒定及分析?；蚓幋aAP2/ERF家族轉錄因子, 該基因在玉米多個組織器官中均有表達, 但主要在根系中表達, 且在幼根中表達量最高, 受脫水、高鹽、甘露醇、冷脅迫處理以及JA、ABA等激素脅迫的誘導表達。轉基因擬南芥在高鹽、滲透和JA處理下的生長狀態(tài)比野生型擬南芥更好; 在干旱和高鹽處理下, 土壤中生長的轉基因植株相較于對照表現(xiàn)出更強的耐受性, 且POD活性和葉綠素含量均顯著升高。由此表明，對玉米根系生長發(fā)育可能具有顯著的調(diào)控作用, 在應對高鹽、干旱、滲透脅迫以及激素處理等過程中起到積極的響應作用。本研究初步解析了基因的生物學功能, 為進一步探究其在玉米中的生物學功能奠定了基礎, 同時為今后挖掘和利用該類轉錄因子提供了重要參考。

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Response of maize transcriptional factorto abiotic stress

AI Rong1,2,**, ZHANG Chun2,**, YUE Man-Fang2, ZOU Hua-Wen1,*, and WU Zhong-Yi2,*

1College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei, China;2Institute of Biotechnology, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing Key Laboratory of Agricultural Gene Resources and Biotechnology, Beijing 100097, China

AP2/ERF (APETALA2/ethylene-responsive factor) transcription factor is one of the largest transcription factor families in plants, which plays an important role in regulating plant growth and development and responding to various stresses. Exploring the function of AP2/ERF family genes in maize (L) will provide the important genetic resources for the creation of new maize germplasm. In this study,(Gene ID: 103647485) gene was cloned and its basic characteristics, tissue expression characteristics, and the relative expression patterns in response to stress were analyzed by bioinformatics and qRT-PCR. The transgeniclines were subjected to corresponding stress treatment and phenotypic identification. The results showed that the gene contained only one exon and the full-length cDNA was 792 bp which encoding 263 amino acids. The ZmEREB211 protein had a molecular weight of 27.9 kD and a theoretical isoelectric point of 6.01. It had a conserved domain unique to the AP2/ERF family. The relative expression level ofgene was the highest in maize root system and the relative expression level in young roots was higher than mature roots. At the same time, the gene had different degrees of induced expression under dehydration, high salt, drought, and low temperature treatment conditions. On 1/2 MS medium containing different concentrations of NaCl, mannitol, and jasmonic acid (JA), root length oftransgeniclines was significantly longer than wild type. Under drought and high salt treatments, transgeniclines had stronger tolerance than wild type, and the number of green leaves at seedling stage was significantly higher than wild type and the peroxidase (POD) activity and chlorophyll content were significantly higher than wild type.may be involved in the regulation of root growth and development in maize, and can play a positive regulatory role in high salt, drought, osmotic stress, and JA hormone treatments. This study provides an important reference for further analysis of the biological function ofin maize.

maize;; transcription factor; heterologous expression; root system; adversity stress

2022-10-21;

2023-02-21;

2023-03-01.

10.3724/SP.J.1006.2023.23071

通信作者(Corresponding authors): 鄒華文, E-mail: zouhuawen@yangtzeu.edu.cn; 吳忠義, E-mail: zwu22@126.com

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

艾蓉, E-mail: airong202203@163.com; 張春, E-mail: spring2007318@163.com

本研究由國家自然科學基金項目(32001430, 32171952, 31971839)和北京市農(nóng)林科學院科技創(chuàng)新能力建設專項(KJCX20220402)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32001430, 32171952, 31971839) and the Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences (KJCX20220402).

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail//11.1809.S.20230228.1533.008.html

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