胡艷娟 薛 丹 耿 嫡 朱 末 王天穹 王曉雪

水稻基因突變效應及其基因組變異分析

胡艷娟 薛 丹 耿 嫡 朱 末 王天穹 王曉雪*

沈陽農業(yè)大學水稻研究所, 遼寧沈陽 110866

開花期(又叫抽穗期)影響水稻的產量、品質和地區(qū)適應性。在擬南芥中, Cycling DOF Factor 1 (CDF1)蛋白質是()的轉錄抑制因子, 負向調節(jié)擬南芥的開花期。但是, 水稻中的同源蛋白OsCDF1的功能尚不完全清楚。為了揭示OsCDF1在水稻中的生物學功能及其對開花期的影響, 本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術設計定向敲除水稻基因的2個靶位點, 構建基因的敲除載體; 通過農桿菌介導的方法分別轉化北方粳稻品種沈農9816, 創(chuàng)制基因的突變體; 分析沈農9816和突變體在田間種植下的開花期和產量性狀的差異。主要研究結果為: 創(chuàng)制了在第1個外顯子的第16 bp處缺失5個堿基和在第2個外顯子的338 bp處單堿基A插入的純合突變。序列比對分析表明, 這2種類型的突變均造成移碼和蛋白翻譯提前終止。在自然長日照條件下,突變體的開花期比野生型沈農9816晚4 d以上, 其產量高于野生型。對單倍型和單倍型網絡分析發(fā)現,在不同品種中進化出高度多樣性。本研究成功利用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除了水稻基因, 為進一步研究基因功能提供了理論參考, 也為水稻遺傳改良提供了潛在的基因和種質資源。

水稻; CRISPR/Cas9; OsCDF1; 開花期; 產量相關性狀; 單倍型

作為我國第一口糧作物, 水稻()在我國總產已經連續(xù)11年穩(wěn)定在2億噸以上。盡管當前稻谷產需形勢較好, 但人口的不斷增加和可耕地面積的減少, 提高水稻產量仍然是農業(yè)生產面臨的挑戰(zhàn)[1]。開花是水稻從營養(yǎng)生長向生殖生長的重要轉換點, 開花期是水稻分子育種的生物學基礎之一, 是決定品種地區(qū)與季節(jié)適應性的重要農藝性狀。水稻在開花之前分蘗旺盛, 生長迅速, 為開花后的生殖生長提供強有力的基礎[2]。水稻品種如果過早開花, 營養(yǎng)生長量小, 不能充分利用光照和溫度資源, 形成產量的物質基礎不足, 從而導致產量降低; 相反, 如果水稻品種過晚開花, 在適宜的生長季節(jié)內不能完成開花和籽粒的發(fā)育, 也會導致產量降低。因此, 水稻開花期與其產量密切相關。隨著現代分子生物學技術的發(fā)展, 利用正向和反向遺傳學相結合的方法, 一些與水稻開花期相關的基因被定位和克隆[3-4]。

開花期由許多環(huán)境因素共同決定的, 光周期是其中最主要的一個因素。光周期調控植物開花期途徑包括光受體、生物鐘和成花基因(floral integrator genes)[5-8]。擬南芥()是雙子葉植物的模式系統(tǒng), 是典型的低溫長日照植物。擬南芥中成花素基因()促進開花[9-10]。在長日照條件下, 轉錄因子CONSTANS (CO)誘導的表達, 從而促進開花[11]。CO含有2種鋅指結構域, 一個位于N端介導蛋白互作, 另一個是位于C端的CCT (constans, constsans-like, and timing of cab expression 1)結構域[12]。生物鐘相關蛋白質GIGANTEA (GI)能夠調控的表達, 影響擬南芥開花[13]。()和在相同組織器官中表達, CDF1能夠與FLAVIN- BINDING, KELCH REPEAT, F-BOX 1 (FKF1)形成復合體結合到的啟動子區(qū), 抑制轉錄[14-16]。此外, 轉錄因子CDF1是和表達時間的關鍵調節(jié)因子。在擬南芥開花期的上午, TOPLESS (TPL)蛋白能夠與CDF1蛋白含有的non-EAR基序保守結構域結合形成CDF-TPL轉錄復合體, 抑制和的表達[17]。FKF1屬于F-box蛋白家族, 可以直接與靶蛋白CDF1相互作用, 通過多泛素化介導的26S蛋白酶體降解CDF1, 提高和的表達, 是開花期的正向調節(jié)因子。因此,突變延遲開花[18]。

水稻是典型的短日照作物, 與擬南芥相比, 水稻調控開花期通路尚不完善。在水稻中,()是第1個被克隆的與開花期相關的基因,是擬南芥的同源基因[19-20]。水稻Heading date 3a (Hd3a)和RICE FLOWERING LOCUS T 1 (RFT1)都是擬南芥FT的同源蛋白, 與擬南芥中通路類似, OsGI通過影響來調控成花素的表達, 最終影響開花[8,19]。與擬南芥不同的是, Early heading date 1 (Ehd1)促進和的表達是水稻特有的開花期相關的一條途徑[21]。OsCDF1是擬南芥CDF1在水稻中的同源蛋白。在長日照條件下,的超表達植株提前開花, 并且改變了水稻的株型, 例如株高變矮、葉夾角變小、一次枝梗數和二次枝梗數降低[22-23]。但是,突變對水稻開花期和產量的影響尚不完全清楚。

CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)作為目前有效的基因編輯系統(tǒng), 在作物性狀改良及培育新品種上有廣闊的應用前景[24]。本研究利用沈農9816 (Shen nong 9816, SN9816)為背景材料, 通過CRISPR/Cas9基因組編輯技術定點敲除在水稻中的同源基因, 獲得了突變體。以T3代分離出的非轉基因純合突變體和為試驗材料, 對SN9816和突變體的開花期及產量相關性狀進行了調查和分析。并對基因組的遺傳變異和單倍型進行分析, 為進一步研究基因的功能, 利用創(chuàng)制新的種質資源提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2018—2021年在沈陽農業(yè)大學農學院進行, 選用沈陽農業(yè)大學水稻研究所培育的SN9816粳稻品種為試驗材料。沈農9816是沈陽農業(yè)大學水稻所1998年以江西絲苗為母本, 以遼粳454為父本人工去雄雜交, 再以遼粳454為輪回親本回交系選育而成。大腸桿菌() TOP10和農桿菌() EHA105菌株感受態(tài)細胞由沈陽農業(yè)大學農學院水稻研究所實驗室自制。pRGEB32載體由華中農業(yè)大學謝卡斌老師提供[25]。限制性內切酶I和T4DNA連接酶購自NEB (北京)有限公司; 瓊脂糖凝膠回收試劑盒等從天根生化科技(北京)有限公司訂購; 引物合成及測序由華大基因科技(北京)有限公司完成。

1.2 基因編輯載體的構建

通過日本RAP-DB網站(http://rapdb.dna.affrc.go. jp/)獲得(Os03g0169600, LOC_Os03g07360) 基因的基因組DNA序列, 利用德國癌癥研究中心的E-CRISP Design (www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr)設計guide RNA (gRNA)引物。利用日本RAP-DB網站BLAST檢驗引物特異性。在正向引物5′端加上黏性末端GGCA, 在反向引物5′端加上黏性末端AAAC。引物雙鏈化后與經I酶切后的pRGEB32載體連接。用pRGEB32載體上I酶切位點的側翼序列設計的正/反向引物gRF/R擴增片段, 測序無誤后將連接好的載體通過液氮凍融法轉入農桿菌。提取農桿菌質粒, 反轉到大腸桿菌感受態(tài)中, 再次測序無誤后, 載體構建完成。所用引物見表1。

表1 引物及序列信息

1.3 編輯株系的突變位點檢測

利用農桿菌介導的水稻成熟胚遺傳轉化法將構建好的載體轉入SN9816愈傷組織中[26-27]。提取T1代植株幼苗葉片DNA作為模板, 通過轉基因植株的潮霉素篩選標記(hygromycin, Hyg)引物, PCR擴增Hyg元件, 可以擴增出Hyg元件的植株, 即為T1代陽性植株。然后用gRNA的側翼序列設計突變位點檢測引物。用突變位點檢測引物擴增, 測序分析PCR產物, 檢測編輯位點是否發(fā)生突變。將發(fā)生突變的植株種植到T2代, 提取植株幼苗葉片DNA, 通過PCR擴增Hyg元件, 不能擴增出Hyg元件的植株, 即為Transfer-DNA (T-DNA)分離的基因編輯植株。所用引物見表1。

1.4 生物信息學分析

利用MEGA-X軟件對SN9816和突變體進行OsCDF1蛋白序列比對。通過Jalview軟件展示比對結果。通過ROBETTA網站(https://robetta.bakerlab. org/)預測SN9816和突變體的蛋白三級結構。

1.5 光周期響應分析

將T-DNA分離的基因編輯植株播種于試驗田中, 按當地常規(guī)水肥管理制度進行管理。播種之日起, 至稻穗隨著莖稈的伸長而露出1 cm之日, 之間所經歷的天數即為開花期。

1.6 水稻產量相關性狀分析

將T-DNA分離的純合基因編輯植株種植于沈陽農業(yè)大學試驗田中。4月上旬播種, 5月中旬插秧, 行株距30.0 cm × 13.3 cm, 施標準氮肥975 kg hm–2, 分3段5次施入; 施二銨112.5 kg hm–2, 做基肥一次性施入; 施鉀肥112.5 kg hm–2, 作基肥一次性施入。水層管理采用淺濕干間歇灌溉; 注意防治稻曲病、紋枯病和稻瘟病。在收獲時, 每份試材每個小區(qū)選取有代表性的9個單株, 將穗子從穗莖節(jié)下面剪下來, 分單株放入信封中, 風干2周后進行考種。測量穗長、穗重、一次枝梗數、二次枝梗數、穗總粒數、穗實粒數、穗癟粒數、粒長、粒寬、粒厚、結實率、千粒重和單株產量。以上試驗2019—2021年進行, 共計3次生物學重復。利用GraphPad Prism 9軟件計算種間差異, 以≤0.05為顯著性差異。

1.7 表達模式分析

以SN9816為材料, 取7 d地上幼苗和地下根部, 三葉期至四葉期取生長點, 水稻孕穗期取劍葉、倒二葉、倒三葉、莖節(jié)、葉鞘和幼穗, 以及播種后50～110 d, 每間隔10d取一次完全展開的新葉, 提取上述全部樣品RNA, 反轉錄成cDNA。以(Os03g0718100, LOC_Os03g50885)作為內參, 通過qRT-PCR分析在水稻中的不同組織器官和不同發(fā)育時期的表達量, 以2–ΔCT法計算基因的相對表達量。所用引物見表1。

1.8 單倍型以及單倍型網絡分析

通過RiceVarMap2 (http://ricevarmap.ncpgr.cn/)和RFGB (https://www.rmbreeding.cn/)網站分析的基因組DNA變異、單倍型和單倍型網絡。網站中包括栽培水稻的類型有秈稻、粳稻、Aus稻、中間型。秈稻又可分為具有華南種質的秈稻I、含有東南亞種質的秈稻II和秈稻中間型。粳稻又可分為溫帶粳稻、熱帶粳稻和粳稻中間型。

2 結果與分析

2.1 gRNA引物的設計以及植物轉基因載體的構建

根據基因的基因組DNA序列, 選取CDS編碼區(qū)(+4 ～ +23) bp作為第1個靶點序列, (+24 ～ +26) bp作為protospacer adjacent motif (PAM)序列。選取CDS編碼區(qū)(+321 ～ +340) bp作為第2個靶點序列, (+341 ～ +343) bp作為PAM序列(圖1-A)。利用RAP-DB網站分別BLAST兩個gRNA引物, 均具有特異性。

將gRNA引物雙鏈化, 并與pRGEB32載體連接。用陽性克隆的檢測引物gRF和gRR擴增連接后的載體, 條帶長度350 bp (圖1-B), 測序結果顯示gRNA引物連入載體中(圖1-C)。將重組載體轉入農桿菌感受態(tài)細胞EHA105中, 再次測序, 結果顯示無誤。2個重組構建分別命名為和。

圖1 OsCDF1gRNA靶位點示意圖及含有OsCDF1 gRNA的陽性克隆篩選

A:靶位點示意圖?；疑匦螢?'和3' untranslated region (UTR); 黑色矩形為外顯子; 黑線為內含子。比例尺為200 bp。PAM: 前間隔序列鄰近基序; 黑色下畫線表示PAM序列。B: PCR擴增連接到pRGEB32載體的gRNA。M: DNA marker III; 1～2: PCR產物。C: 含有OsCDF1的gRNA的陽性克隆測序結果。

A:target site in schematic diagram. The grey, bluerectangles, and black lines represent 5' or 3' UTRs, exons and introns, respectively. Bar: 200 bp. PAM: protospacer adjacent motif. The sequences underlined indicate PAM sequences. B: the amplification of the fragments containing gRNAs in pRGEB32 vector by PCR. M: DNA marker III; 1–2: PCR products. C: the sequencing results of the positive clones containing gRNAs of.

2.2 非轉基因純合oscdf1s突變體的篩選

將2個重組構建和分別轉入SN9816愈傷組織中, 通過農桿菌介導的遺傳轉化法各獲得15株和17株T1代陽性植株(圖2-A)。利用突變位點檢測引物擴增T1代陽性植株靶點區(qū)域并測序。另外, 測序對比了沈農9816的該區(qū)間DNA序列, 證明沈農9816的測序結果與日本晴參考基因組的序列相同。結果顯示, 重組構建再生轉化植株中, 有11株發(fā)生突變, 有2種突變類型(圖2-B)。重組構建再生轉化植株中, 有7株發(fā)生突變, 有1種突變類型(圖2-B)。

為最終獲得非轉基因純合突變體, 提取T2代植株幼苗葉片DNA, 通過PCR擴增元件。選取擴增后無條帶的植株DNA, 利用突變位點檢測引物擴增靶點區(qū)域并測序。綜合2個構建結果, 最終獲得在第1個外顯子的第16 bp處缺失5 bp堿基和在第2個外顯子第221 bp處插入單堿基A的2種純合突變類型(圖2-C, D), 將其分別命名為和。

圖2 純合不含T-DNA的oscdf1突變體篩選及分析

A: PCR擴增基因片段結果。M: DNA marker III; 1～48: PCR產物, 1: 模板是ddH2O。B: T1代突變類型分析。C: T2代突變類型分析。紅色箭頭表示突變位點。D: 靶位點核苷酸變化?；疑匦螢?'和3' UTR; 黑色矩形為外顯子; 黑線為內含子。PAM: 前間隔序列鄰近基序; 黑色下畫線表示PAM序列。標尺200 bp。

A: PCR amplification offragments. M: DNA marker III; 1–48: PCR products; 1: template is ddH2O. B: mutation type analysis in T1generation. C: the mutation type analysis in T2generation. Red arrows show the mutation sites. D: the change of the target sites. The grey, blue rectangles, and black lines represent 5' or 3' UTRs, exons, and introns, respectively. PAM: protospacer adjacent motif. The sequences underlined represent PAM. Bar: 200 bp.

2.3 OsCDF1突變蛋白的生物信息學分析

為確認蛋白水平是否發(fā)生了有效突變, 分析比對了突變蛋白序列。結果表明, 2種突變分別在第6個氨基酸處由纈氨酸變?yōu)榫彼?、?12個氨基酸處絲氨酸變?yōu)橘嚢彼? 并產生移碼突變, 最終導致翻譯提前終止(圖3-A, B)。編碼氨基酸數由野生型的441個縮短為36個和178個(圖3-B)。

蛋白質三級結構預測表明,和突變蛋白的三級結構與野生型相比更加簡單, 螺旋結構明顯減少, 破壞了OsCDF1的三級結構(圖3-C)。綜上所述, 一系列分析表明在核酸及蛋白水平都發(fā)生了突變, 表明基因功能可能受到影響。

2.4 oscdf1突變體開花期調查

在自然長日照條件下, 種植SN9816和突變體和, 并調查了開花期, 結果顯示, 突變體(106 d ± 4 d)比野生型(100.5 d ± 1.5 d)晚5d以上抽穗, 突變體(105 d ± 1 d)比野生型 (100.5 d ± 1.5 d)晚4d以上抽穗(圖4)。

2.5 oscdf1突變體產量相關性狀的調查

純合和突變植株經田間種植試驗, 對其穗部相關農藝性狀調查發(fā)現,突變體與野生型SN9816相比穗長極顯著變短(圖5-A, D),但單株穗數極顯著升高(圖5-C)。突變體的一次枝梗數與野生型SN9816無顯著差異(圖5-B, E), 而二次枝梗數與野生型SN9816相比顯著下降(圖5-F)。

對野生型SN9816和突變體粒部相關農藝性狀調查發(fā)現, 除了突變體的粒長極顯著長于野生型SN9816外,突變體的粒寬和粒厚均與野生型SN9816無顯著差異(圖5-G～K)。突變體的每穗飽粒數極顯著下降(圖5-L)。突變體的結實率極顯著低于野生型SN9816, 但千粒重顯著高于野生型SN9816 (圖5-M, N)。表明基因突變影響正常田間種植模式下的植株農藝性狀和產量構成因素。

圖3 OsCDF1突變蛋白的氨基酸變化及三級結構分析

A: 靶位點氨基酸變化。標尺為50 aa。B: 突變蛋白比對分析。C: 三級結構分析。

A: the amino acid change of the target sites. Bar: 50 aa. B: the blast analysis of the mutant proteins. C: the tertiary structure.

圖4 oscdf1突變體開花期表型調查

A:突變體表型。白線為標尺, 10 cm。B:突變體開花期表型分析(≥ 15)。*表示< 0.05水平差異顯著。

A: phenotype ofmutants. Bar: 10 cm in white line. B: flowering time ofmutants (≥ 15). *:< 0.05.

圖5 水稻oscdf1突變體和野生型的農藝性狀比較

A: 野生型(WT)和突變體穗部表型; B:突變體抽穗期表型分析; C: 單株穗數; D: 穗長; E: 一次枝梗數; F: 二次枝梗數; G: 粒長; H: 粒寬; I: 粒長表型; J: 粒寬表型; K: 粒厚; L: 每穗粒數; M: 結實率; N: 千粒重; O: 單株產量。C～F和I～N的數據為平均值±標準差(≥ 15)。*表示< 0.05水平差異顯著; **表示< 0.01水平差異顯著; n.s.表示> 0.05水平差異顯著。

A: the morphology of panicle between WT andmutant; B: the morphology of branch between WT andmutant; C: panicle number; D: panicle length; E: primary branch number; F: secondary branch number; G: grain length. H: grain width; I: grain length; J: grain width; K: grain thickness; L: the filled grain number per panicle; M: seed-setting rate; N: 1000-grain weight; O: yield weight per plant. Data in C–F and I–J are means ± SDs (≥ 15). *:< 0.05; **:< 0.01; n.s.: no significant difference.

分析野生型SN9816和突變體的單株產量發(fā)現,突變體的單株產量極顯著高于野生型SN9816 (圖5-O)。綜上所述,突變體的單株穗數、粒長和千粒重的升高是導致水稻產量升高的主要原因。

2.6 OsCDF1表達模式分析

對在7d SN9816幼苗和根、孕穗期SN9816的劍葉、倒二葉、倒三葉、幼穗、莖、葉鞘以及三葉期的生長點中的表達量檢測發(fā)現,在SN9816水稻不同組織中的表達量存在較大差異, 其中在葉片、莖、葉鞘和幼苗中的表達量相對較高, 其次為幼穗, 在根系和生長點中的表達水平最低(圖6-A)。

檢測SN9816自播種之日起第50、60、70、80、90、100和110天完全展開的新葉中的基因表達量, 發(fā)現在大部分生育時期內都有較高的表達量(圖6-B)。表明可能影響水稻生育期內的生長發(fā)育。

圖6 OsCDF1基因表達模式分析

A:組織特異性表達分析。B:在不同發(fā)育時期的表達量; A和B的數據為平均值±標準差。

A: tissue-specific analysis of. B: the relative expression level ofdifferent developmental stages. Data in A and B are means ± SDs.

2.7 OsCDF1的單倍型分析

通過RiceVarMap2 (http://ricevarmap.ncpgr.cn/)網站分析的單倍型。在位點中, 一共有22個基因變異, 包括單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)和插入/缺失 (Insertions/Deletions, InDels)多態(tài)性。其中有6個變異分布在第2個外顯子上, 其中有4個是同義變異(圖7- A, B)。另外, 2個功能變異可能會破壞的C端的功能(圖7-B)。

在4726份水稻材料中分析的單倍型, 其中包括秈稻I、秈稻II、秈稻III、秈稻中間型、熱帶粳稻、溫帶粳稻、粳稻中間型、Aus稻和中間型。結果顯示, 共有7組單倍型。第I組和第II組占總水稻材料份數的比重最多(圖7-C), 且所有類型的水稻材料都含有單倍型I。說明第I組和第II組是的主要單倍型。此外, 在粳稻和Aus稻中各含有5種單倍型, 在秈稻和中間型中各有7種單倍型, 表明在不同品種中進化出高度多樣性。通過RFGB網站分析海南地區(qū)7組單倍型平均抽穗期數據。不同單倍型開花期不同, 第V組單倍型平均開花期最長, 第VI組單倍型平均開花期最短(圖7-C)。

3 討論

水稻是世界三大糧食作物之一, 更是我國的主要糧食作物。因此, 水稻產量對保障我國糧食安全和社會經濟穩(wěn)定起到關鍵作用。2021年, 我國大部分水稻種植區(qū)氣象條件良好, 水稻產量有所提高[1]。然而, 由于近年來氣候變化、部分地區(qū)的自然災害頻發(fā)、水稻種植面積減少等原因, 影響水稻總產的穩(wěn)定性[28]。因此, 除了保障水稻種植面積外, 提高單產才能穩(wěn)定總產, 這也是近年來育種家持續(xù)關注的問題。過去, 育種家利用傳統(tǒng)自然變異和物理或化學誘變手段獲得突變體, 但過程隨機性強、成本高、周期長、效率低, 在一定程度上限制了作物品種改良。近些年, 育種家將新興的CRISPR/Cas9基因組編輯技術應用到作物品種改良中, 該技術簡單、快速、高效。

圖7 OsCDF1基因變異與單倍型網絡分析

A:基因結構及6種變異位置。黑色矩形代表外顯子; 灰色矩形代表5'非編碼區(qū)和3'非編碼區(qū); 黑線代表內含子。B:OsCDF1蛋白結構及6種變異位置。不同染色三角形的位置代表6種變異的位置。C: 6種基因變異的單倍型網絡, 紅線代表2種單倍型之間突變數量。

A:gene structure and location of the six genomic variations. Black rectangles represent the two exons; Grey rectangles represent the five' untranslated region (5' UTR) and 3' UTR; Black lines represent the intron. B: RFT1 protein structure and location of the six genomic variations. Triangles in different colors indicate the locations of the genetic variations. C: the haplotype network of the six genomic variations. The red lines represent the number of mutations between two haplotypes.

CRISPR/Cas9基因組編輯技術是作物遺傳品種改良的一種強大的工具。該技術可以將負調控作物某些性狀的基因敲除或者弱化其表達, 以達到目標性狀。比如, 敲除大麥()中3個的同源基因, 能夠提高大麥對白粉病的抗性[29]。在水稻中敲除轉錄因子可以增強水稻對稻瘟病的抗性[30]。此外, CRISPR/Cas9基因組編輯技術還在玉米()[31]、大豆(L.)[32]、花生()[33]以及小麥()[34]中有所應用。本研究利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術成功創(chuàng)制出突變體。利用2種不同編輯位點獲得2種不同編輯類型: 一種是在距起始密碼子ATG第16 bp處缺失5 bp堿基, 在106 bp出現終止密碼子TGA; 另一種是在距起始密碼子ATG第338 bp處插入單堿基A, 在532 bp處出現終止密碼子TGA (圖4-A)。2種突變類型編碼氨基酸數均有所變短(圖4-B), 2種突變蛋白的三級結構也變得更加簡單, 螺旋結構明顯減少(圖4-C)。以上表明在核酸及蛋白水平都發(fā)生了突變, 表明基因功能可能受到影響。

真核生物基因組上有很多重復的同源序列, 靶位點序列有較高的GC含量, 這些都會導致CRISPR/Cas9基因組編輯技術的脫靶效應[35]。因此, 本研究在設計靶位點時利用CRISPR/Cas9專用網站, 并在水稻基因組中BLAST檢驗靶位點的特異性。雖然CRISPR/Cas9系統(tǒng)不斷被優(yōu)化, 但其脫靶效應還是會存在。正如本研究中2個靶位點共獲得32株轉基因當代陽性植株, 結果確定被編輯的植株只有18株。對于基因組編輯技術在水稻基因功能研究中的應用, 如果發(fā)生脫靶突變, 可能需要查明脫靶突變是否會導致表型變異, 干擾目標突變對表型的分析?？梢酝ㄟ^與親本雜交后分離的后代來確定目標突變與非目標突變。如果脫靶突變導致性狀變異, 這些突變實質上等同于自然和誘導突變, 并可以在新的品系中保留。因此, 在育種計劃中, 沒有必要排除所有脫靶突變。

植物基因表達與轉錄因子密不可分, Dof蛋白是植物特有的一類轉錄因子[36]。雖然Dof結構域蛋白在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的轉錄激活或抑制的作用, 但其理論機制仍有待進一步研究[37]。Shigyo提出, Dof結構域蛋白可能與光調控機制有關,CDF1正是含有這種結構域的蛋白之一[38]。在擬南芥中,-都被報道與光周期開花途徑有關[14]。CDF1是根據日長特異性調控光周期開花的一個關鍵機制。之前的報道中證明, 在擬南芥開花時期的上午CDF1的non-EAR結構域能夠與TPL結合形成CDF-TPL轉錄復合體, TPL的N端結合域很大程度上削弱了CDF1蛋白對其靶基因的抑制能力, 即抑制擬南芥開花期相關基因和的表達, 導致擬南芥延遲開花, 這種機制在傍晚則不存在[17]。在之前的報道中以水稻的超表達為材料證明能夠促進開花, 并對光周期有響應[22]。本研究則利用基因編輯突變體為研究對象, 為在光周期通路中調控水稻開花期進一步提供理論證據。

盡管一些開花期相關基因被發(fā)掘, 但研究用的遺傳背景材料各不相同, 很難用同一標準對開花期機制進行合理評價。很難將達到最佳產量的開花期基因集于一體, 這對育種家們來說也是一項挑戰(zhàn)。因此, 研究不同種質水稻開花期和相關基因的功能具有重要意義。本研究分析了的基因變異和單倍型, 為水稻開花期研究提供了基因資源, 有利于后續(xù)鑒定優(yōu)異的高產材料?；蚓庉嬇c基因的優(yōu)異單倍型相結合, 這已然成為水稻高產品種分子選育的重要策略。

本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術成功創(chuàng)制出2種突變體, 篩選出去除轉基因標記的水稻SN9816突變體和, 對水稻基因的基因功能進行了初步探索。的突變導致SN9816的開花期延遲和單株產量提高。純合突變體的獲得, 不僅為深入研究基因功能提供了試驗材料, 也為進一步獲得開花期相關基因的雙重或多重突變體奠定了基礎, 同時, 為北方粳稻品種的生育期、產量和地區(qū)適應性的改良奠定了基礎。

4 結論

本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術, 定點敲除基因, 成功獲得2種去除轉基因標記的水稻SN9816突變體。在自然長日照條件下, 突變體和表現晚花, 單株產量提高,表明能夠促進水稻開花。在水稻不同組織器官以及不同生育時期均有表達, 并影響水稻產量。在不同品種中進化出高度多樣性。本研究結果對深入研究的功能及育種應用具有理論和實踐意義。

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Mutation effects ofgene and its genomic variations in rice

HU Yan-Juan, XUE Dan, GENG Di, ZHU Mo, WANG Tian-Qiong, and WANG Xiao-Xue*

Rice Research Institute, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, Liaoning, China

Flowering time (heading date) affects yield, quality, and regional adaptability of rice. The Cycling DOF Factor 1 (CDF1) protein is a transcriptional repressor of() and negatively regulates flowering time in. However, the biological functions of OsCDF1 in rice is not quite clear. To explore the biological functions of OsCDF1 and its effects on flowering time control in rice, we constructed two binary vectors carrying guide RNAs targetinggene via CRISPR/Cas9 system. The resultant plasmids were transferred into SN9816 which was the variety widely cultivated in northern China by using an-mediated transformation, and the mutations ofwas firstly generated in SN9816. The flowering time and yield related traits of SN9816 andmutants were investigated in the paddy field. The main results were as follows: Two homozygouslines were identified, including a five bp deletion at 16th bp of the first exon and a single base pair A insertion at 338th bp of the second exon. Sequence alignment analysis revealed that the two types of mutations resulted in frame-shift and premature translation termination. Mutations ofdelayed flowering time, but increased yield under natural long day conditions in rice. Analysis ofgenetic variations and haplotype networks revealed that the rice accessions had evolved high genomic diversity inlocus. The knockout mutants ofcreated by CRISPR/Cas9 provided the theoretical basis to further study the role ofgene in rice and the potential gene and germplasm resources for genetic improvement in rice.

rice; CRISPR/Cas9; OsCDF1; flowering time; yield related traits; haplotype

2022-10-28;

2023-02-21;

2023-03-16.

10.3724/SP.J.1006.2023.22062

通信作者(Corresponding author):王曉雪, E-mail: wangxx@syau.edu.cn

E-mail: 2020200056@stu.syau.edu.cn

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2017YFD0300107)和國家自然科學基金項目(32070642)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2017YFD0300107) and the National Natural Science Foundation of China (32070642).

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20230315.1424.002.html

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