左春陽 李亞瑋 李焱龍 金雙俠 朱龍付 張獻龍 閔 玲

陸地棉漆酶基因家族成員表達模式分析

左春陽**李亞瑋**李焱龍 金雙俠 朱龍付 張獻龍 閔 玲*

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良全國重點實驗室/ 湖北洪山實驗室, 湖北武漢 430070

漆酶是銅藍氧化酶蛋白家族的一員, 在植物木質(zhì)素合成和提高植株抵御脅迫能力等方面發(fā)揮著重要作用。本研究從陸地棉基因組中鑒定到104個漆酶基因()家族成員, 進行了系統(tǒng)進化樹和組織表達圖譜的構(gòu)建, 并隨機選取了20個基因進行熒光定量PCR分析, 驗證了表達熱圖的結(jié)果。為進一步探索漆酶在棉花中擔(dān)當(dāng)?shù)慕巧? 本研究采用啟動子-GUS融合載體轉(zhuǎn)化擬南芥, 通過轉(zhuǎn)基因擬南芥不同發(fā)育過程不同組織GUS染色結(jié)果, 分析了陸地棉漆酶基因家族6個成員(、、、、、)的精細表達模式。為探究漆酶在逆境中發(fā)揮的作用, 對該6個漆酶基因進行了切割和刺洞2種創(chuàng)傷脅迫誘導(dǎo)表達分析, 并利用2個棉花品系‘84021’ (高溫耐受型)和‘H05’ (高溫敏感型)在常溫和高溫脅迫條件下不同時期的花藥進行相應(yīng)基因的熒光定量PCR分析。研究結(jié)果表明, 隨機挑選的20個基因在根、莖、葉、花瓣、花藥和柱頭6個組織中差異表達, 大多數(shù)基因的表達與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。6個漆酶基因的啟動子能夠不同程度地驅(qū)動基因在種子萌發(fā)時期、二葉期、四葉期表達; 創(chuàng)傷處理結(jié)果顯示、的啟動子受創(chuàng)傷誘導(dǎo)后驅(qū)動GUS蛋白在葉片中表達的能力顯著提高, 暗示著這2個基因可能參與創(chuàng)傷脅迫響應(yīng)。6個基因在棉花耐高溫品系‘84021’的四分體時期和花藥開裂期高溫脅迫后都有表達量顯著下調(diào)的趨勢, 推測基因可能負調(diào)控陸地棉花藥高溫耐受性。本研究結(jié)果為進一步探索漆酶家族基因功能提供了參考。

陸地棉; 漆酶基因; 啟動子-GUS表達模式分析; 花藥高溫響應(yīng); 創(chuàng)傷誘導(dǎo)

1883年Yoshida首次從日本漆樹()的汁液中分離得到漆酶(benzenediol: oxygen oxidoreductases [EC1.10.3.2])[1], 該酶是一種結(jié)合銅離子的糖蛋白, 屬于銅藍氧化酶蛋白家族, 其氧化機理是利用分子氧作為電子受體, 催化多種酚類化合物和芳香胺的氧化, 并將其還原為水[2]。漆酶根據(jù)來源可分為真菌漆酶和植物漆酶[3], 在真菌中, 它主要與木質(zhì)素的降解[4]、分生孢子的致病性[5]和脫毒作用[6]有關(guān)。植物漆酶的生理功能主要是參與防御反應(yīng)相關(guān)的過程, 如細胞壁木質(zhì)素合成和酚類化合物聚合等[7]。木質(zhì)素是植物細胞壁氧化聚合木質(zhì)素單體而形成的高聚物, 也是植物細胞壁的主要成分之一。被子植物的木質(zhì)素是復(fù)雜的酚類聚合物, 在細胞質(zhì)基質(zhì)中合成的木質(zhì)素單體, 被輸送至細胞壁, 在此氧化生成木質(zhì)素。長期以來, 植物細胞壁豐富的過氧化物酶被認為是催化木質(zhì)素單體氧化聚合的首要酶, 但有研究表明, 漆酶分泌到植物細胞次生壁, 在有氧氣存在時, 可以催化同樣的聚合反應(yīng)。1992年從歐亞槭樹()中分離得到漆酶, 并證明其可以體外催化木質(zhì)素單體的氧化聚合[8], 該研究還認為漆酶參與木質(zhì)素單體氧化聚合形成寡聚物, 而過氧化物酶則參與后期形成高聚物的反應(yīng)[8]。Liang等[9]發(fā)現(xiàn)擬南芥漆酶基因的突變會導(dǎo)致突變體中木質(zhì)素單體的聚合活性下降, 擬南芥種子中木質(zhì)素含量減少30%。而將野生棉的漆酶基因在楊樹中超量表達可顯著提高楊樹中木質(zhì)素的含量, 證明棉花的漆酶基因也參與木質(zhì)素的合成[10]。Bao等[11]在研究火炬松()漆酶時同樣得出了漆酶與木質(zhì)素合成相關(guān)的結(jié)論。Berthet等[12]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了2個在莖中強烈表達的基因:和, 通過對突變體的研究發(fā)現(xiàn),和都參與了擬南芥莖的組成性木質(zhì)化, 并且參與了G木質(zhì)素單位在纖維中的沉積。Miguel等[13]依據(jù)試驗發(fā)現(xiàn),、、定位于果莢的木質(zhì)化細胞壁, 利用CRISPR/Cas9同時敲除了這3個基因, 突變體表現(xiàn)出嚴(yán)重的生長阻滯、產(chǎn)生木質(zhì)化減少和莖稈木質(zhì)部導(dǎo)管塌陷, 證明內(nèi)果皮木質(zhì)化需要、和的驅(qū)動。

近年來, 各種研究表明漆酶不僅是植物木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵酶之一, 能夠起到調(diào)控植物體內(nèi)酚類代謝物合成的作用, 從而參與木質(zhì)素纖維細胞壁的結(jié)構(gòu)形成, 而且與植物的生長發(fā)育乃至育性性狀有關(guān)。Zhang等[14]確定了OsmiR397通過下調(diào)其靶基因來增加籽粒產(chǎn)量。Zhong等[15]發(fā)現(xiàn)OsAGO17與形成一個RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC), 通過抑制基因表達影響水稻發(fā)育, 從而證明OsAGO17可能是sRNA通路中的一個關(guān)鍵蛋白, 對水稻籽粒大小和粒重具有正向調(diào)控作用。Sun等[16]研究表明, 13對miRNA/靶基因通過響應(yīng)溫度變化調(diào)控水稻PA64S的雄性育性, 其中miR156、miR5488和miR399分別通過影響SPLs、花藥壁木質(zhì)素合成和類黃酮代謝途徑來影響PA64S的雄性育性。

此外, 種種研究表明植物漆酶還具有其他生物學(xué)功能, 在生物技術(shù)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[17]。研究者將棉花漆酶基因在擬南芥中過量表達, 發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥對酚酸類物質(zhì)的抗性明顯增強[10]。Jiao等[18]從平菇全基因組序列中鑒定出12個漆酶基因, 分析了12個基因在平菇不同發(fā)育階段和不同培養(yǎng)基質(zhì)下的表達模式, 結(jié)果表明,和可能分別參與木質(zhì)素的降解和菌絲體的形成, 隨后在平菇中過表達基因, 可顯著提高轉(zhuǎn)化子的漆酶活性, 且轉(zhuǎn)基因菌株在30 d內(nèi)對棉稈木質(zhì)素的降解率比野生型高2.36%～6.30%。該研究表明過表達可顯著增強棉稈木質(zhì)素的降解。此外, 當(dāng)利用35S啟動子驅(qū)動土豆漆酶基因在番茄中過量表達時, 可改變番茄體內(nèi)氯原酸等酚類物質(zhì)的含量, 從而顯著提高轉(zhuǎn)基因番茄對丁香假單胞菌(pv.)的抗性[19]。而另一方面, 有研究報道漆酶可以保護真菌病原菌免受寄主植保素和鞣質(zhì)等化合物的影響[20], 所以漆酶也被認為是重要的病原菌毒力因子, 漆酶活性下降與真菌毒力下降有直接的關(guān)聯(lián)[21-22]。

除此之外也有植物漆酶抗病蟲的報道, Hu等[23]證明了過表達棉花漆酶基因?qū)е履举|(zhì)化的增加, 與真菌病原體大麗黃萎病菌和棉鈴蟲的耐受性增加有關(guān), 轉(zhuǎn)基因操縱的表達可以增強棉花對病原體和害蟲的防御反應(yīng)。Wei等[24]鑒定了棉花漆酶基因, 該基因參與木質(zhì)素生物合成和植物對黃萎病的抗性。Pourcel等[25]研究報道一個基因TT/AtLAC15, 其參與類黃酮在擬南芥種皮中的氧化聚合和原花青素的合成, 對于植物抗紫外線、抗病、抗蟲、清除自由基、調(diào)節(jié)種子休眠和萌發(fā)等生理功能具有重要作用。

漆酶是多基因家族, 在雙子葉模式植物擬南芥中有17個成員[26], 在單子葉模式植物水稻中有30個成員[27], 功能冗余以及其底物的廣泛性使得漆酶在植物體內(nèi)的功能難以被準(zhǔn)確鑒定。本研究對陸地棉漆酶基因家族成員進行鑒定, 通過啟動子-GUS融合載體轉(zhuǎn)化擬南芥, 揭示了陸地棉漆酶家族6個成員的組織表達模式, 探究了漆酶基因在不同生長發(fā)育時期的表達情況; 并通過對轉(zhuǎn)基因植株進行創(chuàng)傷誘導(dǎo)處理, 探究漆酶在抗蟲抗病方面的應(yīng)用。此外, 在耐、敏高溫陸地棉材料高溫和常溫條件下探究花藥中漆酶表達量的變化趨勢, 為了解漆酶基因在花藥高溫脅迫響應(yīng)方面的作用奠定了基礎(chǔ)。本研究以期為深入了解漆酶在陸地棉生長發(fā)育過程及抗逆脅迫響應(yīng)中所承擔(dān)的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與種植條件

哥倫比亞野生型擬南芥(,)作為轉(zhuǎn)基因受體材料。所有擬南芥種子種植前經(jīng)過2 d的4℃低溫春化處理, 人工氣候箱種植時溫度設(shè)置為22℃,濕度為60%, 16 h光照(光強100～120 μmol m–2s–1)。用于組織表達分析的材料為陸地棉()‘H05’, 用于高溫誘導(dǎo)表達分析的材料為陸地棉‘84021’和‘H05’, 溫室種植‘84021’和‘H05’, 于盛蕾時期設(shè)定白天28～35℃持續(xù)12 h, 晚上20～25℃持續(xù)12 h為正常條件, 高溫條件為白天37～39℃持續(xù)12 h,晚上29～31℃持續(xù)12 h, 高溫處理周期為7 d。

1.2 載體與菌株

pGEM-T Easy載體用于TA克隆; pDONOR221為BP-LR反應(yīng)入門載體; 用于啟動子表達模式分析所用載體為pGWB433。載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌受體為; 擬南芥的侵染農(nóng)桿菌()菌株為(菌株、質(zhì)粒由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良全國重點實驗室棉花遺傳改良課題組保存)。

1.3 載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

根據(jù)基因的啟動子序列設(shè)計引物, 擴增目的片段并通過BP反應(yīng)將PCR產(chǎn)物連接到中間載體pDONR221 (購于Invitrogen公司)上, 之后與目的載體(pGWB433)進行LR反應(yīng), 最終獲得不同基因的啟動子序列的重組載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法將構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)入擬南芥[20]。首先, 將活化后的含有目的載體的農(nóng)桿菌()接種到200 mL液體LB培養(yǎng)基中, 在28℃搖床上200轉(zhuǎn) min–1培養(yǎng)過夜, 待菌液OD600達到0.8～0.9后離心收集菌體, 并用浸染緩沖液(5%蔗糖, 0.01% Silwet L-77)將菌體重懸, 隨后進行花序浸染轉(zhuǎn)化。收取T0代擬南芥種子, 并用75%酒精消毒2次, 每次5 min, 再使用50% (v/v)的84消毒液消毒3次, 每次1 min, 之后用無菌水于超凈工作臺中清洗種子5次, 每次1 min, 后將種子播種于加入了卡拉霉素的培養(yǎng)基中進行轉(zhuǎn)基因陽性植株的篩選?？ɡ顾睾Y選法篩選至T2代全部不出現(xiàn)抗性分離的陽性純系植株。

1.4 主要酶類和試劑

RNA提取試劑盒購于Sigma公司, 反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV Reverse Tran-scriptase購于Promega公司, 限制性內(nèi)切酶購于NEB公司,DNA聚合酶, dNTP和T4 DNA連接酶。GUS染液配方如下: 0.9 g L–1X-Gluc (4-甲基-7-氧香豆素-β-D-葡萄糖苷酸, Alfa Aesar), 50 mmol L–1磷酸鉀緩沖液(pH 7.0), 20% (v/v)甲醇和100 mg L–1氯霉素。qRT-PCR試劑購于ABI公司。載體構(gòu)建過程中所用的抗生素有氨芐青霉素、慶大霉素、卡那霉素、利福平等, 均購自Sigma公司。

1.5 陸地棉漆酶基因家族成員的鑒定及進化樹構(gòu)建

在棉花基因組數(shù)據(jù)庫(https://cottonfgd.org/)通過關(guān)鍵詞“Laccase”檢索, 獲得陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫中漆酶基因家族成員的CDS序列和蛋白序列, 再用NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Blastn和Blastp以及DNAMAN對已獲得的陸地棉漆酶家族()的成員進行鑒定分析, 陸地棉漆酶基因基本信息見表1。利用MEGA 7對擬南芥、水稻、陸地棉漆酶家族成員進行多序列比對, 并運用鄰接法(Neighbor-Joining法, Bootstrap設(shè)為1000, 其他參數(shù)為默認值)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。本研究中陸地棉基因序列來源于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)數(shù)據(jù)庫(https://www.cottongen.org/); 擬南芥基因數(shù)據(jù)來源于TAIR數(shù)據(jù)庫(http:// www.arabidopsis.org/); 水稻序列來自phytozome數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。

表1 本試驗所用引物及用途

1.6 陸地棉漆酶基因家族成員組織表達熱圖分析

基于本課題組前期陸地棉高溫敏感品系“H05”不同組織的表達譜數(shù)據(jù)[28], 數(shù)據(jù)結(jié)果最終歸一化為TPM (transcripts per kilobase of exon model per million mapped reads), 獲得GhLAC基因家族各成員的表達量數(shù)據(jù), 利用Heatmap Illustrator軟件(https:// hemi.biocuckoo.org/)繪制GhLAC基因家族各成員的組織表達熱圖。

1.7 陸地棉漆酶基因家族組織表達分析

分別以陸地棉“H05”根、莖、葉、花瓣、柱頭和花藥等不同組織cDNA為模板, 利用qRT-PCR方法檢測候選基因的表達情況。棉花不同組織的RNA提取依據(jù)改良的異硫氰酸胍法[29], 微量分光光度計(NanoDrop2000, 美國)檢測RNA濃度, 電泳檢測RNA質(zhì)量。每份材料取3 μg RNA于0.5 mL無RNA酶離心管中用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)的cDNA樣品稀釋100倍作為表達量檢測的模板。設(shè)置每個樣本3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù), 內(nèi)參基因選定看家基因(Gh_ A11G011460)。反應(yīng)體系包含7 μL稀釋的cDNA模板、7 μL SYBR Green Master Mix Reagent (Bio-Rad公司)、正反引物各0.5 μL (4.5 nmol L–1)。反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性60 s; 95℃ 15 s, 60℃ 30 s, 40個循環(huán)。采用2–ΔΔCt方法計算基因的相對表達量[30]?；騫RT-PCR定量引物跨外顯子設(shè)計, 詳見表1。

1.8 擬南芥不同時期GUS染色及創(chuàng)傷誘導(dǎo)處理

將擬南芥于種子萌發(fā)期、二葉期、四葉期以及成熟期分別取樣后, 放入含有反應(yīng)底物X-Gluc的染色液中(0.9 g L–1X-Gluc, 50 mmol L–1磷酸鉀緩沖液(pH 7.0), 20% (v/v)甲醇和100 mg L–1氯霉素), 37℃染色過夜, 隨后用75%酒精充分脫色, 用體式顯微鏡(Leica MZFLⅢ)觀察并照相。篩選出純合株系進行創(chuàng)傷誘導(dǎo)處理。本試驗設(shè)置對照組, 切割處理組, 刺洞處理組3組進行, 分別標(biāo)記為CK、C和P。當(dāng)擬南芥生長至二葉期與四葉期時分別取樣。刺洞處理組用無菌細針在擬南芥其中一片子葉上進行刺洞,切割處理組用無菌刀在擬南芥其中一片子葉上進行切割, 對照組不作處理。之后對所有材料進行GUS染色處理, 方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉漆酶基因家族(GhLAC)成員的鑒定及進化樹構(gòu)建

在陸地棉基因組中共尋找到104個LAC基因家族成員, 將陸地棉、單子葉模式植物水稻和雙子葉模式植物擬南芥的蛋白序列共同使用MEGA 7軟件進行Construct/Test Neighbor-Joining Tree分析, 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。為進一步了解家族成員的功能, 根據(jù)漆酶基因蛋白序列比對結(jié)果[31], 將漆酶基因家族分為6組。第I組包括8個陸地棉漆酶成員, 2個水稻漆酶成員和1個擬南芥漆酶成員; 第II組包括17個陸地棉漆酶成員, 4個水稻漆酶成員和3個擬南芥漆酶基因; 第III組包括19個陸地棉漆酶成員, 2個水稻漆酶成員和5個擬南芥漆酶基因; 第IV組只有7個陸地棉漆酶成員和4個水稻漆酶成員; 第V組包括21個陸地棉漆酶成員, 7個水稻漆酶成員和4個擬南芥漆酶成員; 第VI組包括32個陸地棉漆酶成員, 11個水稻漆酶成員和4個擬南芥漆酶成員。

根據(jù)陸地棉漆酶基因在染色體上的位置信息以及進化樹所展示的部分同源關(guān)系,對該104個LAC基因家族成員進行命名(表2), 其中A和D亞組同源基因?qū)τ?0對, 命名為～, A亞組特異基因命名為, D亞組特異基因命名為, 有2個基因定位在scaffold上, 將其命名為和。

2.2 GhLAC家族基因組織表達模式分析

基于本課題組前期“H05”不同組織的表達譜數(shù)據(jù)[28], 將基因在“H05”根、莖、葉、花瓣、花藥與柱頭中表達量的值進行l(wèi)og2計算后, 用于構(gòu)建基因家族成員的表達熱圖(圖2)。結(jié)果顯示, 在104個陸地棉LAC基因中, 有43個基因在6個組織中表達量較低, 其中有9個基因(、、、、、、、、)在6個組織中表達量TPM值為0; 其余61個基因在不同組織中有不同程度的表達。有5個基因在根中高量表達, 其中、和表達量較高; 有19個基因在莖中高量表達, 其中、和表達量較高; 有18個基因在葉中高量表達, 其中、和表達量較高; 有4個基因在花瓣中高量表達, 其中表達量最高; 有12個基因在花藥中高量表達, 其中和表達量最高; 有8個基因在柱頭中高量表達, 其中和表達量最高(圖2-B)。

圖1 陸地棉、擬南芥和水稻LAC基因家族進化樹分析

表2 陸地棉LAC基因家族信息

(續(xù)表2)

(續(xù)表2)

圖2 陸地棉LAC基因表達熱圖

A:基因家族在‘H05’根、莖、葉、花瓣、花藥與柱頭中的表達熱圖。B: 不同組織中高量表達的基因。

A: heat map ofgene family expression in root, stem, leaf, petal, anther, and stigma of H05. B: the classification of highly expressed genes in different tissues.

為證實表達譜數(shù)據(jù)的可靠性, 隨機挑選20個基因, 并跨5′UTR和CDS區(qū)域設(shè)計引物, 在“H05”的根、莖、葉、花瓣、花藥和柱頭6個組織進行qRT-PCR分析。結(jié)果顯示這20個基因在6個組織中差異表達, 大部分基因的表達與表達譜結(jié)果一致。其中、、和在根部特異高量表達, 其他組織不表達或表達量低。其余16個基因在5個組織中都能檢測到不同程度的表達。、、和在根中優(yōu)勢表達;、和在莖中優(yōu)勢表達;、和在葉中優(yōu)勢表達;、、、、和在花瓣中優(yōu)勢表達;、在柱頭中優(yōu)勢表達;、在花藥中優(yōu)勢表達(圖3)。

2.3 6個GhLACs基因啟動子在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達模式分析

為探討家族基因在棉花中的功能, 進一步了解基因家族成員在不同組織中的精細表達情況, 根據(jù)上述表達結(jié)果(圖2和圖3), 本研究分別在A/D亞組中各挑選3個, 共6個有著不同的組織表達模式的陸地棉漆酶基因, 分別為、、、、、, 進行相應(yīng)啟動子的克隆, 并將棉花基因的啟動子與目的載體pGWB433進行連接, 獲得重組載體, 并轉(zhuǎn)化擬南芥, 最終獲得轉(zhuǎn)基因植株, 在不同時期進行GUS染色; 并對這6個漆酶基因在耐高溫品系‘84021’和敏高溫品系‘H05’高溫和常溫條件下的四分體時期(TS)、絨氈層發(fā)育與降解時期(TDS)和花藥開裂時期(ADS)花藥中的表達進行qRT-PCR分析。

圖3 GhLAC基因家族部分成員組織表達分析

R: 根; S: 莖; L: 葉; P: 花瓣; St: 柱頭; A: 花藥。誤差值代表3個生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差,()為內(nèi)參基因。通過ANOVA方法分析表達差異顯著性, 不同的字母代表在0.05概率水平差異顯著。

R: root; S: stem; L: leaf; P: petal; St: stigma; A: anther. The error value represents the standard deviation of the three replicates, and() was the internal reference gene. Different letters indicate significantly different at< 0.05 by one-way ANOVA.

2.3.1 6個基因家族成員在種子萌發(fā)時期的表達模式分析 GUS染色結(jié)果顯示, 在種子萌發(fā)初期,、和基因的啟動子可以驅(qū)動報告基因的表達, 而、、的啟動子在此時期未能驅(qū)動報告基因的表達。其中、驅(qū)動基因在整個種子表達;表達程度較高,表達程度相對低些;在幼根有微量表達。在種子萌發(fā)后期, 除轉(zhuǎn)基因植株沒有被染上色外, 其余5個都有被染上色, 其表達部位有各自的特點:驅(qū)動基因在根部表達, 且表達豐度較高;、驅(qū)動基因在根以及根毛處顯著表達;與分別驅(qū)動基因在幼根處和下胚軸表達(圖4)。

2.3.2 6個基因家族成員在二葉期和四葉期的表達模式分析 將擬南芥長出兩片子葉的時期稱為二葉期; 隨后擬南芥發(fā)育形成第1對真葉, 也稱蓮座葉, 該時期稱為四葉期; 在這一時期, 隨著葉片表皮的發(fā)育, 形成表皮毛[32]。二葉期時, 除外(圖5-C),和均能驅(qū)動基因表達。和驅(qū)動基因在整個幼苗都有表達, 前者在子葉表達豐度較高(圖5-A), 后者在子葉葉片、根、根毛等多個部位表達豐度較高(圖5-B);在子葉的葉尖端少量表達(圖5-D);和僅在根部表達,驅(qū)動基因微量表達(圖5-E)而驅(qū)動基因顯著表達(圖5-F)。四葉期, 一直未表達的基因啟動子在這一時期驅(qū)動表達, 表達部位在子葉的葉片生長點及葉脈處(圖5-I)。在子葉和真葉上高量表達(圖5-G)。驅(qū)動基因在葉片、根、根毛等部位顯著表達(圖5-H);在此階段未表達(圖5-K),基因啟動子除了一直驅(qū)動基因在根部表達外, 也在真葉的表皮毛上特異表達(圖5-L)。在四葉期驅(qū)動表達的部位增多, 且表達豐度也增加, 二葉期只在子葉中驅(qū)動基因表達(圖5-D), 而四葉期在子葉、根部及葉脈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中均能驅(qū)動基因表達(圖5-J)。

圖4 6個GhLACs基因啟動子驅(qū)動GUS基因在種子萌發(fā)時期的表達

Stage 1: 種子萌發(fā)初期; Stage 2: 種子萌發(fā)后期。RH: 根毛; Ra: 幼根。圖中標(biāo)尺均為200 μm。

Stage 1: the early seed germination stage; Stage 2: the later seed germination stage. RH: root hair; Ra: radicle. Bar: 200 μm.

圖5 6個GhLACs基因啟動子驅(qū)動GUS基因在二葉期和四葉期的表達模式分析

Stage 1: 二葉期; Stage 2: 四葉期。Tr: 表皮毛。標(biāo)尺為1 mm。(A～F)和(G～L): ProGhLAC12A、ProGhLAC14A、ProGhLAC20A、ProGhLAC25D、ProGhLAC59D和ProGhLAC63D在二葉期(A～F)和四葉期(G～L)的表達模式分析; (M～R)和(S～X): ProGhLAC12A、ProGhLAC14A、ProGhLAC20A、ProGhLAC25D、ProGhLAC59D和ProGhLAC63D在四葉期的葉(M～R)和根(S～X)的表達模式分析。

Stage 1: two-leaf stage; Stage 2: four-leaf stage.Tr: trichome. Bar: 1 mm. (A–F) and (G–L): the relative expression pattern of,,,,andat two-leaf (A–F) and four-leaf (G–L) stages; (M–R) and (S–X): the analysis of leaf (M–R) and root (S–X) expression patterns of,,,,, andat four-leaf stage.

四葉期時, 分別對6個漆酶基因的子葉及根部進行放大觀察。葉部和沒有驅(qū)動表達(圖5-Q, R), 其余基因啟動子都能驅(qū)動表達(圖5-M～O, P)。在根部,、、、轉(zhuǎn)基因植株中均觀察到不同程度GUS染色(圖5-S, T, V, X),而和的根部未被染色(圖5-U, W)。

2.3.3 6個基因家族成員在成熟期不同部位的表達模式分析 在成熟時期, 主要以花和葉作為重點考察對象, 在和轉(zhuǎn)基因植株的花器官上沒有觀察到基因的表達(圖6-E, F)。其他4個基因的轉(zhuǎn)基因植株都能觀察到不同程度的GUS著色。在花藥中高量表達(圖6-A);驅(qū)動基因表達豐度較高, GUS著色主要集中在雄蕊(圖6-B);在花藥中表達(圖6-C);在柱頭和花絲中有基因的表達(圖6-D)。對于成熟期葉片而言, 除外(圖6-K), 各基因啟動子都能不同程度地驅(qū)動基因的表達。和的葉柄處及葉基部能觀察到GUS著色(圖6-G, H);和基因啟動子能驅(qū)動基因在葉片的表皮毛中微量表達(圖6-I, L);驅(qū)動基因在葉脈中有微量表達(圖6-J)。

圖6 GhLACs基因啟動子驅(qū)動GUS基因在成熟期花序和葉片中的表達分析

(A～F)、(G～L)分別代表了、、、、與基因啟動子驅(qū)動基因在花期和成熟期葉部的表達情況。An: 花藥。標(biāo)尺為1 mm。

(A–F) and (G–L) represent the expression ofgene driven by the promoter of,,,,,andgenes in flowering and leave at mature stage, respectively. An: anther. Bar: 1 mm.

2.4 6個GhLACs基因家族成員逆境脅迫誘導(dǎo)表達分析

2.4.1 二葉期和四葉期創(chuàng)傷誘導(dǎo)處理表達模式分析

植物不斷遭受各種蟲害, 每年造成大量的產(chǎn)量和質(zhì)量損失。研究表明漆酶具有木質(zhì)素聚合酶的功能, 參與單木質(zhì)素聚合形成木質(zhì)素, 提高了機械強度, 并加強細胞壁, 提供了物理屏障, 木質(zhì)素使植物細胞壁更難以被咀嚼式和刺吸式昆蟲穿透[33-34]。為探究漆酶基因在抗蟲方面的作用, 因此分別對、、、、和六種轉(zhuǎn)基因株系在二葉期的子葉和四葉期的子葉或真葉進行切割和刺洞處理, 得到不同處理后結(jié)果(圖7)。

5種不同轉(zhuǎn)基因材料在二葉期經(jīng)過創(chuàng)傷處理后,和驅(qū)動表達豐度增加,、、和基因啟動子在二葉期不受創(chuàng)傷誘導(dǎo)。

四葉期時, 對轉(zhuǎn)基因材料的子葉或真葉進行處理。其中, 對和轉(zhuǎn)基因株系的子葉和真葉均進行了切割和刺洞處理, 切割后,的子葉和真葉中表達豐度均增加,只在被切割的那片真葉中表達豐度明顯增加; 刺洞處理后,轉(zhuǎn)基因株系子葉的刺洞區(qū)域的表達豐度相對于周圍區(qū)域較低,也只在被刺洞的那片子葉或真葉中GUS表達豐度明顯增加, 這些有趣的現(xiàn)象暗示了不同的可能參與不同的創(chuàng)傷信號響應(yīng)或傳導(dǎo)。與二葉期相同, 其余4個基因啟動子在四葉期同樣未受到明顯的創(chuàng)傷誘導(dǎo)。

圖7 二葉期和四葉期創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達模式分析

A: 二葉期創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達模式分析; B: 四葉期創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達模式分析。CK: 對照組; C: 切割組; P: 刺洞組。紅色箭頭代表切割處理, 白色箭頭代表刺洞處理。標(biāo)尺為2 mm。

A and B: the expression patterns induced by trauma at the two leaf seedling stage (A) and four leaf seedling stage (B). CK: the control group; C: cutting group; P: piercing group. The red arrow represents cutting treatment, and the white arrow represents piercing treatment. Bar: 2 mm.

2.4.2 6個基因家族成員在花藥響應(yīng)高溫脅迫中的作用 課題組前期研究表明, 高溫雄性不育是棉花減產(chǎn)的主要原因[35-36], 從組織表達熱圖結(jié)果可知, 有大量的基因在花藥中有表達(圖2)。且6個漆酶家族成員啟動子成熟期花序GUS染色發(fā)現(xiàn), 其中4個漆酶家族成員在花藥中有表達(圖6)。為探討這6個漆酶家族成員是否參與花藥高溫脅迫響應(yīng), 我們在2個棉花品系‘84021’ (高溫耐受型)和‘H05’ (高溫敏感型)在常溫和高溫條件下四分體時期(TS)、絨氈層降解期(TDS)和花藥開裂期(ADS)的花藥中, 進行相應(yīng)基因的熒光定量PCR分析。結(jié)果顯示, 6個漆酶基因家族成員在耐溫材料‘84021’的四分體時期花藥中, 受高溫脅迫后表達量均顯著下調(diào), 其中、和在敏溫材料‘H05’中高溫后的表達量也出現(xiàn)明顯下調(diào), 但6個基因在耐溫材料‘84021’四分體時期花藥中常溫下的表達顯著高于敏溫材料‘H05’, 高溫后6個基因在‘84021’中表達下降的程度也明顯高于敏溫材料‘H05’。在絨氈層降解時期,、和在2種材料中均表現(xiàn)出相類似的變化趨勢?；ㄋ庨_裂時期, 在敏高溫材料‘H05’中, 除外, 其他5個基因受高溫誘導(dǎo)后有不同程度的上調(diào)表達; 而在耐高溫材料‘84021’中, 6個基因均顯著下調(diào)(圖8)。6個漆酶成員中,在花藥中的表達量相對較高, 這與驅(qū)動基因在花藥中的表達趨勢相同(圖6)。

圖8 6個GhLAC基因家族成員高溫誘導(dǎo)表達分析

基因在2個陸地棉品系‘84021’ (耐高溫品系)、‘H05’ (敏高溫品系)中TS (四分體時期; 花蕾長度6～7 mm)、TDS (絨氈層降解時期; 花蕾長度9～14 mm)和ADS (花藥開裂時期; 花蕾長度大于24 mm)的花藥中的熒光定量檢測。HN: 常溫下的‘H05’; HH: 高溫下的‘H05’; 8N: 常溫下的‘84021’; 8H: 高溫下的‘84021’。誤差值代表3個生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差,()為內(nèi)參基因。使用檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析, 星號表示有顯著差異(*< 0.05, **< 0.01)。

The relative expression pattern ofgenes was performed in 84021 (high temperature tolerance line) and H05 (high temperature sensitive line) anthers at TS (tetrad stage; 6- to 7-mm bud), TDS (tapetal degradation stage; 9–14 mm bud), and ADS (anther dehiscence stage; more than 24-mm bud) under NT and HT by qRT-PCR. HN: H05 under normal temperature; HH: H05 under high temperature; 8N: 84021 under normal temperature; 8H: 84021 under high temperature. The error value represents the standard deviation of three biological replicates, and() as the internal reference gene.Asterisks indicate significant differences (*< 0.05, **< 0.01) by Student’stest.

3 討論

本研究從高質(zhì)量的陸地棉全基因組中鑒定出104個漆酶基因成員。染色體定位發(fā)現(xiàn), 除A07和D07染色體外, 其他染色體都不均勻地分布著基因。A亞組有50個漆酶基因, 其中30個基因與D亞組同源, 20個漆酶基因特異; D亞組有52個漆酶基因, 其中22個漆酶基因特異。和定位在scaffold上。結(jié)合系統(tǒng)進化樹和表達熱圖結(jié)果, 同源基因的表達存在一定相似性。進一步隨機選擇20個GhLAC基因熒光定量PCR發(fā)現(xiàn), GhLAC基因家族成員在“H05”品系根、莖、葉、花瓣、花藥和柱頭中存在差異表達, 暗示漆酶基因可能在棉花生長發(fā)育不同過程中起著不同的作用。

通過對后續(xù)挑選的6個基因啟動子驅(qū)動染色的結(jié)果可以初步了解所研究的漆酶家族成員的表達情況。從轉(zhuǎn)基因擬南芥的表達模式結(jié)果來看, 6個漆酶基因各自在不同時期被不同程度誘導(dǎo)表達, 其表達部位有一個共同的特點, 即導(dǎo)管結(jié)構(gòu)(葉脈或根的輸導(dǎo)組織)。研究顯示在植物維管發(fā)育過程中, 木質(zhì)素漆酶活性與過氧化物酶活性對于單木質(zhì)素聚合是必要的, 而不是冗余的[37], 我們推測這6個漆酶基因家族成員參與維管束的合成, 這一點有待后續(xù)研究。多功能漆酶在植物細胞伸長中起著重要作用, 影響棉花纖維品質(zhì)[38], 本研究中基因啟動子在種子萌發(fā)期、二葉期和四葉期的根毛處都驅(qū)動表達;在種子萌發(fā)期根毛處、四葉期真葉和成熟期葉片的表皮毛處驅(qū)動表達, 推測這2個基因與纖維發(fā)育存在相關(guān)性。此外, 研究證明位于幼穗中高表達的OsmiR397b, 通過下調(diào)目標(biāo)基因的表達增加水稻穗長、株高和籽粒大小[14];、、和在花器官上有表達, 主要存在于柱頭、花絲、雄蕊和花藥中; 因此我們推測棉花漆酶基因可能同樣與種子發(fā)育相關(guān)。

陸地棉漆酶基因在防御病原體和昆蟲方面也有一定作用[39]。本研究進行創(chuàng)傷誘導(dǎo)實驗?zāi)康氖菍ふ遗c抗蟲相關(guān)的漆酶基因, 從本試驗結(jié)果可以得出創(chuàng)傷處理能使和的表達量從無到有或從少到多。Hu等[23]研究證明表達上調(diào)導(dǎo)致木質(zhì)素含量增加, 棉鈴蟲和棉蚜的取食偏好降低, 棉鈴蟲和棉蚜的初始侵染和定殖受到限制, 而下調(diào)基因降低了木質(zhì)素含量, 從而導(dǎo)致棉花對大麗輪枝菌和棉鈴蟲的耐受性降低。Zhang等[40]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系細胞壁木質(zhì)化增強, 顯著提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對黃萎病菌的抗性; 而的RNAi系對大麗輪枝菌的敏感性增加, 木質(zhì)素含量降低。因此我們推測本試驗中被創(chuàng)傷顯著誘導(dǎo)的2個基因和可能會通過增強細胞壁木質(zhì)化, 提高棉花對大麗輪枝菌和棉鈴蟲或蚜蟲的抗性。

值得注意的是, 本研究挑選的6個漆酶基因在棉花耐溫品系‘84021’和敏溫品系‘H05’的qRT-PCR結(jié)果表明, 高溫脅迫后, 6個基因在‘84021’四分體時期以及花藥開裂時期的表達量都呈現(xiàn)顯著下調(diào)的趨勢, 而在敏溫品系‘H05’花藥開裂期受高溫誘導(dǎo)顯著上調(diào)(圖8)。Zhang等[28]對NT和HT條件下棉花中差異表達的基因進行了分析, 共鑒定出833個差異表達基因(DEGs), 其中包含, 該漆酶基因可能受到高溫誘導(dǎo)影響棉花花藥開裂與雄性不育, 因此我們推測本研究中的6個基因在敏溫材料中受到高溫誘導(dǎo)上調(diào)表達可能與敏溫材料高溫不育表型相關(guān)。同時, 內(nèi)果皮細胞壁內(nèi)的非對稱木質(zhì)素沉積是種子爆發(fā)性傳播所必需的一種特性。Miguel等[13]通過定量分析發(fā)現(xiàn), 與野生型相比, 果莢木質(zhì)化程度較低的突變體中木質(zhì)素含量明顯降低, 而這一突變體的種子傳播距離也明顯變短: 突變體的種子最大傳播距離減少了0.5 m。經(jīng)過定位發(fā)現(xiàn),、、定位于果莢的木質(zhì)化細胞壁; 說明漆酶基因可能也與花藥壁的木質(zhì)化存在關(guān)聯(lián), 從而影響花藥開裂和種子傳播。因此, 我們推測本研究中的6個基因在耐溫材料中可能受到高溫誘導(dǎo), 參與花藥開裂過程。

植物漆酶作為一種多功能的氧化酶[41], 位于木質(zhì)素合成途徑的最后一步, 負責(zé)將不同木質(zhì)素單體交聯(lián)聚合形成多聚物——木質(zhì)素[42]。木質(zhì)素是細胞壁的重要組成部分, 自然條件下, 細胞壁作為植物固有的基本組成部分保證植株生長發(fā)育[12], 是抵御病原菌入侵的天然屏障。在此過程中, 漆酶除了參與木質(zhì)素合成外[43], 還參與類黃酮代謝[44]、創(chuàng)傷修復(fù)[31]等與植物生長發(fā)育和逆境脅迫相關(guān)的過程,并與花藥開裂[13]和抗蟲[23]相關(guān)。綜上所述, 基于的表達模式分析和前期的研究報道, 說明陸地棉中漆酶家族基因是功能豐富的一類基因。本研究結(jié)果可為進一步探索的功能提供一定的指導(dǎo)。

4 結(jié)論

本研究鑒定了陸地棉基因組中的基因家族, 104個GhLAC家族成員分布在24條染色體上。隨機挑選20個基因?qū)Ρ磉_譜數(shù)據(jù)進行驗證, 結(jié)果表明大部分基因的表達趨勢與轉(zhuǎn)錄組相同。對其中6個漆酶基因的表達模式分析發(fā)現(xiàn),和基因啟動子表達部位主要在根毛處或表皮毛處,、、和主要在花器官上表達。結(jié)合前人研究結(jié)果, 我們推測陸地棉漆酶基因可能同樣與纖維發(fā)育或種子發(fā)育相關(guān)。此外,和受創(chuàng)傷誘導(dǎo), 可能參與抗蟲等逆境響應(yīng)過程, 但其調(diào)控機制還需進一步研究。6個基因的熒光定量PCR結(jié)果表明, 在耐溫材料‘84021’中, 高溫脅迫后6個漆酶基因的表達量在四分體時期(TS)和花藥開裂期(ADS)都呈現(xiàn)顯著下調(diào)的趨勢, 推測基因可能負調(diào)控高溫下陸地棉花藥耐受性。本研究結(jié)果為后續(xù)深入解析陸地棉基因的抗蟲功能及高溫響應(yīng)機制提供一定理論指導(dǎo)。

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Relative expression patterns of laccase gene family members in uplandL.

ZUO Chun-Yang**, LI Ya-Wei**, LI Yan-Long, JIN Shuang-Xia, ZHU Long-Fu, ZHANG Xian-Long, and MIN Ling*

National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement / Hubei Hongshan Laboratory, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China

Laccase, a member of the blue copper oxidase protein family, plays an important role in plant lignin synthesis and improving plant resistance to stress. In this study, 104 members of the Laccase gene () family were identified from the upland cottongenome. Phylogenetic tree and tissue expression map were constructed. Twenty genes were randomly selected for qRT-PCR analysis to verify the results of expression heat map. To further explore the role of laccase in cotton, promoter-GUS fusion vectors were transformed into. The detailed expression patterns of six members of the Laccase gene family (,,,,, and) were studied by GUS staining in different tissues during different developmental period of transgenic. To explore the role of laccase in stress, the expression of the six laccase genes was analyzed by cutting and piercing, and the corresponding genes were analyzed by qRT-PCR using the anther of two cotton strains ‘84021’ (high temperature tolerant) and ‘H05’ (high temperature sensitive) at different stages under normal and high temperature conditions. The results showed that 20 randomly selected genes were differentially expressed in six tissues of root, stem, leaf, petal, anther, and stigma, and the relative expression levels of most genes were consistent with the transcriptome data. The promoter of six laccase genes could drivegene expression in different levels at germination, two-leaf, and four-leaf stages. The trauma treatment indicated that the promoter ofandsignificantly improved the ability to drive GUS protein expression in leaves after trauma induction, suggesting that the two genes might be involved in traumatic stress response. In addition, the relative expression levels of the sixgenes were significantly down-regulated after high temperature stress at the tetrad stage and anther dehiscence stage of cotton strain ‘84021’, suggestinggene might negatively regulate the high temperature tolerance of cotton anthers. The results of this study provide the reference for further exploring the function of laccase family genes.

L.; laccase gene; the promoter-GUS expression pattern; anther response to high temperature; wound induced expression

2022-11-02;

2023-02-21;

2023-03-13.

10.3724/SP.J.1006.2023.24246

通信作者(Corresponding author):閔玲, E-mail: lingmin@mail.hzau.edu.cn

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

左春陽, E-mail: 727202632@qq.com

本研究由湖北洪山實驗室重大項目課題(2022hszd004)和國家自然科學(xué)基金項目“GhHRK基因增強棉花花粉高溫耐性的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析” (32072024)資助。

This study was supported by the Major Project of Hubei Hongshan Laboratory (2022hszd004) and the National Natural Science Foundation of China “Regulatory Network Analysis of GhHRK Gene Enhancing Pollen High Temperature Tolerance in Cotton” (32072024).

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20230313.0838.002.html

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