謝海鵬　林櫻桃　吳小燕　林俊旭　林明智　麥賢俊　陳子躍　謝文　孔祥義

關(guān)鍵詞：尖孢鐮刀菌嗜導(dǎo)管專化型；貝萊斯芽孢桿菌；拮抗機制；促生能力

中圖分類號：S436.43 文獻標識碼：A

豇豆[Vigna unguiculata （L.） Walp.]是一年生豆科作物，主要分布在世界干旱、半干旱的熱帶地區(qū)。豇豆起源和馴化于非洲，現(xiàn)已在全世界100多個國家種植[1]。世界上主要的豇豆生產(chǎn)區(qū)是撒哈拉以南的非洲，其中，非洲的尼日利亞、尼日爾和布基納法索的豇豆產(chǎn)量排名世界前三，中國豇豆產(chǎn)量位列世界第16 位[2]。在我國，除高寒地區(qū)外各地均有栽培[3]。尤其在海南三亞地區(qū)，豇豆種植面積已達5340 hm²，出島產(chǎn)量達15 萬t，已經(jīng)成為海南冬季瓜菜南種北運的主要蔬菜之一[4]。

豇豆枯萎病是由尖孢鐮刀菌嗜導(dǎo)管專化型（Fusarium oxysporum f.sp. tracheiphilum）引起的維管束病害，它通過傷口或直接穿透根部，然后在木質(zhì)部定植。被侵染的豇豆植株表現(xiàn)為基部莖腫脹、葉片褪綠、變黃、落葉、枯萎、維管變色和死亡。幾乎在所有豇豆種植區(qū)均有豇豆枯萎病的發(fā)生。在澳大利亞西北部、巴西東北部、非洲的尼日利亞、美國東南部和加利福尼亞州的中央谷地均報道過豇豆枯萎病的發(fā)生[5]。我國主要在廣東、福建、廣西、海南、江西等地為害較多，目前已遍布所有豇豆產(chǎn)區(qū)， 產(chǎn)量損失可高達70%[6]。近年來，由于海南三亞市豇豆多年連作，土壤條件惡化，三亞市豇豆枯萎病大面積流行，發(fā)生嚴重地塊可減產(chǎn)70%～80%，嚴重影響豇豆生產(chǎn)[7]。

目前豇豆枯萎病的防治手段有選育抗病品種、輪作、土壤消毒、控制線蟲、化學防治和生物防治等[8]。國內(nèi)使用最多的防治手段是化學防治，但是由于豇豆長期使用化學農(nóng)藥，近年來國內(nèi)豇豆農(nóng)藥殘留超標等問題頻繁發(fā)生[9-10]。利用微生物防治土傳病害是近年來的熱點。微生物不僅可以生活在土壤中與病原菌形成長期對抗，降低病害發(fā)生，而且能減少農(nóng)藥的使用量，預(yù)防農(nóng)藥殘留的風險發(fā)生[11]。目前，用于防治植物病害的微生物主要有真菌、細菌和病毒等，而細菌因其數(shù)量和種類眾多，廣泛分布于植物根際和地面上部，具有對植物生長環(huán)境適應(yīng)性強、繁殖速度快和易培養(yǎng)等特點成為最主要的生防資源之一[12]?，F(xiàn)已成功應(yīng)用于植物病害防治的生防細菌主要有芽孢桿菌屬（ Baccillus ）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、沙雷氏菌屬（Serratia）、巴氏桿菌屬（Pasteuria）以及腸桿菌屬（Enterobacteri）等[13]。

近年來，越來越多的學者開展了篩選拮抗細菌防治植物枯萎病的研究并取得成果。李娜等[14]從黃瓜枯萎病根際土篩選生防細菌，獲得1 株對黃瓜枯萎病菌有較強抑制作用的假單胞屬菌株33-1。周東興等[15]利用梯度稀釋涂板法和平板對峙生長法從蚯蚓糞中篩選到1 株對番茄枯萎病有良好生防作用的細菌，并通過盆栽試驗測定該菌株對番茄枯萎病的防治效果達59.25%。此外，鄭麗等[16]從8 個不同生境木薯中分離到298 株細菌，通過測定其產(chǎn)酶、次生代謝物和拮抗活性優(yōu)選11 個菌株進行日光溫室大棚盆栽防效測定，其中，HWY-3-1 對木薯枯萎病防效為100%，其余10 株防效均在60%以上。而國內(nèi)外有關(guān)豇豆枯萎病生防資源的報道較少，從豇豆-水稻輪作土壤中篩選生防細菌是挖掘豇豆枯萎病生防資源的主要途徑之一。

本研究通過分離純化豇豆-水稻輪作土壤細菌，采用對峙法評價其生防潛力，對其中拮抗效果最好的菌株SD13 通過形態(tài)學及分子手段進行鑒定，初步探究該生防菌的抑菌以及促生機制，最后通過盆栽實驗評估不同濃度的生防菌SD13對豇豆枯萎病的防治效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試豇豆枯萎病病原菌由海南省三亞市熱帶農(nóng)業(yè)科學研究院提供。供試豇豆種子南豇1 號。土壤樣品采自海南省三亞市崖州區(qū)的熱水宮路常年發(fā)病地塊，采集豇豆-水稻輪作土壤15 份。盆栽自然土采自海南省三亞市熱帶農(nóng)業(yè)科學研究院崖州基地種子資源圃。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 蛋白質(zhì)檢測培養(yǎng)基[17]：脫脂奶粉3.0 g、瓊脂4 g、去離子水200 mL、pH 為7.0～7.2，108 ℃高壓蒸氣滅菌15 min。

幾丁質(zhì)酶檢測培養(yǎng)基[18]：膠體狀幾丁質(zhì)1%（w/V）、磷酸二氫銨1 g、氯化鉀0.2 g、硫酸鎂0.2 g、瓊脂20 g，無菌水定容至1000 mL，pH 為7。制備膠狀幾丁質(zhì)：20 g 甲殼素溶于350 mL 濃鹽酸，4 ℃放置24 h，玻璃棉過濾，濾液加入2 L冰無水乙醇–20 ℃ 過夜后， 10 000 r/min 離心20 min，沉淀用流動自來水不斷沖洗，直至pH 呈中性，–20 ℃密封保存。

β-1，3-葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基[19]：β-1，3-葡聚糖2 g、硝酸鈉2 g、磷酸氫二鉀1 g、氯化鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、剛果紅0.05 g、瓊脂20 g，無菌水定容至1000 mL，pH 為7.2。

纖維素酶檢測培養(yǎng)基[18]：羧甲基纖維素鈉10 g、蛋白胨10 g、酵母粉10 g、氯化鈉5 g、磷酸二氫鉀1 g、瓊脂20 g，無菌水定容至1000 mL，pH 為7.0。

無氮培養(yǎng)基[20]：蔗糖10 g、氯化鈉0.12 g、硫酸氫二鉀0.5 g、碳酸鈣1 g、硫酸鎂0.2 g、瓊脂20 g，無菌水定容至1000 mL，pH 為7.2。

鉀長石培養(yǎng)基[21]：硫酸銨1.0 g、七水硫酸鎂0.5 g、氯化鈉0.1 g，硫酸氫二鈉2.0 g，蔗糖10 g，酵母粉0.5 g，鉀長石粉10.0 g，無菌水定容至1000 mL，pH 為7.2。

無機磷培養(yǎng)基[21]：硫酸銨0.5 g、七水硫酸鎂0.5 g、氯化鈉0.2 g、磷酸鈣10.0 g、碳酸鈣0.5 g、葡萄糖2.0 g、硫酸錳0.02 g、硫酸亞鐵0.02 g、瓊脂20 g，無菌水定容至1000 mL，pH 為7.2。

有機磷培養(yǎng)基[21]：硫酸銨0.5 g、碳酸鈣0. 5g、七水硫酸鎂0.5 g、氯化鈉0.2 g、卵磷脂0.2 g、葡萄糖2.0 g、硫酸錳0.02 g、硫酸亞鐵0.02 g、瓊脂20 g，無菌水定容至1000 mL，pH 為7.2。

嗜鐵素檢測培養(yǎng)基：北京酷來博科技有限公司改良的CAS 瓊脂檢測培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 土壤細菌分離 采集未患枯萎病的豇豆-水稻輪作土壤，采用稀釋涂板法[22]分離土壤細菌。從15 份土壤中各稱取10 g 土壤樣品，10 g土壤樣品與90 mL 無菌水混合，振蕩30 min，靜止15 min，將上清液依次稀釋為10^–3、10^–4、10^–5和10^–6，然后各取100 μL 上清液涂布于LB 培養(yǎng)基平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d，挑取不同形態(tài)的細菌菌落劃線純化，于–20 ℃冰箱保存。

1.2.2 拮抗菌的初篩與復(fù)篩 以豇豆枯萎病病原菌作為對照菌株，采用平板對峙法[23]對

1.2.1 中保存的菌株進行初篩，在PDA 固體培養(yǎng)基平板中央接種0.5 cm 豇豆枯萎病菌菌餅，每個培養(yǎng)基平板用十字對稱選取4 個距離中央2.5 cm 的點，在4 個點用牙簽點接分離純化保存的同一菌株，對具有拮抗效果的菌株用同樣的方法進行復(fù)篩并保存。采用十字交叉法測量菌落直徑。抑制率=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對照組菌落直徑×100%。

1.2.3 生防菌SD13 的鑒定 （1）菌體形態(tài)觀察。將拮抗菌株SD13 在LB 培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，于30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后觀察菌落形態(tài)，革蘭染色后顯微鏡觀察菌體形態(tài)特征。

（2）分子鑒定。通過北京諾博萊德科技有限公司細菌DNA 提取試劑盒提取拮抗菌株SD13 的DNA， 采用16S rDNA 細菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對拮抗菌株SD13 進行PCR 擴增。50 μL 反應(yīng)體系：DNA 模板1 μL、引物1492R 和27F 各1 μL、Taq 酶25 μL、ddH₂O 22 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 min，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)，最后72 ℃總延伸10 min。PCR 擴增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序結(jié)果通過Ezbicloud 數(shù)據(jù)庫進行同源序列比對分析，選取同源性較高的菌株通過MEGA 6.06 軟件使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 制備10⁹CFU/mL SD13 菌懸液 將LB 平板中的SD13 單菌落接種至LB 液體培養(yǎng)基中，29 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)24 h 得到菌懸液，以1%接種量接種至LB 培養(yǎng)基中，于29 ℃、180 r/min 條件下發(fā)酵24 h 后，將菌懸液稀釋成OD600=2.3，得到10⁹CFU/mL SD13 菌懸液（菌懸液的OD600 為2.3 稀釋涂板法后，計算其菌落個數(shù)為1×10⁹～2.5×10⁹CFU/mL，3 次重復(fù)）。本研究中制備10⁹CFU/mL SD13 菌懸液均用此方法。

1.2.5 拮抗菌株SD13 對豇豆枯萎病病原菌菌絲與孢子的抑制效果 參考林福呈等[24]的液體共培養(yǎng)測定方法，稍加改進，將病原菌接種于PDA液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)7 d，再用無菌水稀釋培養(yǎng)物，使培養(yǎng)物的孢子數(shù)量為108 CFU/mL，培養(yǎng)物中的菌絲無需過濾。然后取10 mL 培養(yǎng)物接種到100 mL PDA 液體培養(yǎng)基中，使孢子總數(shù)為10⁹CFU/mL，再接1 mL 10⁹CFU/mL SD13 菌懸液，使SD13 菌量與病原菌孢子數(shù)量一致，置于28 ℃恒溫箱培養(yǎng)，3 次重復(fù)。以10 mL 病原菌培養(yǎng)物+1 mL LB 作為對照。間隔12 h 觀察一次拮抗菌對孢子和菌絲抑制作用，并拍照記錄。

1.2.6 生防菌SD13 菌體和發(fā)酵濾液對豇豆枯萎病病原菌孢子的抑制能力 制備病原菌孢子懸浮液：將病原菌接種于PDA液體培養(yǎng)基中，在28 ℃，200 r/min 條件下培養(yǎng)7 d，并用8 層無菌紗布過濾菌絲。用血球計數(shù)板計算孢子數(shù)量，并將孢子數(shù)量用無菌水稀釋至5×10⁷CFU/mL。

制備SD13 菌體懸浮液：將制備的10⁹CFU/mLSD13 菌懸液（含發(fā)酵液）以10 000 r/min 離心15 min，將菌體與發(fā)酵液分開，再用等體積的無菌水重懸浮菌體，獲得濃度為10⁹CFU/mL 的菌體懸浮液，備用。

制備發(fā)酵濾液：將離心得到的發(fā)酵液通過0.22 μm 無菌微孔濾膜過濾2 次，備用。

搖勻菌體懸浮液與病原菌孢子懸浮液，使菌體與孢子在液體中分布均勻，取1 mL 10⁹CFU/mL菌體懸浮液和1 mL 5×10⁷CFU/mL 病原菌孢子懸浮液于5 mL 無菌試管中，以1 mL 無菌水加等量的病原菌孢子懸浮液作為對照。再取1 mL 無菌發(fā)酵液和1 mL 5×10⁷CFU/mL 病原菌孢子懸浮液于另一個5 mL 無菌離心管中，以1 mL LB 液體培養(yǎng)基加等量病原菌孢子懸浮液作為對照。重復(fù)3 次，28 ℃恒溫箱培養(yǎng)。分別于0、12、24、48 h用血球計數(shù)板觀察處理組與對照組的完整孢子數(shù)量。

1.2.7 生防菌SD13 抑菌胞外酶活性測定 蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶活性測定[17-19]：菌株在LB 固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)24 h，再用滅菌接種針挑取單菌落分別點接于蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3～7 d，觀察周圍有無透明圈產(chǎn)生并測量菌落直徑（d）和透明圈直徑（D）。根據(jù)培養(yǎng)基上是否產(chǎn)生透明圈判斷有無酶活性，酶活性大小與HC值（D/d）呈正相關(guān)。

纖維素酶活性測定[18]：菌株在LB 固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)24 h，再用滅菌接種針挑取菌落點接于纖維素酶活性檢測培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，用1 mg/mL 剛果紅溶液將整個培養(yǎng)皿完全浸沒染色，染液停留30 min，倒掉染液，用1 mol/L NaCl 溶液洗滌。觀察測量方法同上。

1.2.8 生防菌SD13的促生能力相關(guān)功能檢測固氮能力測定：參考王明歡等[20]的方法，根據(jù)菌株是否能在無氮培養(yǎng)基上生長判斷有無固氮能力。

溶磷、解鉀能力的測定[21]：菌株在LB 平板培養(yǎng)基上活化24 h，再用滅菌接種針挑取菌落分別點接于有機磷培養(yǎng)基、無機磷培養(yǎng)基和鉀長石培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3～7 d，觀察測量方法同1.2.7。

產(chǎn)嗜鐵體能力測定：菌株在LB 固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)24 h，再用滅菌接種針將單菌落點接于嗜鐵素檢測培養(yǎng)基平板上，觀察7～14 d。鉻天青（CAS）和溴化十六烷基三甲銨（HDTMA）與鐵離子混合后可以形成一種復(fù)合物，呈亮藍色。當鐵離子被試驗菌株分泌嗜鐵素奪走時，菌株周圍形成橘黃色的透明圈。因此，可根據(jù)平板上菌落周圍是否形成橘黃色的透明圈和根據(jù)透明圈大小判斷產(chǎn)嗜鐵素的強弱。

IAA 定性測定：參考萬兵兵等[25]的方法，產(chǎn)IAA 能力可根據(jù)白瓷板上溶液顏色是否變紅，如果顏色變色就表示菌株能夠產(chǎn)生IAA。

1.2.9 生防菌SD13 廣譜抑菌能力測定 測定拮抗菌株SD13 對6 種生產(chǎn)上重要病害病原菌[青瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、辣椒枯萎病菌（F. oxysporum）、甜瓜枯萎病菌（F. oxysporum）、苦瓜枯萎病菌（ F. solani ）、豇豆葉斑病菌（ Alternaria alternata ）、煙草疫霉病菌（Phytophthora nicotianae）]的抑制率。

拮抗菌株SD13 的菌餅制備：在LB 固體培養(yǎng)基平板中加入200 μL 109 CFU/mL SD13 菌懸液，均勻涂布，于30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，制成菌株平板，用打孔器取0.5 cm 的拮抗菌株菌餅，備用。

采用平板對峙法在PDA 固體培養(yǎng)基平板中央接種0.5 cm 病原菌菌餅，用十字對稱選取4 個距離中央2.5 cm 的點，放置0.5 cm 的SD13 菌餅，以只接病原菌菌餅作為對照，于28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑制率，公式同1.2.2。

1.2.10 SD13 盆栽防效及促生實驗 豇豆種子處理：將豇豆種子用3%次氯酸鈉消毒10 min，然后用蒸餾水反復(fù)清洗3～5 遍，晾干后置于含有椰糠育苗盤中，在溫室大棚培育2 周后，原葉完全展開，取長勢優(yōu)良且一致的幼苗用于實驗。土壤處理：自然土經(jīng)曬干，過篩與營養(yǎng)土2∶1 質(zhì)量比混合，備用。

生防菌SD13 無發(fā)酵液菌體懸浮液制備：將制備的10⁹CFU/mL SD13 菌懸液8000 r/min 離心，收集菌體，再用200 mL 無菌水重懸菌體，獲得濃度為10⁹CFU/mL 的無發(fā)酵液菌體懸浮液，用無菌水配置濃度為10⁸、10⁶、10⁴CFU/mL 無發(fā)酵液菌體懸浮液，備用。

豇豆枯萎病病原菌孢子懸浮液制備：將在PDA平板上生長3 d 的菌落接種至200 mL 的PDA液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)5 d后用無菌8 層紗布過濾，獲得孢子懸浮液，再用無菌水稀釋至106 CFU/mL，備用。

盆栽防效實驗中生防菌共設(shè)置4 個濃度：10⁹、10⁸、10⁶、10⁴CFU/mL。取1 kg 土裝至盆鉑中，10 個處理：（1）病原菌處理+生防菌10⁴CFU/mL（F+10⁴S）、（2）病原菌處理+生防菌10⁶CFU/mL（F+10⁶S）、（3）病原菌處理+生防菌10⁸CFU/mL（F+10⁸S）、（4）病原菌處理+生防菌109 CFU/mL（F+109S）、（5）病原菌對照（F）、（6）生防菌10⁴CFU/mL（10⁴S）、（7）生防菌10⁶CFU/mL（10⁶S）、（8）生防菌10⁸CFU/mL（10⁸S）、（9）生防菌10⁹CFU/mL（10⁹S）、（10）清水對照（CK）。

其中，病原菌處理：取100 mL 豇豆枯萎病病原菌孢子懸浮液與200 mL 無菌水混合后拌土，充分攪拌混勻，土壤含菌量為105 CFU/g。其他處理則用等體積的清水混拌。將豇豆植株的根尖處切除0.3 cm 進行傷根移植。移植后，每周對F 和CK 處理用55 mL 清水處理，其他處理取5 mL 生防菌與50 mL 清水混合灌根。每個處理3 個重復(fù)，每個重復(fù)2 株苗，3 個平行實驗，觀察并記錄發(fā)病情況，計算發(fā)病率、病情指數(shù)、防治效果。豇豆苗期的病情分級標準參照文獻[1]，豇豆苗后期到抽蔓期的病情分級標準參照文獻[5]。測量其株高、根長、地上鮮重、地下鮮重、地上干重、地下鮮重，評價其促生作用。發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)×100%；病情指數(shù)=Σ（各級病株數(shù)×該病級值）/（總株數(shù)×最高級值）×100；防治效果=（CK 病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/CK 病情指數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤細菌的分離純化

從海南省三亞市崖州區(qū)常年發(fā)病嚴重的5 塊地塊采集土壤樣本15 份，從中分離到93 株菌，其中63 株細菌，30 株放線菌。

2.2 拮抗菌的初篩與復(fù)篩

用平板對峙法對分離純化的菌株進行初篩和復(fù)篩，篩選得到11 株對豇豆枯萎病有較好抑制作用的菌株（表1），其中菌株SD13 抑制率為82.0%，抑制效果最好（圖1A）。

2.3 生防菌SD13的鑒定

2.3.1 形態(tài)學鑒定 拮抗菌SD13 在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，呈淺乳白色、近圓形、表面粗糙邊緣不規(guī)則（圖1A～圖1B）。經(jīng)革蘭氏染色，將SD13鑒定為革蘭氏陽性菌（圖1C）。

2.3.2 分子鑒定 測序結(jié)果顯示，拮抗菌株SD13的16S rDNA 序列長度為1452 bp，在Ezbicloud數(shù)據(jù)庫同源序列對比結(jié)果中，菌株SD13 的16SrDNA 序列與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）CR-502（登錄號：AY603658）相似性為99.5%（圖2），從Ezbicloud 數(shù)據(jù)庫中挑選12 株具有代表性的序列相似菌株以及1 株外源菌株P(guān)aenibacillusselenitireducens ES3-24（登錄號：KC815539.1）與SD13 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)菌株SD13 與B.velezensis CR-502 單獨聚為一支。結(jié)合形態(tài)學，將菌株SD13 鑒定B. velezensis。

2.4 生防菌SD13 對豇豆枯萎病病原菌菌絲和孢子的抑制效果

液體共培養(yǎng)實驗結(jié)果表明，菌株SD13 對尖孢鐮刀菌菌絲、孢子均有很強的溶菌作用。圖3為病原菌菌絲的溶解過程。圖3A 為只添加病原菌的對照處理，病原菌菌絲正常，24 h 后觀察到添加SD13 的處理部分病原菌菌絲發(fā)生膨大、畸形、基質(zhì)外泄（圖3B），120 h 菌絲全部被溶解，僅剩少量無內(nèi)容物菌絲（圖3C）。圖4 為孢子的溶解狀態(tài)。

2.5 生防菌SD13 菌體與發(fā)酵濾液對豇豆枯萎病病原菌孢子的抑制能力

研究結(jié)果表明，在菌體處理0～12 h，豇豆枯萎病病原菌孢子數(shù)量下降64.5%，48 h 時比0 h下降86.6%。發(fā)酵濾液處理0～12 h，豇豆枯萎病病原菌孢子數(shù)量下降34.4%，48 h 相對0 h 下降27.2%（表2）。說明生防菌SD13 菌體與發(fā)酵濾液均能溶解豇豆枯萎病病原菌孢子，但SD13 菌體的溶解能力比SD13 發(fā)酵濾液更強。

2.6 生防菌SD13的抑菌胞外酶活性檢測

檢測結(jié)果表明（圖5），生防菌SD13 具有產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶、β-1，3-葡聚糖酶的能力，β-1，3-葡聚糖酶的HC 值是蛋白酶、纖維素酶的4～6 倍（表3），說明SD13 分泌β-1，3-葡聚糖酶活性更高。

2.7 SD13促生因子檢測

檢測結(jié)果顯示（圖5，表3），SD13 在嗜鐵素與解無機磷檢測培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈，可以在無氮培養(yǎng)基上生長，說明SD13 具有產(chǎn)嗜鐵素、解無機磷、固氮能力。

2.8 生防菌SD13的廣譜抑菌活性測定

平板對峙實驗結(jié)果表明，菌株SD13 對6 種病原菌的抑制率在66.7～82.3%之間（表4，圖6）。說明菌株SD13 具有廣譜抑菌活性，且抑菌能力較強。

2.9 不同濃度生防菌SD13的促生及防治效果

盆栽實驗結(jié)果表明（表5，圖7），SD13 的各濃度處理對豇豆植株均具有較強的促生能力，能加快植株生長，表現(xiàn)為植株增高，葉片增大（圖7A）。由表5 可知，108S 處理的促生能力最好，與其他處理具有較強顯著差異。109S 處理的促生效果較差，處理植株在幼苗期間生長緩慢，植株矮小，莖根細小，植株進入抽蔓期后恢復(fù)促生生長，35 d 后植株各生長指標相對CK 較高。

在實驗觀察期間，F(xiàn) 處理的病情指數(shù)隨時間逐漸升高，施用生防菌4 個處理的病情指數(shù)增長緩慢，并且在28～35 d 停止增長（圖7B），說明多次施用生防菌SD13 可以持續(xù)有效控制豇豆枯萎病病情的發(fā)展。14 d 后，F(xiàn) 處理的豇豆植株開始發(fā)病，原生葉片開始變黃、掉落，基莖腫脹，植株發(fā)育不良，發(fā)病率為80%。F+10⁴S、F+10⁶S、F+10⁸S 與F+10⁹S 處理的豇豆植株發(fā)病率分別為40%、30%、80%、80%。35 d 后，F(xiàn) 處理的發(fā)病率達到100%，施用生防菌的4 個處理發(fā)病率均無增長。如圖7C 所示，F(xiàn)+10⁶S 防治效果為62.0%，具有顯著差異，是最佳防治濃度。

綜合防治效果與促生能力認為，生防菌SD13的最佳施用濃度為106 CFU/mL，其防治效果最好，而促生效果僅次于108 CFU/mL。

3 討論

國內(nèi)豇豆枯萎病的防治主要依賴化學防治，微生物防治的相關(guān)報道較少，尤其是生防細菌，國內(nèi)外報道甚少。本研究通過從土壤中篩選11 株拮抗細菌，對抑制率最強的拮抗菌株SD13 進行形態(tài)學鑒定與分子鑒定，該菌株鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。貝萊斯芽孢桿菌SD13 對豇豆枯萎病菌尖孢鐮刀菌的菌絲、孢子具有很強的溶解作用，同時可以產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶、β-1，3-葡聚糖酶3 種抑菌胞外酶，并具有產(chǎn)嗜鐵素、固氮、解無機磷3 種促生功能，抑菌廣譜。經(jīng)盆栽實驗證明貝萊斯芽孢桿菌SD13 對豇豆枯萎病具有良好的防治效果，并對豇豆植株具有較強的促生能力。貝萊斯芽孢桿菌SD13 是一株有潛力的生防細菌，有望成為防治豇豆枯萎病的重要生防資源。

貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）的一個新種，因具有廣譜抑菌活性和促進植物生長等特點而被廣泛研究[26-27]。已有研究表明，貝萊斯芽孢桿菌對小青菜、香蕉、番茄等有促生長作用，能抑制植物病原稻瘟病菌、黃瓜枯萎病菌、辣椒疫霉菌、橡膠炭疽菌、香蕉枯萎病菌等病菌的生長[28-31]。

糖蛋白和葡聚糖是尖孢鐮刀菌細胞壁的主要成分，也是大部分真菌細胞壁的主要成分[32]。據(jù)報道，貝萊斯芽孢桿菌可以通過分泌的蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶等胞外水解酶抑制病原菌[33]，貝萊斯芽孢桿菌HYEB5-6 通過分泌蛋白酶和葡聚糖酶破壞炭疽菌菌絲細胞壁，抑制分生孢子的萌發(fā)、胚芽管的生長和附著胞的形成[34]，尤其是β-1，3-葡聚糖酶，廣泛存在于高等植物中，可以降解真菌細胞壁，對植物防御致病真菌起到重要作用[35]。本研究中SD13 對尖孢鐮刀菌的菌絲、孢子溶解主要是由蛋白酶、β-1，3-葡聚糖酶破壞其細胞壁導(dǎo)致的。

氮、磷、鉀是植物生長的必需元素，能夠促進植物健康發(fā)育，提高作物產(chǎn)量。作物缺氮、磷會導(dǎo)致作物生長緩慢。研究表明，接種固氮菌株巨芽孢桿菌（B. megaterium）N3 能夠促進二月蘭生長，同時土壤的理化性質(zhì)與生物學性質(zhì)均得到顯著改善[36]。解磷細菌貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）CBMB205 的19 個磷酸酶基因均參與使土壤中難以利用的磷轉(zhuǎn)化為植物易吸收的磷[37]。在本研究中，SD13 能夠解無機磷、固氮，對豇豆具有較強的促生能力。此外，SD13 具有較強的產(chǎn)嗜鐵素能力，嗜鐵素（siderophore）也叫高鐵載體，能特異地螯合含鐵離子的化合物使SD13 在低鐵環(huán)境中與病原菌競爭鐵元素，抑制病原菌的發(fā)展，也能將難溶的鐵轉(zhuǎn)化為易溶的鐵供植物吸收，促進植物生長[38-41]。

經(jīng)盆栽實驗表明，不同濃度SD13 均具有防治豇豆枯萎病和促進豇豆植株生長的作用，并不是濃度越高效果越好，10⁶CFU/mL 為最佳防治濃度，而10⁸CFU/mL 是最佳促生濃度，濃度為10⁹ CFU/mL 時，豇豆幼苗生長受到抑制，但這種抑制是短暫的，豇豆植株會在抽蔓期恢復(fù)促生生長。研究顯示，多次施用生防菌SD13 可以持續(xù)有效控制豇豆枯萎病病情發(fā)展，因此，在施用SD13 防治枯萎病時建議少量多次。研究發(fā)現(xiàn)SD13 具有溶菌作用，在防治病害時，溶菌作用與促生共同起作用，在接種SD13 后，SD13 產(chǎn)生的蛋白酶、蛋白酶溶解致病菌細胞壁，減少病原菌數(shù)量。同時，SD13 具有促生作用，提高植株的品質(zhì)，加強抗病能力，在二者作用下，從而控制病害的發(fā)展，達到防治效果。