彭存智　常麗麗　王丹　黃超　徐兵強(qiáng)　仝征

關(guān)鍵詞：香蕉枯萎?。粌?nèi)源啟動(dòng)子；分泌表達(dá)載體；Six1d 蛋白

中圖分類號(hào)：S436.68 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

香蕉枯萎病是危害香蕉產(chǎn)業(yè)的重要病害，而尖孢鐮刀菌古巴營(yíng)養(yǎng)?；停‵usarium oxysporumf.sp. cubense， Foc）是引起這種病害的病原真菌，可導(dǎo)致香蕉嚴(yán)重減產(chǎn)，甚至絕收。根據(jù)對(duì)不同香蕉品系的致病性Foc 可細(xì)分為4 個(gè)生理小種，包括1 號(hào)小種（race 1，F(xiàn)oc1）、2 號(hào)小種（race 2，F(xiàn)oc2）、3 號(hào)小種（race 3，F(xiàn)oc3）和4 號(hào)小種（race4，F(xiàn)oc4），其中Foc4 具有廣泛的寄主范圍，根據(jù)病害發(fā)生是否受冷害脅迫以及發(fā)生的地理區(qū)域可進(jìn)一步區(qū)分為熱帶4 號(hào)小種（tropical race 4，F(xiàn)oc TR4）和亞熱帶4 號(hào)小種（subtropical race 4，F(xiàn)oc STR4）[1-3]。Foc TR4 在所有生理小種中致病性最強(qiáng)對(duì)我國(guó)南方香蕉主產(chǎn)區(qū)危害最大，尤其對(duì)Cavendish 系列香蕉有致命的侵害作用[3] 。Cavendish 香蕉是國(guó)內(nèi)目前栽培面積最大、產(chǎn)量最多的品種群，但市場(chǎng)歡迎度較高的一些品種（如巴西蕉等），對(duì)Foc TR4 極度易感[4]。通過(guò)引進(jìn)和自選獲得的一些抗枯萎病栽培品種（如南天黃等）雖然對(duì)Foc TR4 具有一定的抗性，但這類抗病性易受環(huán)境影響，且植株的發(fā)病率會(huì)隨著土壤中Foc TR4 孢子含量的增加而顯著上升[5]。因此，加強(qiáng)對(duì)香蕉枯萎病抗感病機(jī)制研究將有助于培育香蕉枯萎病抗性新品種。病原菌在侵染寄主植物致病的過(guò)程中，會(huì)分泌一系列蛋白質(zhì)、酶和毒素阻止植物的防御反應(yīng)，從而有利于自身的生存和繁殖[6-7]，而植物免疫系統(tǒng)可通過(guò)識(shí)別某些分泌蛋白來(lái)產(chǎn)生抗病性[8]。在Foc 的研究中，人們通過(guò)觀察攜帶真菌表達(dá)載體pCT74 的Foc1 和Foc TR4侵染香蕉根部的過(guò)程，已經(jīng)闡釋了一些Foc 的致病機(jī)制[9]。

研究發(fā)現(xiàn)，絲狀真菌在表達(dá)某些內(nèi)源基因時(shí)的產(chǎn)量特別高，表明絲狀真菌基因組中存在強(qiáng)啟動(dòng)子，能夠驅(qū)動(dòng)內(nèi)源基因的高效表達(dá)[10-11]。使用內(nèi)源強(qiáng)啟動(dòng)子有利于在體內(nèi)高效、穩(wěn)定、特異地表達(dá)外源目標(biāo)基因[12]。已報(bào)道的絲狀真菌啟動(dòng)子有瑞氏木霉纖維二糖水解酶基因（cellobiohydrolase，cbh1）啟動(dòng)子，構(gòu)巢曲霉的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gpdA）啟動(dòng)子，曲霉葡糖淀粉酶基因（glucoamylase，glaA）啟動(dòng)子[13]，橡膠樹(shù)白粉菌（HO-73）啟動(dòng)子[14]等。本研究團(tuán)隊(duì)前期已將Foc1 高豐度分泌表達(dá)蛋白secreted in xylem 1d（Six1d）[15]的N 端分泌信號(hào)肽連接至常用真菌表達(dá)載體pCT74 中，構(gòu)建了新型真菌分泌載體p74HSP- EGFP，該載體可將綠色熒光蛋白EGFP 分泌至Foc TR4 菌體外，并在Foc TR4 菌株侵染香蕉過(guò)程中將EGFP 蛋白分泌到香蕉根部[16]。為了能在Foc 菌株中更高效表達(dá)內(nèi)源基因，本研究在已有的p74HSP- EGFP載體基礎(chǔ)上，克隆到Foc1 Six1d 基因的啟動(dòng)子，并替換p74HSP-EGFP 載體中的ToxA 啟動(dòng)子，將p74HSP-EGFP 進(jìn)一步改造為由Foc 內(nèi)源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的分泌表達(dá)載體。通過(guò)比較ToxA 啟動(dòng)子和Six1d啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)綠色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度以及表達(dá)豐度，證明Six1d 啟動(dòng)子在Foc 中的表達(dá)活性比ToxA啟動(dòng)子高，為后續(xù)研究Foc 致病相關(guān)蛋白或抗病相關(guān)外源蛋白在香蕉枯萎病中的作用機(jī)理提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 Foc1 由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所曾會(huì)才博士提供，F(xiàn)oc TR4 由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所周登博博士提供， 非分泌型真菌表達(dá)轉(zhuǎn)化菌株FocTR4-HPG 由本實(shí)驗(yàn)室保存。用于載體構(gòu)建的大腸桿菌菌株DH5α 購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司。

1.1.2 質(zhì)粒 真菌表達(dá)載體p74HSP-EGFP 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存[9]，該載體含有潮霉素B 磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（ hygR ） ， 增強(qiáng)型綠色熒光基因（EGFP），來(lái)源于小麥黃斑病菌（Pyrenophoratritici-repentis）的ToxA 啟動(dòng)子[17]，以及來(lái)源于Foc1 的Six1d 蛋白分泌信號(hào)肽。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑 LB 培養(yǎng)基：10 g/L NaCl，10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母提取物；土豆液體培養(yǎng)基（PDB）：200 g 土豆切絲，加水煮沸15～20 min，紗布過(guò)濾，加入20 g 蔗糖，定容到1 L，高溫滅菌；土豆瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：PDB 中添加9 g/L 瓊脂粉；液體再生培養(yǎng)基：PDB 中添加274 g/L 蔗糖；固體再生培養(yǎng)基：液體再生培養(yǎng)基中添加9 g/L 瓊脂粉；鉀鹽液體培養(yǎng)基（KK）：1.0 g/L K₂HPO₄， 0.5 g/L KCl， 0.5g/L MgSO₄·7H₂O，0.01 g/L Fe-Na EDTA， 2.0 g/L 天門冬酰胺和10.0 g/L D-半乳糖，pH 5.0；溶酶液：0.1 mol/LNaH₂PO₄， 0.8 mol/L NaCl，pH 5.8；酶解液：10 mg/mL 崩潰酶（Drislase， Sigma），10 mg/mL溶壁酶（Lysing Enzyme， Sigma），加入溶酶液，80 r/min 搖床振蕩溶解30 min，過(guò)濾除菌。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化相關(guān)試劑：0.8 mol/L NaC1 溶液；STC 溶液：1.2 mol/L Sorbitol，10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），50 mmol/L CaCl₂，過(guò)濾除菌；60% PTC 溶液：STC溶解PEG4000 配制成60%溶液，過(guò)濾除菌。

1.2 方法

1.2.1 真菌基因組DNA 的提取 取直徑約5 mm的真菌菌盤接種到20 mL 的PDB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min 震蕩培養(yǎng)3 d，過(guò)濾收集菌絲。分別稱取100 mg 菌絲到2 mL 離心管中，置于液氮中冷凍2 min，用高速組織研磨儀破碎菌絲（Servicebio， China），最后用植物基因組DNA提取試劑盒（Tiangen， China）進(jìn)行真菌基因組DNA 的提取。

1.2.2 Six1d 啟動(dòng)子的擴(kuò)增 根據(jù)Foc1 基因組測(cè)序序列（GenBank No. KB730415.1）中Six1d 基因上游序列設(shè)計(jì)特異引物對(duì)（表1），以Foc1 基因組DNA 為模版，通過(guò)PrimeSTAR Max DNA Polymerase（Takara， Japan）擴(kuò)增Six1d 啟動(dòng)子，反應(yīng)條件為：94 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，共32 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 pSix1d74HSPG 載體的構(gòu)建，測(cè)序和啟動(dòng)子元件分析 p74HSP-EGFP 載體的ToxA 啟動(dòng)子區(qū)域通過(guò)Hind Ⅲ酶切后補(bǔ)平，再用Cla I 酶切，切除ToxA 啟動(dòng)子。將擴(kuò)增獲得的Six1d 啟動(dòng)子序列片段同樣用ClaⅠ酶切，連接進(jìn)p74HSP-EGFP載體片段中，構(gòu)建得到完整的載體pSix1d74-HSPG。載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，寄送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交到http：//bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/，進(jìn)行啟動(dòng)子元件在線分析。

1.2.4 原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化 主要參考黃東杰等[18]的方法，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)母牧?。接種Foc TR4 菌株到20 mL PDB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)3～4 d。3 層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾菌液，濾液轉(zhuǎn)移到100 mL PDB 中擴(kuò)大培養(yǎng)10～12 h。3 層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾菌液收集菌絲，無(wú)菌水沖洗2 遍，0.8 mol NaCl 溶液沖洗2 遍。菌絲轉(zhuǎn)移到250 mL無(wú)菌三角瓶中，稱重，按照每0.2 g 菌絲加入10 mL酶解液的比例進(jìn)行酶解，28 ℃，80 r/min 搖床避光酶解3.5 h。酶解的菌液用5 層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾，預(yù)冷0.8 mol NaCl 溶液沖洗并收集到50 mL 離心管中，4 ℃，5000 r/min 離心15 min。棄上清，加入5 mL 預(yù)冷的STC 溶液重懸，4 ℃，5000 r/min離心15 min。棄上清，加入適量的STC 溶液重懸，使原生質(zhì)體濃度至約1×10⁸CFU/mL。按照200 μL原生質(zhì)體、50 μL 質(zhì)?；駾NA （5～10 μg）、50 μLPTC 的順序加入15 mL 離心管中，混勻后冰浴30 min。加入2 mL PTC，混勻后室溫放置20 min。加入3 mL 液體再生培養(yǎng)基，混勻后28 ℃，光照靜置培養(yǎng)12～14 h。5000 r/min 離心15 min，棄上清4 mL，剩余菌液重懸后轉(zhuǎn)入40 mL 融化的固體再生培養(yǎng)基（45～55 ℃）中，混勻后倒入9 mm 培養(yǎng)皿，凝固后再倒入含100 μg/mL 潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基。3～5 d 后長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)至新的含100 μg/mL 潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行再次篩選。重復(fù)轉(zhuǎn)接3～4 次，以獲得性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化菌株。

1.2.5 真菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化菌株的鑒定 轉(zhuǎn)化菌株接種到20 mL 含100 μg/mL 潮霉素B 的PDB 中，28 ℃，200 r/min 震蕩培養(yǎng)3 d，按照前面所述方法收集菌絲并提取真菌基因組DNA。根據(jù)EGFP 基因序列設(shè)計(jì)特異引物對(duì)（表1），通過(guò)PCR 反應(yīng)檢測(cè)攜帶EGFP 基因的真菌表達(dá)載體是否成功導(dǎo)入Foc TR4。反應(yīng)條件為94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃60 s，共32 個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物為646 bp DNA 片段。

1.2.6 菌液的顯微鏡熒光觀察以及熒光強(qiáng)度和EGFP 蛋白含量變化的檢測(cè) 將轉(zhuǎn)化菌株分別接種到200 mL 含100 μg/mL 潮霉素B 的KK 液體培養(yǎng)基中，在28 ℃，200 r/min 條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，每24 h 分別吸取20 μL 菌液進(jìn)行熒光顯微鏡（Olympus， USA）觀察。培養(yǎng)到第5 天，通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Techcomp， China）測(cè)定菌液濃度，用KK 液體培養(yǎng)基統(tǒng)一稀釋到OD600=1.5的濃度，各取50 mL 菌液用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌。分別吸取200 μL 過(guò)濾后的溶液，通過(guò)全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（Bio-Tek， USA）檢測(cè)溶液的熒光強(qiáng)度值（激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為528 nm）。以上數(shù)據(jù)檢測(cè)重復(fù)3 次。同時(shí)采用本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的蛋白提取方法[19]提取上述過(guò)濾后液體培養(yǎng)基中的總蛋白，用BRADFORD[20]的方法測(cè)定蛋白濃度。分別取20 μg 總蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，Image scanner Ⅲ圖像掃描系統(tǒng)（GE， USA）掃描凝膠獲取圖片，并利用ImageJ軟件計(jì)算蛋白質(zhì)條帶的灰度值[21]，獲得EGFP 蛋白表達(dá)量的相對(duì)變化。Western blot 檢測(cè)采用TONG 等[22]描述的方法進(jìn)行，利用GFP 兔單克隆抗體（Beyotime， China）檢測(cè)EGFP 蛋白的表達(dá)量。以上熒光強(qiáng)度和EGFP 蛋白含量變化的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以Excel 2010 軟件的統(tǒng)計(jì)工具對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Six1d 啟動(dòng)子的克隆，pSix1d74HSPG 載體的構(gòu)建及順式作用元件分析

以Foc1 的基因組DNA 為模版，通過(guò)特異引物SixPro-F 和SixPro-R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得Six1d啟動(dòng)子目的條帶，純化回收備用。同時(shí)利用HindIII 限制性內(nèi)切酶對(duì)分泌表達(dá)載體p74HSP-EGFP的ToxA 啟動(dòng)子下游末端進(jìn)行酶切，補(bǔ)平粘性末端。再用Cla I 限制性內(nèi)切酶酶切，切除ToxA 啟動(dòng)子，獲得載體片段。隨后將克隆的Six1d 啟動(dòng)子片段通過(guò)Cla I 酶切后，連接進(jìn)p74HSP-EGFP 載體片段中，構(gòu)建的新載體命名為pSix1d74HSPG（圖1）。

將攜帶pSix1d74HSPG 載體的DH5α 菌株寄送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，克隆的Six1d 啟動(dòng)子片段序列長(zhǎng)度為1999 bp，與公布的Foc1 基因組（Accession No.KB730415）中的序列一致。將序列提交到啟動(dòng)子元件預(yù)測(cè)分析網(wǎng)站Plant CARE[23]進(jìn)行分析。結(jié)果表明，啟動(dòng)子中除了CAAT-box、TATA-box 等核心元件以外， 同時(shí)還含有ABRE 、AuxRR-core 、CGTCA-motif/TGACG-motif 激素類響應(yīng)元件，ARE、LTR、MBS 環(huán)境脅迫類響應(yīng)元件以及G-box、Sp1 等光響應(yīng)元件（圖2）。

2.2 p74HSP-EGFP 和pSix1d74HSPG 載體對(duì)Foc TR4 菌株的轉(zhuǎn)化及PCR 鑒定

真菌分泌表達(dá)載體p74HSP-EGFP 和pSix1d74HSPG 轉(zhuǎn)化Foc TR4 的原生質(zhì)體后，將長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化菌株轉(zhuǎn)至新的含100 μg/mL 潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行再次篩選。培養(yǎng)5 d 后，挑選并接種正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化菌株到PDB 中繼續(xù)培養(yǎng)，然后收集菌絲提取基因組DNA，通過(guò)EGFP 基因特異引物對(duì)（表1）進(jìn)行PCR 鑒定。對(duì)鑒定成功的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，重復(fù)2～3 次，獲得性狀穩(wěn)定的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌株，分別命名為FocTR4-HSPG 和Foc TR4-Six1dHSPG。PCR 鑒定結(jié)果顯示，從Foc TR4-HSPG 和Foc TR4-Six1dHSPG菌株DNA 中均能擴(kuò)增出646 bp 的EGFP 基因片段，表明真菌表達(dá)載體p74HSP-EGFP 和pSix1d74HSPG 已成功轉(zhuǎn)入Foc TR4 菌株中（圖3）。

2.3 轉(zhuǎn)化菌株的熒光顯微鏡觀察

分別將Foc TR4 野生型菌株，F(xiàn)oc TR4-HPG、Foc TR4-HSPG 和Foc TR4-Six1dHSPG 轉(zhuǎn)化菌株接種到KK 液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每隔24 h 吸取菌液通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行觀察（圖4）。結(jié)果顯示，在明場(chǎng)的可見(jiàn)光下，不同時(shí)期菌絲生長(zhǎng)形態(tài)均表現(xiàn)正常，沒(méi)有明顯區(qū)別（圖中僅顯示培養(yǎng)120 h 的明場(chǎng)圖片）。在488 nm 激發(fā)光下，F(xiàn)oc TR4 野生型菌落不發(fā)綠色熒光；Foc TR4-HPG攜帶的是非分泌型真菌表達(dá)載體，菌絲能發(fā)出明亮的綠色熒光，但沒(méi)有明顯的熒光背景，只是在培養(yǎng)后期可能由于EGFP 蛋白的逸出，才出現(xiàn)微弱的熒光背景； Foc TR4-HSPG 和Foc TR4-Six1dHSPG 攜帶的是分泌型真菌表達(dá)載體，在培養(yǎng)早期就由于表達(dá)并分泌EGFP 蛋白而出現(xiàn)綠色熒光背景，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，熒光背景逐漸增強(qiáng)，其中Foc TR4-Six1dHSPG 的熒光背景更加明亮。結(jié)果表明Foc TR4-HSPG 和Foc TR4-Six1dHSPG 菌株在液體培養(yǎng)過(guò)程中表達(dá)的EGFP綠色熒光蛋白不斷分泌到培養(yǎng)基中，導(dǎo)致液體培養(yǎng)基中出現(xiàn)明顯的綠色熒光背景。Foc TR4-Six1dHSPG 的綠色熒光背景比Foc TR4-HSPG 的更加明亮，表明Foc TR4-Six1dHSPG 中的EGFP表達(dá)量更高，分泌到液體培養(yǎng)基中的EGFP 蛋白相應(yīng)更多。

2.4 液體培養(yǎng)基熒光強(qiáng)度的測(cè)定和分析

轉(zhuǎn)化菌株在培養(yǎng)過(guò)程中不斷分泌EGFP 蛋白到液體培養(yǎng)基中，影響培養(yǎng)基的熒光強(qiáng)度。因此，測(cè)定液體培養(yǎng)基的熒光強(qiáng)度可間接反映EGFP 表達(dá)量的差異，從而比較Six1d 啟動(dòng)子與ToxA 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)EGFP 表達(dá)的的活性強(qiáng)度差異。為此，進(jìn)一步檢測(cè)了培養(yǎng)120 h 的不同菌株液體培養(yǎng)基熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，F(xiàn)oc TR4 的液體培養(yǎng)基濾液熒光強(qiáng)度值為3059.25±49.04；Foc TR4-HSPG 的熒光強(qiáng)度值為84 560.25±1161.16，是Foc TR4 野生型菌株的27.6 倍；Foc TR4-Six1dHSPG 的熒光強(qiáng)度值為138 572.5±1987.32，是Foc TR4-HSPG菌株的1.6 倍（ 圖5） 。以上研究結(jié)果說(shuō)明pSix1d74HSPG 載體中的Six1d 啟動(dòng)子活性高于p74HSP-EGFP 載體中的ToxA 啟動(dòng)子活性。

2.5 EGFP蛋白表達(dá)檢測(cè)和分析

采用本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的蛋白提取方法[19]，提取上述菌液過(guò)濾后液體培養(yǎng)基中的總蛋白。利用Bradford 方法測(cè)定蛋白濃度后，取15 μg 總蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（ 圖6 ） 。在p74HSP-EGFP 和pSix1d74HSPG 載體中，EGFP的N 端均加入了分泌信號(hào)肽序列，全長(zhǎng)271 個(gè)氨基酸，分子量約為30.3 kDa。電泳結(jié)果顯示，F(xiàn)ocTR4-HSPG 和Foc TR4-Six1dHSPG 均有EGFP 蛋白的表達(dá)，分子量大小和預(yù)估的30.3 kDa 基本一致，而作為對(duì)照的Foc TR4 野生型菌株中沒(méi)有EGFP 蛋白的表達(dá)條帶（圖6A）。通過(guò)ImageJ軟件計(jì)算EGFP 蛋白條帶的灰度值，結(jié)果顯示，F(xiàn)oc TR4-HSPG 的EGFP 蛋白條帶灰度值為12 508.33±1063.94，F(xiàn)oc TR4-Six1dHSPG 的EGFP蛋白條帶灰度值為21 281.42±1868.97，是FocTR4-HSPG 的1.7 倍，與之相對(duì)應(yīng)的Foc TR4-Six1dHSPG 的EGFP 蛋白表達(dá)量也是FocTR4-HSPG 的1.7 倍（圖6B），該結(jié)果和菌液中熒光強(qiáng)度值的倍數(shù)差異相似。

隨后，通過(guò)Western blot 來(lái)直接檢測(cè)轉(zhuǎn)化菌株分泌蛋白中EGFP 蛋白的表達(dá)量，結(jié)果顯示，F(xiàn)ocTR4-HSPG 和Foc TR4-Six1dHSPG 均檢測(cè)到EGFP 蛋白的表達(dá)，而作為對(duì)照的Foc TR4 野生型菌株中沒(méi)有EGFP 蛋白的表達(dá)條帶（圖6C），這一結(jié)果與聚丙烯酰胺凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。進(jìn)一步通過(guò)ImageJ 軟件計(jì)算Western blot 膜上EGFP 蛋白表達(dá)條帶的灰度值，數(shù)據(jù)顯示FocTR4-HSPG 的EGFP 蛋白條帶灰度值為29 164.39±429.73，F(xiàn)oc TR4-Six1dHSPG 的EGFP 蛋白條帶灰度值為46 915.92±559.16，是Foc TR4-HSPG 的1.61 倍（圖6D），這一數(shù)據(jù)結(jié)果和菌液中熒光強(qiáng)度值的倍數(shù)差異也比較一致。上述EGFP 蛋白表達(dá)檢測(cè)和分析結(jié)果表明，pSix1d74HSPG 載體中的Six1d 啟動(dòng)子與p74HSP-EGFP 載體中的ToxA 啟動(dòng)子相比有更高的表達(dá)活性。

3 討論

香蕉枯萎病是危害香蕉產(chǎn)業(yè)的重要病害，通過(guò)對(duì)尖孢鐮刀菌致病機(jī)理以及香蕉的抗病機(jī)制等方面的研究，已分離鑒定出一批相關(guān)基因。利用植物病毒表達(dá)載體[24]，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的表達(dá)載體[25]和酵母表達(dá)載體系統(tǒng)[26]等可以鑒定基因的功能，但存在許多局限性，同時(shí)這些鑒定方法操作程序復(fù)雜，鑒定途徑為非直接方式，鑒定結(jié)果容易出錯(cuò)等問(wèn)題。

pCT74 是一種常用的真菌表達(dá)載體，攜帶潮霉素Hyg 抗性篩選標(biāo)記，利用ToxA 啟動(dòng)子可在多種絲狀真菌中高效表達(dá)綠色熒光蛋白，達(dá)到蛋白定位的目的，但只能在胞內(nèi)表達(dá)，無(wú)法真實(shí)反映一些特異目標(biāo)蛋白的功能[17， 27]。因此，本研究團(tuán)隊(duì)已在pCT74 載體的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了攜帶分泌信號(hào)肽的真菌分泌表達(dá)載體p74HSP-EGFP，該載體可在真菌病原菌中表達(dá)攜帶的目的基因，并在侵染植物的過(guò)程中將目的蛋白分泌到植物體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)蛋白功能的驗(yàn)證[16]。相對(duì)于利用香蕉遺傳轉(zhuǎn)化體系驗(yàn)證目標(biāo)蛋白功能的傳統(tǒng)方法，利用真菌分泌表達(dá)載體的驗(yàn)證方法具有用時(shí)短、可操作性強(qiáng)、直觀高效等優(yōu)點(diǎn)。

近年來(lái)許多研究表明，利用內(nèi)源啟動(dòng)子表達(dá)外源基因往往具有更強(qiáng)的目的性，更高的表達(dá)效率。盧姍等[28]通過(guò)用馬爾尼菲青霉菌微管蛋白β亞基基因啟動(dòng)子替換粗脈孢菌苯菌靈抗性基因啟動(dòng)子，構(gòu)建了苯菌靈抗性基因表達(dá)盒，成功地運(yùn)用于馬爾尼菲青霉菌的遺傳轉(zhuǎn)化研究中。聶燕華等[29]克隆了銀耳芽孢內(nèi)源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， gpd）啟動(dòng)子，與多功能纖維素基因（multi-functionalcellulose， mfc）連接并構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化銀耳芽孢后，酶活發(fā)酵試驗(yàn)表明多功能纖維素酶的表達(dá)量提高了34.3%。真菌分泌表達(dá)載體p74HSPEGFP中的ToxA 啟動(dòng)子來(lái)源于小麥黃斑病真菌（Pyrenophora tritici-repentis）[17]，雖然在大部分真菌，包括Foc 中都可以啟動(dòng)基因的表達(dá)，但為了在Foc 中更高效地表達(dá)外源基因，F(xiàn)oc 自身的啟動(dòng)子可能會(huì)更加適合。本研究團(tuán)隊(duì)在前期對(duì)Foc1 的分泌蛋白質(zhì)組研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oc1 在單獨(dú)培養(yǎng)或與香蕉根共培養(yǎng)的過(guò)程中，Six1d 蛋白都能高效分泌表達(dá)[15]，因此本研究先克隆到Six1d基因的啟動(dòng)子，并替換p74HSP-EGFP 中的ToxA啟動(dòng)子，構(gòu)建能夠在尖孢鐮刀菌中更好表達(dá)目的基因的真菌分泌表達(dá)載體pSix1d74HSPG。

在基因工程中，啟動(dòng)子的強(qiáng)度是決定外源蛋白表達(dá)的關(guān)鍵因素。啟動(dòng)子的強(qiáng)度可以通過(guò)研究轉(zhuǎn)錄因子對(duì)其序列的結(jié)合親和力或評(píng)估啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因的表達(dá)水平來(lái)確定[12]。本課題組研究的2 種轉(zhuǎn)化菌株攜帶的是真菌分泌表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化菌株在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)在不斷表達(dá)外源基因的同時(shí)，將已合成的目的蛋白同步向細(xì)胞外分泌，不會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)目的蛋白的過(guò)量積累，只會(huì)增加培養(yǎng)基中目的蛋白的總量。因此在一定的培養(yǎng)時(shí)間范圍內(nèi)，培養(yǎng)基中目的蛋白的總量和啟動(dòng)子的活性呈現(xiàn)一定的線性相關(guān)。在本研究中，真菌分泌表達(dá)載體表達(dá)的EGFP 綠色熒光蛋白在培養(yǎng)過(guò)程中不斷分泌到液體培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)基中EGFP熒光蛋白總量的提高，逐步提高培養(yǎng)基的熒光背景，從而可以通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)基中EGFP 熒光強(qiáng)度的變化來(lái)判斷啟動(dòng)子表達(dá)強(qiáng)度的差異。研究發(fā)現(xiàn)，真菌分泌表達(dá)載體p74HSP-EGFP 和pSix1d74HSPG的Foc TR4 轉(zhuǎn)化菌株Foc TR4-HSPG 和FocTR4-Six1dHSPG 分別在KK 液體培養(yǎng)基（含潮霉素B 100 μg/mL）中振蕩培養(yǎng)24 h 后，就能觀察到少量的熒光背景，表明均有EGFP 蛋白的表達(dá)并分泌到培養(yǎng)基中。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，觀察到的熒光背景也在逐步增強(qiáng)，并且Foc TR4-Six-1dHSPG 產(chǎn)生的熒光背景高于Foc TR4-HSPG。結(jié)合菌液過(guò)濾后上清液中的熒光強(qiáng)度以及EGFP 蛋白表達(dá)量的檢測(cè)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步證實(shí)Foc TR4-Six-1dHSPG 菌液中的EGFP 蛋白表達(dá)量是Foc TR4-HSPG 的1.6～1.7 倍。

以上研究結(jié)果表明，新構(gòu)建的真菌分泌表達(dá)載體pSix1d74HSPG 中的Six1d 內(nèi)源啟動(dòng)子擁有完整的啟動(dòng)子功能，表達(dá)強(qiáng)度顯著高于p74HSPEGFP載體中的ToxA 啟動(dòng)子，具有明顯的內(nèi)源表達(dá)優(yōu)勢(shì)，達(dá)到ToxA 啟動(dòng)子的1.6～1.7 倍。pSix1d74-HSPG 載體完全能夠代替原來(lái)的p74HSP-EGFP 載體，可以在Foc 中更高效表達(dá)并分泌目的蛋白，從而為香蕉枯萎病抗感病分子機(jī)理研究提供重要的實(shí)驗(yàn)工具。