趙秋菊　崔學(xué)強(qiáng)　鄧杰玲　黃昌艷　李佳蔚　張自斌

關(guān)鍵詞：石斛蘭；iPBS 標(biāo)記；雜交子代；真實(shí)性鑒定

中圖分類號(hào)：S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

石斛蘭（Dendrobium）為多年生草本植物，是蘭科（Orchidaceae）石斛屬所有植物的總稱[1]，根據(jù)花期不同，可將其分為春石斛和秋石斛兩大類。石斛蘭的花朵具有獨(dú)特的“斛狀”花形，色彩絢麗且花期長(zhǎng)，觀賞價(jià)值極高。除此之外，石斛蘭還具有重要的藥用價(jià)值，其中鐵皮石斛（D.officinale）、金釵石斛（D. nobile）、霍山石斛（D.huoshanense）等品種是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖等功效[2-3]，其藥用價(jià)值在《中藥本草經(jīng)》和《本草綱目》等中藥典籍均有記載[4]。

1856 年，英國(guó)的JOHN DOMINY 等將蝦脊蘭屬的2個(gè)不同種蝦脊蘭進(jìn)行雜交，將子一代成功培育開(kāi)花[5]，至此，蘭花雜交育種開(kāi)啟了新篇章。雜交育種是培育石斛蘭新品種的主要方法，目前，人類已經(jīng)成功培育出涉及多達(dá)6 個(gè)屬的人工屬間雜交種[6]。但石斛蘭的育種周期較長(zhǎng)，從篩選親本到子代培育成熟，整個(gè)繁殖周期通常需要幾年的時(shí)間，需花費(fèi)大量的時(shí)間與精力從數(shù)個(gè)雜交后代中進(jìn)行選擇。為了減少人力物力的浪費(fèi)，縮短雜交育種的周期，雜交子代株系真實(shí)性的早期鑒定顯得十分重要。辨別雜交子代真實(shí)性能更好地篩選優(yōu)質(zhì)種，縮短選種時(shí)間，對(duì)石斛蘭的育種工作具有重要意義。

早期的雜交子代真實(shí)性鑒定主要通過(guò)形態(tài)學(xué)方法、細(xì)胞學(xué)鑒定和同工酶標(biāo)記進(jìn)行鑒定[7]，但形態(tài)學(xué)方法易受主觀因素影響，細(xì)胞學(xué)鑒定要求技術(shù)較高，同工酶標(biāo)記也存在位點(diǎn)少、多態(tài)性低的缺點(diǎn)。分子標(biāo)記是繼形態(tài)學(xué)鑒定、細(xì)胞學(xué)鑒定和同工酶標(biāo)記之后發(fā)展起來(lái)的新式鑒定方法，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的分子標(biāo)記被應(yīng)用于雜種子代的鑒定中。近年來(lái)，常應(yīng)用于雜種子代鑒定工作中的分子標(biāo)記主要有：ISSR[8-9]、SSR[10-11]、SRAP[12-13]等，但未見(jiàn)iPBS 標(biāo)記應(yīng)用于鑒定雜種子代真實(shí)性的相關(guān)報(bào)道。iPBS 是一類基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的新型分子標(biāo)記[14-15]，相對(duì)于其他分子標(biāo)記，iPBS 標(biāo)記具有無(wú)需預(yù)先獲得LTR序列，技術(shù)手段簡(jiǎn)單、高效，應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)[16]，在種質(zhì)資源鑒定、親緣關(guān)系分析和遺傳多樣性分析等研究中更具優(yōu)勢(shì)。因此，本研究基于iPBS標(biāo)記，鑒定廣美石斛（Dendrobium Pittero Gold‘Diamond Ring）×黃鉆戒石斛（DendrobiumBtilliant Smile‘Hiromi）雜交子代的真實(shí)性，為石斛蘭雜交育種親本的篩選和優(yōu)質(zhì)雜種子代的選育提供分子依據(jù)，從而加快石斛蘭育種工作進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以廣美石斛（ Dendrobium BtilliantSmile‘Hiromi）為母本，黃鉆戒石斛（DendrobiumPittero Gold‘Diamond Ring）為父本進(jìn)行雜交，通過(guò)人工授粉（無(wú)套袋）得到子一代，將親本及其19 個(gè)雜交后代株系（編號(hào)：1～19）作為試驗(yàn)材料。供試材料均取自廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所石斛蘭種質(zhì)資源圃，父母本及雜交后代株系均剪取幼嫩葉片，立即保存于液氮中，用于提取DNA。

主要試劑：2×Easy Taq? PCR SuperMix（康為世紀(jì)生物科技有限公司）， Trans? 2K DNAMaker（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；50×TAE緩沖液（國(guó)拓生物科技有限公司），瓊脂糖[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

主要儀器：H1650-W 型常溫離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司），DYY-6D 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司），GEL DOCXR 全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司），TC-96/G/H（b）C 型LifeECO 基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技有限公司），HWS-26 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 的提取和檢測(cè) 供試樣品基因組DNA 提取采用EasyPure? Genomic DNA Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司）試劑盒提取，提取的DNA 用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度，提取的DNA 用TE 緩沖液稀釋濃度至20 ng/μL，置于–20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選及iPBS-PCR 擴(kuò)增 本研究引物選用KALENDAR 等[17]發(fā)表的83 個(gè)引物，從合成引物中選取擴(kuò)增條帶清晰，穩(wěn)定性強(qiáng)，多態(tài)性高的引物對(duì)供試樣品DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（表1）。PCR 反應(yīng)體系為20 μL，包含10 μL 2×Easy Taq?PCR SuperMix，8 μL 無(wú)菌水，1 μL 引物，1 μL模板。iPBS-PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火45 s，72 ℃ 2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物置于4 ℃冰箱保存。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.3 雜種子代真實(shí)性鑒定 利用篩選出的引物對(duì)父母本及雜交后代株系進(jìn)行iPBS-PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。根據(jù)電泳圖譜，對(duì)比父母本條帶，鑒別雜種子代中的真雜種。參照大多數(shù)研究的標(biāo)準(zhǔn)，以子一代電泳條帶中含有父本特征帶的植株鑒定為真雜種，反之為假雜種。為保證最終鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，在研究中至少有2 個(gè)或2 個(gè)以上的引物鑒定為真雜種才能判定該子代植株為真雜種[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

觀察擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜，統(tǒng)計(jì)清晰的DNA條帶，同一遷移位置上，有條帶的記為“1”，無(wú)條帶的記為“0”，經(jīng)Excel 軟件構(gòu)建原始“0， 1”二元矩陣。利用NTSYS-pc 2.10e 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 采用SHAN Clustering 程序進(jìn)行UPGMA（算數(shù)平均數(shù)不加權(quán)對(duì)組法）聚類分析，構(gòu)建樹(shù)狀聚類圖，并用DICE 法計(jì)算試供材料間的遺傳相似系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 iPBS 引物擴(kuò)增多態(tài)性分析

從83 條iPBS 引物中篩選7 條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物對(duì)親本及子代共21 份石斛蘭基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果表明（表1），7 條引物擴(kuò)增出的總條帶為69 條，多態(tài)性條帶51 條，多態(tài)性比率為73.91%，其中引物2218 擴(kuò)增條帶多態(tài)性比率最高，為100%，引物2224 和2255 擴(kuò)增條帶多態(tài)性比率最低，為62.5%。每條引物擴(kuò)增出的平均條帶數(shù)為9.86 條，平均多態(tài)性條帶為7.29 條。引物2224 對(duì)21 份石斛蘭基因組DNA 的擴(kuò)增結(jié)果如圖1 所示。

2.2 雜合后代株系真實(shí)性鑒定

利用篩選的7 條引物對(duì)19 個(gè)雜交子代進(jìn)行真實(shí)性鑒定，對(duì)比親本與子代電泳圖譜（圖2），以引物2255 擴(kuò)增圖譜為例，能擴(kuò)增出父本特征性條帶的即為真雜種，未擴(kuò)增出父本特征帶或只擴(kuò)增出母本特征帶的子一代植株可能為母本自交后代或者認(rèn)定為假雜種。結(jié)果表明（表2），引物2081、2241、2255 擴(kuò)增出具有父本特征性條帶的子代個(gè)數(shù)分別為10、10、14，鑒定效率分別為52.6%、52.6%、73.7%。在引物2081 和2241 的鑒定中，4、10、16 和17 號(hào)均未擴(kuò)增出父本特征帶，但在引物2271、2076、2218 和2224 的進(jìn)一步鑒定中，發(fā)現(xiàn)4、10、16、17 這4 株子代植株都擴(kuò)增出了父本特征性條帶，鑒定為真雜種。

此外，在鑒別雜種子代時(shí)，每條引物均能擴(kuò)增出了1～2 條父本特征帶，但引物2076 擴(kuò)增出的父本特征帶最多，為4 條。綜合7 條引物的擴(kuò)增結(jié)果來(lái)看，廣美石斛與黃鉆戒石斛雜交所得的19株子代植株均能擴(kuò)增出父本特征性條帶，即全為真雜種，7 條iPBS 引物的鑒定效率高達(dá)100%。

2.3 親本與子代的聚類分析

利用NTSYS-pc 2.10e 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)遺傳矩陣按UPGMA 進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建石斛蘭親本及雜交后代株系的樹(shù)狀聚類圖，分析親本與雜交后代株系間的遺傳關(guān)系（圖3）。結(jié)果顯示，在遺傳距離0.82 處，親本及19 株雜交后代株系可分為5 大類群，其中，第Ⅰ類包括父本及11 個(gè)子代植株，分別為2、3、5～9、11、13、14、18 號(hào)植株，占供試材料的52.38%；第Ⅱ類為包括4 個(gè)子代植株，分別為10、15～17 號(hào)；第Ⅲ類為母本及4 號(hào)子代植株，第Ⅳ類僅有19 號(hào)子代植株，第Ⅴ類為1 號(hào)與12 號(hào)子代植株。其中，父本與6 號(hào)子代的遺傳距離最近，母本與4 號(hào)子代的遺傳距離最近；子一代中，7 號(hào)與11 號(hào)的遺傳距離最近。從聚類結(jié)果來(lái)看，絕大多數(shù)子代植株均聚類在父母親本之間，這部分子代植株先聚為2 個(gè)分支，先與父本聚合為一類，再與母本聚合，說(shuō)明相較于母本，子一代植株與父本的親緣關(guān)系更近，表現(xiàn)出傾父本遺傳。

2.4 親本與子代的遺傳相似系數(shù)分析

利用NTSYS-pc 2.10e 統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算21 份石斛樣本間的遺傳相似系數(shù)，結(jié)果顯示，親本及子代之間的遺傳相似系數(shù)變幅為0.71～0.93。父本黃鉆戒石斛與母本廣美石斛之間的遺傳相似系數(shù)僅為0.71，是遺傳相似系數(shù)矩陣中的最低值。根據(jù)所得遺傳相似系數(shù)用Excel 2010 軟件構(gòu)建親本及子代的遺傳相似系數(shù)箱式圖（圖4），發(fā)現(xiàn)父本黃鉆戒石斛與子代之間的遺傳相似系數(shù)在0.75～0.88 之間，平均值為0.83，其中父本與4 號(hào)子代的遺傳相似系數(shù)最低，與7 號(hào)子代的遺傳相似系數(shù)最高。母本廣美石斛與子代之間的遺傳相似系數(shù)為0.72～0.84，平均值為0.80，其中母本與12號(hào)子代遺傳相似系數(shù)最低，與10 號(hào)子代遺傳相似系數(shù)最高。子代間的遺傳相似系數(shù)為0.73～0.93，平均值為0.82，其中18 號(hào)子代與19 號(hào)子代遺傳相似系數(shù)最低，而7 號(hào)與11 號(hào)子代的遺傳相似系數(shù)最高。從整個(gè)遺傳相似系數(shù)矩陣來(lái)看，父本與子代間的遺傳相似系數(shù)比母本與子代間、子代間的更高，這表明雜交子代更偏向于父本遺傳，這與聚類分析時(shí)雜交子代與父本的親緣關(guān)系更近的結(jié)果一致。

3討論

雜種子代的鑒別工作對(duì)于遺傳育種十分關(guān)鍵，它可以通過(guò)子代基因型預(yù)測(cè)子代植株的表型性狀，極大地提高了育種效率，縮短雜交育種的周期，有助于發(fā)現(xiàn)子代中具有雜種優(yōu)勢(shì)的新品種。傳統(tǒng)的鑒別方式是形態(tài)學(xué)鑒定，但對(duì)于一些表型性狀差異不大的物種，光靠形態(tài)學(xué)鑒定并不準(zhǔn)確，而分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，在基因組DNA 的水平上，為鑒別雜種子代的真實(shí)性提供了可靠的分子依據(jù)。

iPBS 作為新型分子標(biāo)記，近年來(lái)逐漸被應(yīng)用于多種物種的種質(zhì)資源的鑒定以及遺傳多樣性分析等研究中。在本研究中，選取清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性高的7 條引物對(duì)試供樣本進(jìn)行iPBS-PCR擴(kuò)增，共檢測(cè)到69 條譜帶，其中多態(tài)性條帶為51 條，多態(tài)比例為73.91%。相較于ISSR[19]、SSR[20]、SRAP[21-22]、AFLP[23-24]等分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)石斛蘭擴(kuò)增的引物多態(tài)性，iPBS 分子標(biāo)記的引物多態(tài)性略低，但仍在70%以上，研究證明，iPBS分子標(biāo)記的擴(kuò)增多態(tài)性較好，可應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析以及雜交子代真實(shí)性鑒定等研究中。

種質(zhì)資源的鑒定是育種工作的基礎(chǔ)，對(duì)種質(zhì)間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性進(jìn)行分析，有助于選配優(yōu)質(zhì)雜交親本，選育具有雜種優(yōu)勢(shì)的后代株系。遺傳相似系數(shù)矩陣揭示了子代與親本之間的相似程度， 兩親本與子代間遺傳相似系數(shù)為0.71～0.93，變幅不大，表明該雜交組合子代間的遺傳多樣性并不豐富[25]，這不利于雜種優(yōu)勢(shì)品種的出現(xiàn)，后續(xù)研究中應(yīng)選取具有較大遺傳差異的植株進(jìn)行雜交育種，以便獲取雜種優(yōu)勢(shì)品種。而子代間遺傳相似系數(shù)數(shù)值偏高，說(shuō)明該雜交組合子代株系遺傳基礎(chǔ)趨向偏窄[26]。聚類分析圖直觀顯示了雜交子代株系與雙親間遺傳距離的遠(yuǎn)近，大部分子代株系表現(xiàn)為傾父本遺傳，聚類分析鑒定結(jié)果與遺傳相似系數(shù)鑒定結(jié)果一致。但1、12、19 三株子代獨(dú)立為2 個(gè)分支，并與父母本以及其余子代植株遺傳距離較遠(yuǎn)，存在明顯的遺傳分離現(xiàn)象，其原因可能是子代發(fā)生了較大的基因突變或重組變異[18， 27]。

本研究中，子一代植株擴(kuò)增出大量的父本特征帶，子代偏向父本黃鉆戒石斛遺傳，這與大部分研究如林榕燕等[28]、李玉萍等[29]的研究中子代株系均表現(xiàn)為傾母本遺傳的結(jié)果相反，說(shuō)明較多的黃鉆戒石斛遺傳信息被導(dǎo)入子代個(gè)體中，表現(xiàn)出較為明顯的傾父本遺傳。經(jīng)7 條引物共同鑒定，19 株子代株系均為真雜種，鑒定效率為100%，這與林榕燕等[26]基于SSR 標(biāo)記和SRAP 標(biāo)記對(duì)文心蘭雜交后代進(jìn)行真實(shí)性鑒定的鑒定效率一致，略高于鐵皮石斛[30]、結(jié)縷草[31]、假儉草[32]、獼猴桃[33]等物種的鑒定效率。研究證明，iPBS 標(biāo)記是鑒別雜種子代真實(shí)性的有效手段，可應(yīng)用于植物種質(zhì)資源的鑒定、親緣關(guān)系的研究以及遺傳多樣性的分析等研究工作中。雖然一種分子標(biāo)記可單獨(dú)鑒別出所有雜種，但由于石斛屬植物類群較大且遺傳背景較復(fù)雜，僅憑一種標(biāo)記鑒定可能還不夠準(zhǔn)確，在今后的研究中可增加形態(tài)學(xué)鑒定或者聯(lián)合多標(biāo)記鑒定來(lái)輔助進(jìn)行雜種鑒定。