范繼征　李秀玲　李明智　卜朝陽　何荊洲　曾艷華

關(guān)鍵詞：秀麗兜蘭；葉綠體基因組；特征分析；系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號：S 682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

秀麗兜蘭[Paphiopedilum venustum （Wall. exSims） Pfitzer]隸屬于蘭科杓蘭亞科兜蘭屬，是第一個(gè)被人工栽培的兜蘭屬植物[1]，主要分布于我國西藏東南部至南部，以及孟加拉國、不丹、印度東北部、尼泊爾等國家和地區(qū)，野外花期1—3月[2]。秀麗兜蘭植株直立、叢生，株高7.0～9.0 cm，葉片數(shù)2～3 片，長7.5～12.0 cm，寬2.5～3.5 cm，呈狹矩圓狀橢圓形，表面有網(wǎng)格斑，背面有密集的紫色斑點(diǎn)， 花葶長9.2～15.4 cm， 花朵橫徑5.4～8.6 cm，縱徑2.9～3.4 cm，花朵色澤艷麗，花期長，花和葉均極具觀賞價(jià)值。但由于人類活動(dòng)以及自身生長要求和生長特點(diǎn)等原因，秀麗兜蘭已成為瀕危物種（EN），受到國際社會(huì)的嚴(yán)格保護(hù)[3-4]。

葉綠體是植物光合作用發(fā)生的細(xì)胞器，具有一套完整的基因組[5]，與核基因組等其他基因組相比，葉綠體基因組具有高度的保守性以及自我復(fù)制機(jī)制、進(jìn)化相對獨(dú)立、基因組小、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、突變率低等特點(diǎn)[6-8]。隨著二代測序技術(shù)的飛速發(fā)展，通過測序組裝和注釋獲得的完整的葉綠體基因組序列成本降低、速度加快[9]，葉綠體基因組也越來越多的為進(jìn)化分析、系統(tǒng)發(fā)育及分類鑒定等提供信息[10]。目前有關(guān)葉綠體基因組特征分析已被廣泛應(yīng)用于多種兜蘭屬植物，有對單獨(dú)一個(gè)種進(jìn)行葉綠體基因組分析，例如白旗兜蘭（P. spicerianum）[11]、白花兜蘭（P. emersonii）[12]、格麗兜蘭（P. gratrixianum）[13]、麻栗坡兜蘭（P. malipoense）[14]、紫紋兜蘭（P. purpuratum）[15]、飄帶兜蘭（P.parishii）[16]、陳蓮兜蘭（P. tranlimianum）[17]等，也有對多個(gè)種進(jìn)行比較分析[18-19]?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明兜蘭屬植物葉綠體基因組大小為154689～162 590 bp，其結(jié)構(gòu)與大多數(shù)陸生植物葉綠體結(jié)構(gòu)相似，為典型的四分結(jié)構(gòu)，包括大單拷貝區(qū)（large single copy， LSC）、小單拷貝區(qū)（small singlecopy， SSC）和2 個(gè)反向重復(fù)區(qū)（inverted repeat，IR），各區(qū)GC 含量差異較大，其中IR 的GC 含量較高，不同的蛋白質(zhì)編碼在同義密碼子的使用上有所不同，偏好A 或U（T）結(jié)尾的密碼子。此外，系統(tǒng)發(fā)育分析打破了形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)等的局限性，能夠更好地反映物種之間的親緣關(guān)系[11-19]。

有關(guān)秀麗兜蘭的研究多集中在非共生萌發(fā)和繁殖技術(shù)[20]、細(xì)胞學(xué)研究[21-23]、病害鑒定[24]、分布地區(qū)和生長環(huán)境[25]等，尚無秀麗兜蘭葉綠體基因組的報(bào)道。本研究通過高通量測序方法獲得秀麗兜蘭完整的葉綠體基因組信息，對其進(jìn)行注釋，并對基因組中序列重復(fù)、SSR 位點(diǎn)及蛋白編碼基因的密碼子使用偏好性進(jìn)行分析，同時(shí)分析了系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。本研究結(jié)果可為秀麗兜蘭及其他兜蘭屬植物種質(zhì)資源鑒定、系統(tǒng)發(fā)育、遺傳育種、種群恢復(fù)以及生物多樣性保護(hù)等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為遷地保存在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所蘭科植物種質(zhì)資源圃（22°48′N，108°22′E）的秀麗兜蘭，取長勢良好、無病蟲害的新鮮幼嫩葉片擦拭干凈，用液氮速凍后于?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取、文庫構(gòu)建及測序 取葉片100 mg，采用改良CTAB 法[26]提取總DNA，樣品基因組DNA 質(zhì)量檢測合格后，用超聲波將合格的DNA 片段化，然后對片段化的DNA 進(jìn)行片段純化、末端修復(fù)、3′端加A、連接測序接頭，再用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，進(jìn)行PCR擴(kuò)增形成測序文庫，并進(jìn)行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用BGISEQ-500 平臺(tái)進(jìn)行測序（廣州佰德生物科技有限公司）。

1.2.2 葉綠體基因組的組裝與注釋 對測序得到的原始數(shù)據(jù)（raw data）進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，去除其中的接頭序列及低質(zhì)量reads 獲得高質(zhì)量的cleandata。使用Bowtie2 v.2.3.4.3 軟件[27]比對近緣物種葉綠體基因組數(shù)據(jù)庫，將比對上的reads 數(shù)量最多的3 個(gè)CDS 序列作為項(xiàng)目樣品的葉綠體基因組起始組裝序列，采用NOVOPlasty v4.2.1 軟件[28]組裝葉綠體基因組。利用GeSeq 和blast 軟件對葉綠體基因組CDS 序列進(jìn)行注釋，并利用GeSeq 和hmmer 軟件對葉綠體基因組rRNA序列進(jìn)行注釋，使用tRNAscan-SE 和ARAGORN軟件對葉綠體基因組tRNA 序列進(jìn)行注釋，并進(jìn)行手動(dòng)調(diào)整和確認(rèn)獲得最終注釋結(jié)果，最后采用OrganellarGenomeDRAW軟件制作葉綠體基因組圖譜[29-35]。將組裝注釋好的秀麗兜蘭基因組序列上傳至Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號：MZ150831。

1.2.3 葉綠體基因組SSR 分析 利用MISAv1.01（MIcroSAtellite identification tool）軟件對秀麗兜蘭進(jìn)行cpSSR 的分析[36]。參數(shù)設(shè)置為單核苷酸（mononucleotide）、二核苷酸（dinucleotide）、三核苷酸（ trinucleotide）、四核苷酸（tetranucleotide）、五核苷酸（pentanucleotide）和六核苷酸（hexanucleotide）的重復(fù)數(shù)閾值分別為10、6、5、5、5 和5。

1.2.4 密碼子使用分析 計(jì)算秀麗兜蘭cpDNA 密碼子的使用情況和相對密碼子的偏好性（relativesynonymous codon usage， RSCU），RSCU 值則以1為限，若RSCU>1，該密碼子使用頻率較高；若RSCU<1，該密碼子使用頻率較低。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析 從NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載16 個(gè)兜蘭屬和2 個(gè)杓蘭屬植物，利用mafft 7.0軟件進(jìn)行cpDNA 序列比對，使用fasttree2.1.10軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹，選擇GTR+Gamma 模型，Shimodaira-Hasegawa 檢測[37-38]。

2 結(jié)果與分析

2.1 秀麗兜蘭葉綠體基因組的基本特征

秀麗兜蘭葉綠體基因組具有典型的環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，包括1 個(gè)大單拷貝區(qū)（large single-copyregion， LSC）、1 個(gè)小單拷貝區(qū)（small single-copyregion， SSC）和2 個(gè)反向重復(fù)區(qū)（IR），總長度為158 298 bp，其中LSC、SSC 和2 個(gè)IR 長度分別為87 775、949、34 787 bp，LSC、SSC 和IR 區(qū)域的GC 含量分別為32.6%、25.1%和39.1%。秀麗兜蘭葉綠體基因組共含129 個(gè)基因，包括79 個(gè)蛋白編碼基因，38 個(gè)tRNA 基因、8 個(gè)rRNA 基因和4 個(gè)假基因（2 個(gè)ndhD、1 個(gè)ndhJ、1 個(gè)ndhK），其中22 個(gè)完整的基因位于IR 重復(fù)區(qū)，包括10個(gè)蛋白編碼基因，8 個(gè)tRNA 和4 個(gè)rRNA，1 個(gè)基因rpl22 位于LSC-IRB 連接處。IR 重復(fù)區(qū)域還含有1 個(gè)假基因ndhD 以及rps12 基因的第2 和第3 個(gè)外顯子，nps12 的第1 個(gè)外顯子位于LSC 區(qū)域（圖1）。秀麗兜蘭葉綠體基因組注釋基因信息見表1。

2.2 秀麗兜蘭葉綠體基因組簡單序列重復(fù)

秀麗兜蘭葉綠體基因組簡單序列重復(fù)（SSR）信息見表2，從中共鑒定出78 個(gè)SSR 位點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)五核苷酸重復(fù)，最豐富的是單核苷酸重復(fù)，有66 個(gè)，占總SSRs 的84.62%，其次是二核苷酸重復(fù)8 個(gè)，占總SSRs 的10.26%，三核苷酸重復(fù)和四核苷酸重復(fù)均為1 個(gè)，六核苷酸重復(fù)2 個(gè)。其中63 個(gè)單堿基重復(fù)都是由A 或T 構(gòu)成，因此，SSRs 的堿基組成偏向使用A/T 堿基。

2.3 秀麗兜蘭葉綠體基因組密碼子偏好性

秀麗兜蘭葉綠體基因組中各氨基酸的相對同義密碼子使用頻率（relative synonymous codeusage， RSCU）分析結(jié)果見圖2 和表3。從中可以看出，高頻密碼子（RSCU>1）共有32 個(gè)，其中，16 個(gè)以U 結(jié)尾，13 個(gè)以A 結(jié)尾，以G 結(jié)尾的有2 個(gè)，以C 結(jié)尾的密碼子有1 個(gè)，說明秀麗兜蘭葉綠體基因密碼子偏好性以U 和A 結(jié)尾，與較低的基因組和蛋白編碼基因GC 含量一致。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

基于葉綠體基因組序列對18 個(gè)蘭科植物（含兜蘭屬物種16 個(gè)、近緣屬杓蘭屬物種2 個(gè)）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。從圖中可以看出，18 個(gè)物種分為3 大類，其中，紫花杓蘭和西藏杓蘭與其他物種遺傳距離較遠(yuǎn)，被單獨(dú)聚成一類；麻栗坡兜蘭、硬葉兜蘭等5 個(gè)物種均歸為一類，即寬瓣亞屬；秀麗兜蘭和帶葉兜蘭、紫紋兜蘭等11 個(gè)物種歸為一類，屬于兜蘭亞屬，且秀麗兜蘭與紫紋兜蘭關(guān)系最近。

3 討論

兜蘭是蘭科（Orchidaceae）兜蘭屬（PaphiopedilumPfitzer）植物的統(tǒng)稱，因具有拖鞋狀的唇瓣又被稱為“拖鞋蘭”或“仙履蘭”，具有極高的觀賞價(jià)值和商業(yè)價(jià)值[1， 39-40]。本研究采用第二代高通量測序技術(shù)對秀麗兜蘭葉綠體基因組進(jìn)行測序、組裝和注釋，獲得了秀麗兜蘭完整的葉綠體基因組。研究發(fā)現(xiàn)秀麗兜蘭葉綠體基因組與前人[11-19]研究的兜蘭屬其他植物相似，具有典型的四分體環(huán)狀結(jié)構(gòu)，GC 含量遠(yuǎn)小于AT 含量，其中IR 區(qū)域GC 含量最高，這與rRNA 的GC 含量較高，且全部定位在這些區(qū)域密切相關(guān)[41]。

簡單序列重復(fù)（SSR）多存在于真核生物的細(xì)胞器基因組中，具有豐富的多態(tài)性，高度的重復(fù)性以及良好的可靠性和共顯性，常被用于對種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析、物種鑒定和群體遺傳學(xué)研究[19， 42]。本研究從秀麗兜蘭葉綠體基因組中鑒定出78 個(gè)SSR 位點(diǎn)，單核苷酸有66 個(gè)，占總SSRs 的94.62%，表明單核苷酸重復(fù)可能提供了更多的系統(tǒng)發(fā)育信息，63 個(gè)單堿基重復(fù)和其他堿基重復(fù)都是由A 或T 構(gòu)成，A/T 重復(fù)類型占據(jù)主要地位，這與前人[18-19]對其他幾種兜蘭屬植物研究結(jié)果一致，得到的這些SSR 序列可為兜蘭屬植物篩選SSR 標(biāo)記和指紋圖譜研究提供依據(jù)。

在植物進(jìn)化過程中，密碼子的使用普遍表現(xiàn)出偏好性，自然選擇、物種突變和遺傳漂變是影響密碼子偏好性的主要原因，密碼子偏好性用相對同義密碼子使用頻率（RSCU）表示，若密碼子無偏好性，則RSCU 值為1，如果該密碼子比其他同義密碼子來說出現(xiàn)更頻繁，RSCU 值大于1，反之亦然[43-45]。本研究秀麗兜蘭葉綠體基因組RSCU>1 的密碼子共有32 個(gè)，其中以A 和U 結(jié)尾的有29 個(gè)，超過90.6%，而RSCU<1 的密碼子則多以C 或G 結(jié)尾，表明秀麗兜蘭葉綠體基因組偏向于使用以A 或U 結(jié)尾的同義密碼子，與丁銳等[46]對杓蘭屬的研究結(jié)果一致，這可能與葉綠體基因組較低的GC 含量有關(guān)，進(jìn)一步表明密碼子偏好性可能受基因組GC 含量的影響[47]。根據(jù)秀麗兜蘭葉綠體基因組的密碼子偏好性可對目的基因進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提高基因轉(zhuǎn)化和表達(dá)效率，這一研究結(jié)果可為秀麗兜蘭遺傳育種及葉綠體基因工程的外源基因高效、穩(wěn)定表達(dá)提供科學(xué)依據(jù)。

從18 種蘭科植物葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，兜蘭屬和杓蘭屬是明顯分開的兩大類，兜蘭屬又分兩大類，一類包含白花兜蘭、硬葉兜蘭、麻栗坡兜蘭、德氏兜蘭和杏黃兜蘭；另一類包括小葉兜蘭、陳蓮兜蘭、格麗兜蘭、白旗兜蘭、紫紋兜蘭、秀麗兜蘭、帶葉兜蘭、長瓣兜蘭、飄帶兜蘭、同色兜蘭和雪白兜蘭，其中秀麗兜蘭與紫紋兜蘭親緣關(guān)系密切。這一分類與其他學(xué)者利用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)等方法得到的分類結(jié)果相似[48-49]，與SUN 等[18]和胡國家[19]通過葉綠體基因組序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹基本一致，顯示出葉綠體基因組序列在物種分類和進(jìn)化研究中具有更高的分辨率和可靠性[50]，證明了植物葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建在物種鑒定方面的準(zhǔn)確性，同時(shí)還需要更加全面密集的取樣，才能更準(zhǔn)確地反映發(fā)育關(guān)系。

4 結(jié)論

秀麗兜蘭葉綠體基因組為典型的四分結(jié)構(gòu)，總基因組大小為158 298 bp，總GC 含量為35.4%，含129 個(gè)基因，共鑒定出78 個(gè)SSR 位點(diǎn)，堿基組成偏向使用A/T 堿基，密碼子偏好性以U 和A結(jié)尾，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示秀麗兜蘭與紫紋兜蘭為姐妹種關(guān)系。研究結(jié)果可為兜蘭屬植物物種鑒定、生物進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)育、資源保護(hù)及分子生物學(xué)等研究提供理論參考。