林秋云　謝振宇　胡偉　周玉杰　龍開意　賀治洲

關鍵詞：水稻；葉片亮綠；突變體；bgl-2；表型；遺傳

中圖分類號：S31 文獻標識碼：A

糧食安全是“國之大者”，悠悠萬事，吃飯為大。我國是水稻生產大國，2011—2021 年種植面積穩(wěn)定在3000 萬hm2 左右，以占世界9%的耕地、6%的淡水資源，養(yǎng)育了世界近1/5 的人口[1]。優(yōu)良高產品種的推廣應用發(fā)揮了極其重要的作用。光合效率是決定作物產量的重要前提，也是育種家們的改良目標，而葉片是水稻進行光能轉化的主要組織[2]。水稻葉色突變是一種發(fā)生頻率高、易于被發(fā)現(xiàn)的突變現(xiàn)象，但多數(shù)葉色突變體對光合作用有影響，在一定程度上間接影響水稻產量，因此在早期常被認為是無意義突變體。隨著生物技術的發(fā)展，大量研究表明葉色突變體不僅是開展光合作用、光形態(tài)建成、質－核基因互作、葉綠素合成和葉綠體發(fā)育等基礎研究的理想材料，同時可作為一種明顯且易于識別的標記性狀，簡化良種繁育和雜交種生產[3-5]。此外，葉色突變體還可以作為觀賞稻，致力于打造鄉(xiāng)村休閑農業(yè)觀光旅游點，帶動農民增收，促進鄉(xiāng)村振興[6]。

水稻資源輻射誘變創(chuàng)制是利用60Co-γ 射線照射種子，引起種子內染色體重組、畸變，產生遺傳變異，從而形成水稻新種質、新材料，進而配制水稻新品種的一種高科技技術。60Co-γ 射線輻照誘變的頻率高，可形成自然界沒有的性狀和類型，打破性狀間的緊密連鎖，促進基因重組，有些變異性狀穩(wěn)定快，可以在較短的時間內獲得罕見的種質材料和基因資源。來自西非地區(qū)尼日利亞的農家栽培品種SIPI 具有耐瘠薄、分蘗強、耐高溫等優(yōu)良特性，但其稻穗較小，株型松散，限制了該品種的育種應用。本課題組在前期研究中利用60Co-γ 射線輻照處理SIPI 干種子，輻射劑量為300 Gy，隨后連續(xù)自交多代篩選，最終獲得一個穩(wěn)定遺傳的水稻亮綠葉突變體bgl-2。本研究通過對突變體bgl-2 進行田間表型和細胞學結構觀察，并進行溫度敏感試驗，同時構建F2 分離遺傳群體進行BGL-2 基因遺傳模式分析，以期為后續(xù)BGL-2 基因的克隆和功能分析奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

突變體bgl-2 是利用60Co-γ 射線300 Gy 輻照來自尼日利亞的秈稻品種SIPI 干種子，在M2 代，田間鑒定出亮綠葉突變表型植株，隨后對突變植株連續(xù)自交多代獲得穩(wěn)定遺傳的一個水稻亮綠葉突變體材料。2020 年春季種植野生型SIPI 和突變體bgl-2，地點位于海南省儋州市中國熱帶農業(yè)科學院水稻綜合試驗基地。種植規(guī)格為20 cm×20 cm，單株插秧，田間水肥、病蟲管理參照當?shù)爻Ｒ?guī)大田管理方法。

1.2 方法

1.2.1 F₂分離群體構建 2020 年春季種植野生型SIPI 和突變體bgl-2，抽穗期以突變體bgl-2 為母本，人工去雄，授以野生型SIPI 花粉，授粉25 d后收獲雜交種F1。2020 年夏季分別種植野生型SIPI、突變體bgl-2 和F1，觀察F1 植株表型，排除雜株后自交收獲F2 種子。2021 年春季分別種植野生型SIPI、突變體bgl-2 和F2，獲得分離遺傳群體，田間調查F2 群體單株表型，計算分離比例。

1.2.2 光合色素含量測定 分別取野生型SIPI 和突變體bgl-2 分蘗期劍葉葉片，測定光合色素含量，測定方法參照LI 等[7]的方法。光合色素提取完畢，利用DU800 紫外可見分光光度計，在黑暗條件下，測定上清液的吸光值（波長為470、649、665 nm）。并根據(jù)以下公式計算光合色素含量：

葉綠素a 含量：Chla（mg/g）=13.95D₆₆₅–6.88D₆₄₉

葉綠素b 含量：Chlb（mg/g）=24.96D₆₄₉–7.32D₆₆₅

類胡蘿卜素含量：Car（mg/g）=（1000D₄₇₀–2.05Chla–114Chlb）/245

細胞色素含量（mg/g）=（葉綠素濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)）/樣品鮮重

1.2.3 葉綠體超微結構的透射電鏡觀察 分別取分蘗期野生型SIPI 和突變體bgl-2 劍葉，橫切成數(shù)段，每段約2 mm，置于3%的戊二醛固定液，抽氣，室溫固定12 h，4 ℃保存。將樣品送至中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所電鏡實驗中心進行樣品制備和透射電鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 水稻亮綠葉突變體bgl-2 的表型鑒定

與野生型SIPI 比較，突變體bgl-2 在田間分蘗期表現(xiàn)為明顯的葉片亮綠色（圖1），此外還伴隨著株高變矮，突變體bgl-2 株高為（91.10±3.13）cm，而野生型SIPI 的株高為（107.30±3.93）cm，二者之間存在顯著差異（表1）。調查葉片形態(tài)發(fā)現(xiàn)，突變體bgl-2 的劍葉和倒二葉的葉尖處均表現(xiàn)出彎折，分別測定野生型和突變體bgl-2 的劍葉長度，結果發(fā)現(xiàn)野生型SIPI 的劍葉長度為（25.70±0.87）cm，而突變體bgl-2 的劍葉長度為（20.90±0.53）cm，顯著短于野生型?？椒N發(fā)現(xiàn)，突變體bgl-2的千粒重、粒長和粒寬均顯著小于野生型SIPI，但長寬比在二者之間無顯著差異（表1）。這些結果表明BGL-2 基因可能存在一因多效的效應。

2.2 突變體bgl-2 的光合色素含量測定

大多數(shù)造成葉色突變的基因直接或間接影響葉綠素的代謝過程，從而致使葉片葉綠素含量發(fā)生變化。為了了解突變體bgl-2 的葉綠素含量是否發(fā)生變化，在田間分蘗期分別取野生型SIPI 和突變體bgl-2 劍葉葉片，測定光合色素含量，結果如圖2所示，二者之間無顯著差異，說明突變體bgl-2 的葉色亮綠表型不是因為光合色素含量變化導致的，可能是BGL-2 基因突變引起其他機制變化導致的。

2.3 突變體bgl-2 的葉綠體超微結構觀察

為了了解BGL-2 基因的突變是否影響到葉綠體的發(fā)育，本研究通過透射電鏡觀察分蘗期野生型SIPI 和突變體bgl-2 劍葉葉綠體的超微結構。如圖3A 與圖3D 所示，突變體bgl-2 的葉綠體數(shù)目與野生型SIPI 相比無顯著差異。然而突變體bgl-2 的細胞結構出現(xiàn)異常。野生型SIPI 細胞壁厚度為（222.20±6.26）mm，而突變體bgl-2 的胞壁厚度增厚至（280.20±14.20）mm，但其細胞外膜厚度顯著減小至（31.30±5.29）mm，且內膜幾乎退化，而野生型SIPI 的細胞外膜厚度為（102.80±5.94）mm（表2）。此外突變體bgl-2 的類囊體片層結構顯著減少（圖3B、圖3C、圖3E 和圖3F），說明突變體bgl-2 的細胞結構不正常，BGL-2 基因的突變影響其細胞結構和葉綠體的正常發(fā)育。

2.4 突變體bgl-2 的遺傳模式分析

突變體bgl-2 與野生型SIPI 雜交獲得的F1 代植株葉片表現(xiàn)正常綠色，劍葉和倒二葉形態(tài)正常，而自交后的F₂代群體分離出葉色差異明顯的正常綠葉苗和亮綠葉苗?？ǚ綔y驗結果表明，F(xiàn)₂ 代群體中正常苗與亮綠葉苗的分離比例符合3∶1（表3），說明該突變性狀受1 對隱性單基因控制。

3 討論

水稻葉色突變體是一種出現(xiàn)頻率較高的突變體類型，常見的有黃綠、淺綠、條紋、黃化、白化、白化轉綠、黃化轉綠等類型[8-12]。然而水稻葉片亮綠突變體比較少見，已報道的只有2 個[4]。水稻葉色表型多由一對隱性單基因控制，遺傳行為簡單。目前已報道的與葉綠素含量相關的基因有150 多個，其中已被克隆的葉色基因至少有30 個，這些基因主要分為葉綠素合成和降解途徑的基因、葉綠體發(fā)育途徑的基因以及其他途徑相關基因等[13-16].

YOO 等[17]最先報道的突變體bgl 由于近軸和遠軸葉表面均無乳頭狀結構的小角質乳突（smallpapillae， SP）導致綠光更多的直接反射而減少擴散，所以葉片呈現(xiàn)出亮綠色。但突變體bgl 的葉綠素含量和葉綠體結構與野生型相比，并無顯著差異。圖位克隆結果表明，bgl 位點是一個編碼由11 個成員組成的水稻OsRopGEFs 家族之一OsRopGEF10。與SP 在葉表皮上啟動的時間一致，OsRopGEF10 在葉鞘出苗前的新發(fā)育葉片中表達最強。隨后WANG 等[18]報道另外一個新的水稻亮綠突變體bgl11，不同于突變體bgl1，其葉綠素含量顯著低于野生型，且在成熟期，其單株有效穗數(shù)和結實率也顯著低于野生型，但其他主要農藝性狀與野生型相比無差異?；驁D位克隆和測序結果表明，BGL11 是一個位于水稻第11 號染色體長臂上的基因LOC_Os11g38040。突變體bgl11 在該基因的編碼區(qū)存在9 個bp 片段缺失。將LOC_Os11g38040 基因轉到突變體bgl11 中，其葉片顏色恢復正常綠色。本研究的bgl-2 是一個輻射誘變獲得的水稻亮綠葉突變體，但表型不同于bgl和bgl11，其不僅在葉片顏色上呈亮綠色，葉片形態(tài)也發(fā)生了變化，劍葉和倒二葉葉尖處均表現(xiàn)出彎折。此外在細胞結構上也發(fā)生了變化，細胞壁增厚，細胞膜變薄甚至退化，說明BGL-2 位點有可能不同于OsRopGEF10 和BGL11，是一個新的葉色亮綠基因。遺傳模式分析表明突變體bgl-2由一對隱性單基因控制，下一步試驗將進一步對BGL-2 進行基因定位及功能分析。