南文萍，倪 倩，張 俐，孫 晶，馮有龍*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，江蘇 南京 210019)

半夏曲是由天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit 及其輔料發(fā)酵而來的曲劑。半夏制曲后可降低半夏的毒性，增強燥濕化痰、消積止瀉的功效，用于治療脾虛、消化不良、咳嗽痰多等癥。目前半夏曲的炮制大多采用自然發(fā)酵工藝，發(fā)酵效果受自然菌種和環(huán)境溫濕度影響，發(fā)酵質(zhì)量不穩(wěn)定，存在引入雜菌的風險，進而導(dǎo)致真菌毒素的污染[1]。真菌毒素超標不僅影響中藥的質(zhì)量，而且對人體具有致癌致畸危害[2]。已有研究在發(fā)酵類中藥如六神曲、淡豆豉、紅曲中檢出黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）[3]、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynibalenol，DON）[4]、桔青霉素（citrinin，CIT）[5]。但已有方法檢測的真菌毒素種類有限，大多為常見的真菌毒素，且鮮有半夏曲中多種真菌毒素檢測的相關(guān)報道。

目前，隨著質(zhì)譜技術(shù)在真菌毒素檢測中的應(yīng)用，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法具有特異性強、靈敏度高的特點，廣泛適用于中藥中多種真菌毒素的痕量檢測[6-8]。中藥基質(zhì)復(fù)雜，雜質(zhì)種類多，固相萃?。⊿PE）技術(shù)基于固液色譜分離的原理使目標物與雜質(zhì)分離，以達到凈化目的，可用于多種真菌毒素的凈化[9]。因此，本實驗擬建立一種基于SPE結(jié)合UPLC-MS/MS 技術(shù)的半夏曲中24 種真菌毒素快速定量分析方法，并利用所建立的方法對實際樣品進行檢測，為考察半夏曲中真菌毒素的污染情況及完善和評價其質(zhì)量及探索臨床安全用藥提供保障。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器

ExionLC 型超高效液相色譜、AB QTRAP 4500 LC/MS/MS（美國SCIEX 公司）；MSE224S 型萬分之一天平（德國Sartorius 公司）；Sorvall ST 16R 型臺式冷凍型離心機（德國Thermo Scientific 公司）；Auto EVA-60 型全自動平行濃縮儀［?？萍瘓F（廈門）股份有限公司）］；MX-S 型渦旋混合儀（美國Scilogex公司）；T 18 digital 型高速分散機（德國IKA 公司）。

1.2 藥物與試劑

10 種真菌毒素混合標準品溶液和14 種單標對照品溶液（純度均≥98.3%）均購自天津阿爾塔公司。乙腈和甲醇（HPLC 級）均購自德國Merck 公司；甲酸（HPLC 級）購自美國ACS 恩科化學(xué)公司；甲醇和乙腈（分析純）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。Oasis HLB（60 mg/3 mL）固相萃取柱購自美國Waters 公司；MycoSep 226、MycoSep 229 凈化柱均購自Romer 國際貿(mào)易（北京）有限公司；MFC100 固相凈化柱購自青島普瑞邦生物工程有限公司。共收集10 批次半夏曲，經(jīng)江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院胡浩彬主任中藥師鑒定為天南星科半夏屬植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit 經(jīng)發(fā)酵炮制的曲劑。

2 方法

2.1 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：Poroshell 120 EC-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.7μm），柱溫為35 ℃；流速為0.5 mL/min；進樣體積為5μL；流動相A 為0.1%甲酸-水溶液（V/V），B 為乙腈。梯度洗脫：0.0 ～ 4.0 min，5%→40%B；4.0 ～ 11.0 min，40%→45%B；11.0 ～ 16.0 min，45%→90%B；18.0 ～ 18.1 min，90%→5%B；18.1 ～20.0 min，5%B。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源（ESI）；噴霧電壓為5 500V（+）/4 500V（-）；毛細管溫度為500℃；氣簾氣壓力（CUR）為1.72×105Pa；碰撞氣電壓強度為Low。分段多反應(yīng)監(jiān)測模式。24 種真菌毒素檢測的質(zhì)譜參數(shù)見表1。MRM 圖見圖1。

圖1 24 真菌毒素的MRM 圖Fig.1 MRM of the 24 mycotoxins

表1 24 種真菌毒素的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters of the 24 mycotoxins

2.2 樣品前處理

樣品用研磨機研磨成粉末，過二號篩，臨用前取出。準確稱取樣品粉末2.0 g，精密加入84%乙腈-水溶液20 mL，12 000 r/min 高速攪拌3 min，5 000 r/min離心10 min，吸取上清液4 mL，加水稀釋至10 mL，渦旋混勻。精密吸取3 mL 緩慢通過活化的Oasis HLB柱（依次用甲醇和水各3 mL 洗脫），收集洗脫液，隨后加2 mL 水淋洗，棄去淋洗液，再依次加入3 mL 90%甲醇-水溶液、3 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液。合并洗脫液，40℃氮吹至近干。加40%甲醇-水溶液定容至2 mL，渦旋混勻，過0.22 μm 微孔濾膜，收集續(xù)濾液至進樣瓶，待測。

2.3 對照品溶液的配制

分別精密吸取24 種真菌毒素對照品適量，置20 mL 棕色容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，配制成儲備液，于-20℃冰箱中保存、備用。精密吸取混合對照品儲備液適量，加40%甲醇配制成適當濃度的系列對照品溶液，24 種真菌毒素儲備液和系列對照品溶液濃度見表2。

表2 24 種真菌毒素儲備液和系列對照品溶液濃度（ng/mL）Tab.2 Concentration of 24 mycotoxins reserve solution and serial reference solution（ng/mL）

3 結(jié)果

3.1 專屬性試驗

取經(jīng)預(yù)先篩查，未檢出目標真菌毒素的空白樣品，按“2.2”項下方法制備空白基質(zhì)溶液，40%甲醇做空白溶液。分別取空白溶液和空白基質(zhì)溶液稀釋混合對照品儲備液，配成相同濃度的混合對照品溶液和空白基質(zhì)對照品溶液。分別將空白溶液、空白基質(zhì)溶液、對照品溶液和空白基質(zhì)加標樣品溶液按“2.1”項下條件進樣檢測，色譜圖見圖2。結(jié)果顯示，空白基質(zhì)的離子峰與不與對照品離子峰重疊?？瞻谆|(zhì)不干擾真菌毒素的測定。

圖2 溶液UPLC-MS/MS 總離子流色譜圖Fig.2 Chromotogram of solution UPLC-MS/MS total ion

3.2 基質(zhì)效應(yīng)考察試驗

按“2.2”項下方法制備空白基質(zhì)溶液，用該空白基質(zhì)溶液稀釋得到對照品儲備液，配制一系列相同濃度梯度的溶液，上機檢測。得到基質(zhì)匹配標準曲線和外標法標準曲線。兩者曲線斜率分別記為Sm 和Ss，以信號抑制或増強效應(yīng)（Suppression/Enhance-ment，SSE）體現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)：SSE = Sm/Ss×100%。SSE ≈ 100%，表明基質(zhì)效應(yīng)不顯著，SSE＜100%表明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，SSE ＞100%表明存在基質(zhì)増強效應(yīng)。半夏曲基質(zhì)效應(yīng)見表3。結(jié)果顯示，HT-2 的SSE 為63.9%，存在基質(zhì)抑制效應(yīng)、AFM1的SSE 為126.1%，OTC 的SSE 為155.67%，存在基質(zhì)促進作用。為保證24 種真菌毒素的準確定量，應(yīng)采用基質(zhì)匹配的標準曲線進行測定。

3.3 基質(zhì)匹配標準曲線線性關(guān)系、檢測限、定量限檢測試驗

取經(jīng)預(yù)先篩查未檢出上述目標真菌毒素的樣品，按供試品方法制備空白基質(zhì)溶液。取適量對照品儲備液，加空白基質(zhì)溶液配制不同濃度的系列空白基質(zhì)對照品溶液，按優(yōu)化的液質(zhì)條件測定。以峰面積（Y）為縱坐標，濃度（X，ng/mL）為橫坐標建立24 種真菌毒素標準曲線。以信噪比S/N ≥3 計算檢出限（LOD），以S/N ≥10 計算定量限（LOQ）。半夏曲基質(zhì)匹配標準曲線線性關(guān)系、檢測限和定量限檢測見表3。24種真菌毒素線性相關(guān)系數(shù) （r）為0.998 8 ～ 1.000 0，LOD 為0.02 ～ 4.17μg/kg，LOQ 為0.03 ～ 9.92μg/kg。低于2020 年版《中國藥典》[10]、國家標準[11]及歐盟委員會[12]真菌毒素限量要求。

3.4 精密度試驗

精密吸取同一空白基質(zhì)線性對照品溶液，連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積，計算RSD 值。結(jié)果如表3 所示，RSD 為0.68% ～ 6.48%，均小于10%，表明儀器精密度良好。

3.5 加標回收率試驗

取經(jīng)預(yù)先篩查未檢出上述目標真菌毒素的樣品，分別在空白樣品中添加100、500、1 000μL 的混合對照品儲備液，進行低、中、高濃度三個水平的加標回收率試驗，每個水平平行制備3 份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣檢測，測定峰面積，計算回收率和RSD。結(jié)果見表4。各水平加標回收率為69.20% ～ 118.20%，RSD ＜13%，符合AOAC 和2020 年版《中國藥典》分析方法驗證指導(dǎo)原則限度要求[10,13]。

3.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一份中濃度水平加標供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣檢測。記錄峰面積并計算RSD。結(jié)果如表4 所示，24 種真菌毒素RSD為1.93% ～ 8.21%，表明供試品在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.7 重復(fù)性試驗

取經(jīng)預(yù)先篩查，未檢出上述目標真菌毒素的樣品，樣品中添加500μL 的混合對照品儲備液，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，平行制備6 份，進樣分析。記錄峰面積并計算RSD。結(jié)果如表4所示，24 種真菌毒素RSD 為1.33% ～ 10.36%，符合AOAC和2020 年版《中國藥典》分析方法驗證指導(dǎo)原則限度要求[10，13]。

3.8 樣品檢測

采用建立的方法對半夏曲飲片中真菌毒素進行檢測，結(jié)果見表5。10 批樣品共檢出8 種真菌毒素。2020 年版《中國藥典》規(guī)定AFB1不得過5μg/kg，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2總和不得過10μg/kg。薏苡仁藥材中ZEN 不得過500μg/kg[10]。暫未規(guī)定中藥中其他真菌毒素的限量標準，國家標準及歐盟委員會均規(guī)定食品中DON 不得過1 000μg/kg，食品中FB1與FB2總和不得過1 000μg/kg[11-12]，歐盟委員會規(guī)定甘草根及其浸漬物中OTA 不得過20 μg/kg[13]。參照相關(guān)標準，10 批樣品中真菌毒素含量未超出限度，但仍提示需要關(guān)注半夏曲中真菌毒素的污染。

表5 半夏曲樣品中真菌毒素含量測定結(jié)果（μg/kg，n = 3）Tab.5 Results of mycotoxins in Rhizoma Pinelliae Fermentata samples（μg/kg，n = 3）

4 討論

4.1 24 種真菌毒素選擇依據(jù)

《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》規(guī)定半夏曲需檢查黃曲霉毒素項目[14]，這提示需要關(guān)注半夏曲中黃曲霉毒素污染。根據(jù)2020 年版《中國藥典》中真菌毒素同時測定法中真菌毒素名單，有常見的黃曲霉毒素類、赭曲霉毒素類、伏馬毒素類、玉米赤霉烯酮類、單端孢霉烯族毒素A 型和B 型6 大類共10 種真菌毒素。本研究在此基礎(chǔ)上增加同類真菌毒素的檢測，全面考察半夏曲中真菌毒素的污染。ST 作為一種致癌真菌毒素，其代謝產(chǎn)物O-甲基-雜色曲霉素是AFB1、AFG1的前體物質(zhì)，因此ST 可能伴隨黃曲霉毒素同時存在[15]。CIT 在曲類中藥的紅曲中有大量檢出[5]。因此，考慮增加ST 和CIT 檢測。最終選擇24種真菌毒素以綜合評價半夏曲中真菌毒素污染情況。

4.2 色譜條件的選擇

本研究分別考察了水-乙腈、水-甲醇、5 mmol/L乙酸銨-乙腈、5 mmol/L 乙酸銨-甲醇、0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈流動相體系。實驗結(jié)果顯示：乙腈的分離效果和離子化效率優(yōu)于甲醇。水相中添加0.1%甲酸能提高FB1、FB2、FB3等化合物的離子化效率，并改善部分化合物峰型。因此，選擇0.1%甲酸-乙腈為流動相體系。同時比較了3 種真菌毒素常用色譜柱對24 種真菌毒素的分離情況，分別為Agilent Poroshell 120 EC-C18（150 mm×2.1 mm，2.7μm）、ACE Excel（100 mm×2.1 mm，1.7μm）和Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18（100 mm×3 mm，1.7μm）。結(jié)果表明，ACE Excel 柱和BEH柱造成了CIT 拖尾，而Agilent Poroshell 柱分離后化合物分離效果較好，CIT 峰型改善。因此，選擇Poroshell 120 EC-C18作為最終的分析柱。

4.3 提取溶劑的選擇

真菌毒素常用的提取溶劑為甲醇[16]、乙腈[17]與水的混合溶液。本研究比較84%乙腈-水、70%乙腈-水、80%甲醇-水、70%甲醇-水的提取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，84%乙腈-水對半夏曲基質(zhì)中各真菌毒素回收率較好，有21 種真菌毒素的回收率在70% ～120%，AFM1、AFM2、OTC 有適當?shù)幕|(zhì)增強效應(yīng)，可通過凈化過程降低基質(zhì)增強效應(yīng)。因此選擇84%乙腈-水作為提取溶劑。

4.4 凈化方法的選擇

MycoSep 226 多功能凈化柱[18]、Oasis HLB 固相萃取柱[19]等固相萃取柱常用于真菌毒素的凈化。本實驗比較了MycoSep 226、MycoSep 229、MFC100 與Oasis HLB 柱對實驗結(jié)果的影響，考察四種固相萃取柱對24 種真菌毒素的回收率。結(jié)果顯示，Oasis HLB柱整體凈化效果好。進一步優(yōu)化Oasis HLB 柱淋洗劑和洗脫劑的選擇，采用2 mL 水淋洗后，依次用3 mL 90%甲醇-水溶液、3 mL 甲醇洗脫后凈化效果較好，回收率滿足實驗要求。

5 結(jié)論

基于SPE 結(jié)合UPLC-MS/MS 建立了半夏曲中24種真菌毒素的檢測方法。與傳統(tǒng)方法相比，本方法擴大真菌毒素種類，縮短檢測周期，滿足相關(guān)標準對真菌毒素的限度要求，可實現(xiàn)半夏曲中24 種真菌毒素的定性和定量分析，為完善其質(zhì)量標準、保證臨床安全用藥提供依據(jù)，也為其他發(fā)酵類中藥中真菌毒素的檢測提供參考。