江張勝，董 婷，田麗偉，趙晨玲，聞雨雅，陳 潔

（1.安徽中醫(yī)藥大學 研究生院，安徽 合肥 230038 ; 2.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 腦病科，安徽 合肥 230031）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease, AD）是一種最為常見的癡呆類型，主要臨床表現(xiàn)為多種認知功能障礙和年齡依賴性記憶喪失。目前，膽堿酯酶抑制劑通常用于改善AD 患者的認知功能[1]，但這些藥物只能緩解疾病，而不能逆轉(zhuǎn)疾病的進展。相關研究表明，AD 的病因可能與一系列復雜的因素有關，如遺傳、腦梗、糖尿病等[2]。在病機復雜的疾病中，對“多組分、多靶點”藥物作用機制的研究具有重要意義。

在中醫(yī)上，AD 常被歸類為“癡呆”，由腦髓虛邪、擾亂腦孔所致[3]。研究表明，中醫(yī)運用補虛、開竅、化瘀活血法等治療AD，療效可靠[4]。通竅活血湯乃出自清代著名醫(yī)家王清任的《醫(yī)林改錯》，方中赤芍活血散瘀、清熱消腫；川芎行氣活血、祛風止痛，二藥配伍更增行氣活血而通腦絡之功；蔥白通陽理氣，大棗補脾益氣、養(yǎng)血安神、調(diào)和藥性；紅花散瘀止痛、活血通經(jīng)；生姜提神醒腦、通利血脈；桃仁破血行瘀、潤燥滑腸，諸藥合用具有活血祛瘀與通竅活絡等諸多功效[5]。現(xiàn)代藥理學研究表明，通竅活血湯可能通過抑制血管因子ET-1、促進VEGF 的生成和促進海馬神經(jīng)細胞的修復，從而改善VD 大鼠的學習記憶能力[6]。目前研究主要匯集于對臨床療效觀察和動物實驗來驗證某種藥物治療疾病的作用機制研究，缺乏藥物活性成分和疾病之間的靶向分子機制研究。網(wǎng)絡藥理學作為一個多成分、多靶點的學科體系，在研究復雜的分子機制方面有其獨特的優(yōu)勢[7-8]。本研究將運用網(wǎng)絡藥理學并結(jié)合分子對接技術，研究通竅活血湯治療AD 的潛在分子機制，為臨床治療AD 提供參考。

1 方法

1.1 通竅活血湯化學成分的篩選及靶點的獲取

借助中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺TCMSP[9]，以通竅活血湯中的主要藥物（赤芍、川芎、蔥白、大棗、紅花、生姜、桃仁）為關鍵詞檢索通竅活血湯中的作用靶點，采用生物口服利用度（OB）≥30%以及類藥性指數(shù)（DL）≥0.18 為成分篩選條件[10]，過濾出通竅活血湯中有效化學成分及與之相應的潛在預測靶點，將所取得潛在靶點名稱通過UniProt[11]數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換成標準基因名，得到相應人類基因。

1.2 疾病相關靶點獲取

通過GeneCards、OMIM、Drugbank、TTD 數(shù)據(jù)庫，以“Alzheimer’s disease”為檢索詞進行檢索，將所得基因合并且刪除重復，最終確定AD 靶點基因。

1.3 通竅活血湯與AD 交集靶點的篩選及“化學成分-交集靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建

將通竅活血湯的基因靶點和AD 的靶點數(shù)據(jù)上傳到Veen 在線作圖工具進行分析后，得到二者的交集靶點。采用Cytoscape3.7.2 軟件構(gòu)建通竅活血湯和AD 之間的“化學成分-交集靶點”網(wǎng)絡圖，同時篩選出其關鍵作用成分。

1.4 通竅活血湯與AD 交集靶點蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡的構(gòu)建及核心靶點篩選

將通竅活血湯與AD 的交集靶點上傳到String 數(shù)據(jù)庫，后將其進行PPI 網(wǎng)絡可視化分析，設定物種為Homo Sapiens，最低置信度為0.9，同時隱藏游離節(jié)點，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡圖，下載相應.tvs 文件。采用Cytoscape3.7.2 軟件中的CytoNCA 插件對PPI 網(wǎng)絡進行拓撲分析。其中，分析內(nèi)容為DC，篩選DC 值大于2 倍DC 中位數(shù)值的節(jié)點，便獲得核心靶點[12]。

1.5 GO 富集分析與KEGG 信號通路的構(gòu)建

借助DAVID 數(shù)據(jù)庫（取P＜0.05 為截止值）進行GO 生物功能和KEGG 通路富集分析。利用R4.0.3軟件將獲取結(jié)果進行可視化處理，獲取化學成分與疾病的交集靶點功能及其在信號通路中的作用機制。

1.6 通竅活血湯-主要通路-AD 分子對接

采用分子對接法評價AD 靶標與通竅活血湯之間的相互作用。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，采用PubChem 化合物數(shù)據(jù)庫獲取該化合物的3D結(jié)構(gòu)，經(jīng)Pymol 軟件進行水分子去除及受配體分離后，采用AutoDockTools 1.5.6 軟件被用來將氫加到蛋白質(zhì)中。將蛋白質(zhì)和配體轉(zhuǎn)化為.pdbqt 格式，采用AutoDock Vina1.1.2 軟件進行分子對接。結(jié)合親和力＜0 kcal/mol 表示配體能與受體結(jié)合；結(jié)合親和力值≤-5.0 kcal/mol 顯示較好的結(jié)合能力[13]。

2 結(jié)果

2.1 通竅活血湯主要化學成分

通過 TCMSP 數(shù)據(jù)庫進行收集，獲取通竅活血湯的潛在有效成分共127 個，其中，桃仁23 個、紅花22 個、川芎9 個、赤芍29 個、蔥白10 個、生姜5個、大棗29 個（OB值排名前20 的藥物化學成分見表1）。將靶點名稱上傳到UniProt 數(shù)據(jù)庫，設定物種為 “Homosapiens”，校正靶點的標準基因名并刪除重復，最終得到265 個靶基因。

2.2 AD 相關靶點獲取結(jié)果

通過GeneCards、OMIM、Drugbank 和TTD 數(shù)據(jù)庫。以“Alzheimer’s disease”為關鍵詞，檢索與AD 相關的作用靶點，得到有關AD 的靶點2 189 個，其中，GeneCards 以中位數(shù)進行篩選，最終篩選1 433 個，OMIM 543 個，Drugbank 65 個，TTD 148 個。將所獲得的基因靶點進行合并并剔除重復，最終得到靶點2 000個，見圖1。

圖1 AD 靶點圖Fig.1 AD target map

2.3 “通竅活血湯-AD-成分-靶點”可視化網(wǎng)絡

將通竅活血湯的基因靶點和AD 的靶點數(shù)據(jù)進行分Veen 析后，獲取二者交集靶點156 個，見圖2。利用Cytoscape3.7.2 軟件構(gòu)建通竅活血湯和AD 之間的“成分-靶點”多向性網(wǎng)絡圖，共有339 個節(jié)點，1 462 條邊。以大于節(jié)點度值的兩倍進行不斷篩選，得到排名前三個化合物，依次為槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇，其度值分別為304、190、128，這些化合物可能在通竅活血湯治療AD 中起主要作用，見圖3。

圖2 AD 與通竅活血湯交集韋恩圖Fig.2 Venn diagram of intersection of AD and Tongqiao Huoxue decoction

圖3 中藥有效成分-靶點圖Fig.3 Target diagram of TCM active components

2.4 通竅活血湯與AD 交集靶點蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡的構(gòu)建及核心靶點篩選

將通竅活血湯與AD 的靶點交集導入到String數(shù)據(jù)庫中進行PPI 分析，結(jié)果顯示有129 個節(jié)點和對應的567 條網(wǎng)絡。采用Cytoscape3.7.2 軟件中的CytoNCA 插件對PPI 網(wǎng)絡進行拓撲分析，得到關聯(lián)性最強的10 大核心靶點，分別為JUN、AKT1、TP53、RELA、CTNNB1、MAPK1、TNF、MAPK14、FOS 和IL6，見圖4。

圖4 通竅活血湯對血管性癡呆作用靶點的PPI 網(wǎng)絡圖Fig.4 PPI network diagram of target of Tongqiao Huoxue decoction on vascular dementia

2.5 GO 富集分析與KEGG 信號通路和通竅活血湯-主要通路-AD 進行網(wǎng)絡構(gòu)建

借助DAVID 數(shù)據(jù)庫進行GO 富集分析，獲取GO條目2 836 個，其中生物過程（BP）有條目2 544 個，細胞組成（CC）有條目103 個，分子功能（MF）有條目189 個（選取條件為P＜0.05），結(jié)果顯示，通竅活血湯與AD 的交集基因的GO 富集分析的BP 主要集中在RNA 聚合酶II 啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、基因表達的正向調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導等；CC 主要集中在胞質(zhì)、等離子體膜、細胞核等；MF 主要集中在結(jié)合蛋白、同一結(jié)合蛋白、酶結(jié)合等，見圖5。

圖5 通竅活血湯治療AD 的GO 生物功能富集氣泡圖Fig.5 GO biofunctional enrichment bubble diagram of Tongqiao Huoxue decoction for AD

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫對其進行KEGG 通路富集分析，以P＜0.05 為篩選條件，結(jié)果得到KEGG 信號通路177 條，部分結(jié)果如下，發(fā)現(xiàn)通竅活血湯治療AD 的潛在作用通路為脂質(zhì)與動脈粥樣硬化信號通路、AGE-RAGE 信號通路、PI3K-AKT 信號通路、TNF 信號通路等，見圖6。

圖6 通竅活血湯治療AD 的KEGG 信號通路富集氣泡圖Fig.6 Bubbles enrichment in KEGG signaling pathway in the treatment of AD by Tongqiao Huoxue decoction

2.6 通竅活血湯-主要通路-AD 分子對接

將所得前三個關鍵成分與前三個關鍵靶蛋白的分子進行對接，結(jié)果見表2、圖7。結(jié)果顯示，JUN與槲皮素的結(jié)合性最好，提示通竅活血湯的活性成分在治療AD 中發(fā)揮的作用較大。

圖7 活性成分與核心靶點的分子對接圖Fig.7 Molecular docking diagram of active ingredient and core target

表2 活性成分與核心靶點的結(jié)合能Tab.2 Binding energies of active ingredients and core targets

3 討論

通竅活血湯具有活血祛瘀與通竅活絡之功效，其有效成分槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等均為網(wǎng)絡中的重要節(jié)點，同時它們多屬于桃仁與紅花，體現(xiàn)了君藥在方劑中的關鍵作用?，F(xiàn)代藥理學研究表明，這些成分均有一定的抗炎、抗氧化功能，從而發(fā)揮改善記憶的作用，在防治AD 中扮演著關鍵角色[14-16]。

由PPI 網(wǎng)絡圖譜可以看出，JUN、AKT1、TP53等在疾病的治療中可能處于核心地位，經(jīng)過分子對接驗證，槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇與度值較高的靶點分子之間具有較好的結(jié)合性，體現(xiàn)了通竅活血湯在AD 的防治上具有多成分和靶點多向性的特點?；A研究表明，JUN 主要與免疫、細胞增殖、凋亡抑制等信號通路密切相關，對蛋白合成以及細胞代謝至關重要，并且此通路的活化與細胞炎癥反應有密切聯(lián)系[17]。AKT1 作為PI3K-AKT 信號通路中的關鍵信號因子，廣泛參與細胞的炎癥反應過程，同時調(diào)控細胞的增殖與生長[18]。MAPK1 屬于整合信號因子，可被炎癥因子及細胞氧化損傷等激活，是調(diào)控細胞增殖、分化、炎癥、凋亡等信號的關鍵靶點，并且下調(diào)MAPK1 可以改善AD 小鼠的認知情況[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)，TP53 既參與細胞增殖、衰老、DNA 修復和細胞死亡的嚴格控制，也參與調(diào)控FXN，進而導致神經(jīng)細胞的凋亡，與認知功能障礙關系密切[21]。TNF、IL-6 作為重要的細胞炎性因子，主要參與調(diào)節(jié)細胞炎性反應，同時與AD 的發(fā)病密切相關[22]。表明通竅活血湯中各藥材在AD 治療中的協(xié)同作用，體現(xiàn)了中藥多成分協(xié)同保護神經(jīng)的特性。

結(jié)合GO 生物功能富集分析，通竅活血湯還可通過多系統(tǒng)多途徑起到治療AD 的作用。其生物過程主要集中在RNA 聚合酶II 啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、基因表達的正向調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導等；細胞組分主要聚集在胞質(zhì)、等離子體膜、細胞核等；分子功能主要匯聚在結(jié)合蛋白、同一結(jié)合蛋白、酶結(jié)合等。提示通竅活血湯可能通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控細胞信號轉(zhuǎn)導、細胞膜轉(zhuǎn)運以及相應蛋白結(jié)合等過程發(fā)揮療效。KEGG 信號通路分析通竅活血湯治療AD 主要通過脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、AGE-RAGE、PI3K-AKT、TNF 信號通路有關。有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K- AKT 信號通路調(diào)節(jié)細胞增殖、運動、存活、代謝等多種生物學過程的功能，抑制多種神經(jīng)毒性機制，這些刺激與淀粉樣β、神經(jīng)纖維纏結(jié)和腦萎縮密切相關[23]，調(diào)節(jié)PI3K- AKT 信號通路能夠有效改善AD 大鼠的學習記憶能力[24]。TNF 信號通路參與許多系統(tǒng)性慢性炎癥和退行性疾病，是神經(jīng)炎癥的關鍵介質(zhì)之一。TNF 與TNFR1 和TNFR2 受體結(jié)合，以激活不同的細胞反應，可以是神經(jīng)保護或神經(jīng)變性。特別是TNF 可以在炎癥環(huán)境中誘導程序性壞死或壞死性凋亡。有研究表明，AD 患者死后腦的CA1錐體神經(jīng)元中TNF/TNF 受體-1 介導的壞死性凋亡通路中多種蛋白的表達增加，如RIPK3 和MLKL 的磷酸化表達增加[25]，由此可知，通竅活血湯可能通過作用于AGE-RAGE、PI3K-AKT、TNF 信號通路參與調(diào)整細胞周期，介導炎癥反應等途徑發(fā)揮神經(jīng)保護的作用機制，但臨床卻鮮有報道，故需進一步實驗驗證。

綜上可知，本研究主要通過網(wǎng)絡藥理學的方法對通竅活血湯治療AD 的潛在分子靶點和干預機制進行預測，結(jié)果顯示通竅活血湯主要通過槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等活性成分作用于JUN、AKT1、TP53、RELA、CTNNB1、MAPK1、TNF、MAPK14、FOS、IL-6 等靶點經(jīng)脂質(zhì)與動脈粥樣硬化信號通路、AGE-RAGE 信號通路、PI3K-AKT 信號通路、TNF信號通路等，對基因轉(zhuǎn)錄翻譯以及細胞膜轉(zhuǎn)運過程發(fā)揮作用，達到治療AD 的效果。并且使用分子對接技術對預測結(jié)果進一步驗證，驗證了通竅活血湯的活性成分作用于AD 疾病靶點目標的可靠性，為進一步研究其具體的作用機制奠定了一定的理論基礎。

4 結(jié)論

本研究基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術發(fā)現(xiàn)通竅活血湯治療阿爾茨海默病的活性分子主要為槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等，并與核心靶點JUN、AKT1、TP53 有較好的結(jié)合性，通過調(diào)控AGERAGE、PI3K-AKT、TNF 等信號通路來降低活性氧簇水平，減輕神經(jīng)炎癥反應，抑制神經(jīng)細胞凋亡，發(fā)揮其保護神經(jīng)細胞、改善認知的作用，為后續(xù)進行相關的基礎實驗提供一定的理論基礎。