黃唯 劉翠華 李紀同,2 劉玉潔 李玉柳 田明 曹廣海 張書鋒

（1.鄭州大學附屬兒童醫(yī)院腎臟風濕科，河南鄭州 450018；2.河南省兒童遺傳代謝性疾病重點實驗室，河南鄭州 450018）

Alport 綜合征（Alport syndrome，AS）是繼多囊性腎病后導致遺傳性進行性腎功能衰竭最常見的原因之一［1］。AS 主要表現(xiàn)為持續(xù)性血尿和進行性腎功能衰竭等，腎外特征主要包括感音神經(jīng)性耳聾及眼部病變等。AS 是由編碼腎小球基底膜Ⅳ型膠原α3、α4、α5 鏈的COL4A3、COL4A4和COL4A5基因突變引起的，導致腎小球基底膜結構破壞［2］。在遺傳方式上，AS 包括X-連鎖Alport 綜合征（X-link Alport syndrome，XLAS）、常染色體隱性Alport 綜合征（autosomal recessive Alport syndrome，ARAS）和常染色體顯性Alport 綜合征（autosomal dominant Alport syndrome，ADAS）3 種。AS 患兒中，XLAS 約占85%，通常由COL4A5基因突變引起；而ARAS 和ADAS 分別約占14%和1%，是由COL4A3或COL4A4基因的純合突變或復合雜合突變引起。據(jù)報道，AS的患病率約為1/5 000［3］，兒童AS約有13%［4］。AS早期很難發(fā)現(xiàn)，腎活檢或者基因檢測是必要的。盡管有關AS 致病基因的基因型與臨床表型的研究已取得一定進展，但隨著醫(yī)學技術的進步與發(fā)展，新的基因型不斷被發(fā)現(xiàn)，其基因型與表型的關系有待進一步完善。本研究擬通過回顧性分析我中心近5年收治的19例XLAS患兒基因檢測結果及臨床資料，探討COL4A5基因型與臨床表型的特點。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2017年4月—2022年3月就診于鄭州大學附屬兒童醫(yī)院腎臟風濕科、符合AS 診斷標準且資料完整的19 例患兒為研究對象。根據(jù)2018 年《Alport綜合征診斷和治療專家推薦意見》［5］，符合以下條件中（1）+（2）/（3）/（4）即可診斷：（1）主要表現(xiàn)為持續(xù)性的腎小球源性血尿或血尿伴有蛋白尿；（2）腎活檢組織學檢查中電鏡下可見腎小球基底膜彌漫性增厚或厚薄不一、致密層撕裂分層、籃網(wǎng)狀改變；（3）Ⅳ型膠原α鏈免疫熒光檢查提示α3、α4、α5鏈免疫熒光染色異?；蚱つw基底Ⅳ型膠原α5 鏈免疫熒光染色異常；（4）基因檢測發(fā)現(xiàn)COL4A5基因具有一個致病性突變。

1.2 資料收集

通過醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)收集患兒性別、起病年齡、臨床表現(xiàn)、家族史、尿常規(guī)、腎功能、聽力、眼部檢查結果等臨床資料，收集患兒腎臟組織光鏡、免疫熒光和電鏡結果。

1.3 基因檢測

采集患兒及其家系成員的外周血標本每人2 mL（乙二胺四乙酸抗凝血）送至第三方公司（智因東方北京全譜醫(yī)學檢驗實驗室、北京邁基諾基因科技股份有限公司），采用IDT 的xGen Exome Research Panel v2.0 進行全外顯子組捕獲測序。基因突變分析依據(jù)美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）制定的測序變異解讀指南進行致病性等級分類［6］。對候選致病基因進行聚合酶鏈反應后，經(jīng)ABI3730測序儀進行Sanger測序驗證。

所有研究對象的監(jiān)護人均對本研究知情同意，并簽署書面知情同意書。本研究獲鄭州大學附屬兒童醫(yī)院倫理委員會批準（2023-K-042）。

2 結果

2.1 一般情況

19例AS患兒中，男性12例（63%），女性7例（37%），男女比例為1.7∶1。起病年齡范圍1 歲1個月至11 歲8 個月，中位年齡為3.7 歲，≤3 歲者6例（32%），＞3 歲且＜6 歲者6 例（32%），≥6 歲者7例（37%）。19 例（100%）均以血尿為首發(fā)表現(xiàn)，11 例（58%）合并蛋白尿，2 例（11%）有聽力損傷。19 例患兒中，17 例（89%） 家族史陽性。見表1。

表1 19例AS患兒的臨床表現(xiàn)

2.2 AS患兒基因診斷及遺傳學特點

19 例AS 患兒分別來自19 個家系。單純COL4A5基因突變15 例（79%），其中錯義突變7種，大片段缺失突變3種，剪接突變2種，截斷突變1 種，移碼突變1 種，同義突變1 種，其中有10個新突變位點；COL4A5合并COL4A3或COL4A4基因突變4 例（例16、17、18、19）。通過Sanger測序家系驗證，12種基因突變來自母親，6種基因突變來自父親，1 例為自發(fā)突變，4 例突變來源不詳。見表2。

表2 19例AS患兒的基因突變位點及致病性分析

2.3 腎臟病理結果

11 例患兒完成腎活檢。光鏡結果提示11 例（100%）均為腎小球輕微病變。電鏡結果顯示，6例（55%）可見基底膜致密層撕裂、分層改變；1例（9%） 為局部可疑撕裂、分層改變；4 例（36%）未見致密層撕裂、分層改變。11 例行腎活檢患兒中，10例行Ⅳ型膠原免疫熒光檢測，其中4例（40%）α3、α5均表達缺失；2例（20%）α3表達正常，α5 節(jié)段性陽性；2 例（20%）α3、α5 節(jié)段性陽性；1 例（10%）α3 表達正常，α5 表達缺失； 1 例（10%） α3、 α5 表達正常。 見表1、圖1。

圖1 部分患兒典型的腎臟病理圖 A～C圖為光鏡下結果，A、B圖均為過碘酸雪夫染色，圖中可見腎小球系膜細胞和基質(zhì)輕微增生，腎小管上皮細胞空泡變性；C 圖為蘇木精-伊紅染色，圖片未見異常。D～F 圖為Ⅳ型膠原免疫熒光染色，D、F圖可見α5鏈表達缺失；E圖可見α5鏈有腎小球基底膜及包曼氏囊節(jié)段性陽性、腎小管基底膜表達缺失。G～I圖為電鏡下結果，G圖可見基底膜厚薄不一，厚度100～170 nm，基底膜致密物節(jié)段性撕裂、分層改變；H圖可見基底膜節(jié)段性變??；I圖可見基底膜致密層撕裂、分層改變，空泡變性。上述圖片放大倍數(shù)均為400×。

2.4 COL4A5基因型與表型關聯(lián)性

3 例患兒存在COL4A5基因大片段缺失（例7，loss51-53；例9，loss2-37；例14，loss3-53），其中例7、例9起病即存在肉眼血尿和蛋白尿，例14起病僅有鏡下血尿，其父親及叔叔均為慢性腎臟病5期并伴有聽力減退，基因檢測提示其父親與叔叔在COL4A5基因突變位點處存在與患兒相同的缺失。1 例（例15）表現(xiàn)為AS 合并IgA 血管炎腎炎，其臨床表現(xiàn)僅有鏡下血尿，結合腎臟病理及基因檢測結果明確診斷為COL4A5基因突變的AS。

2.5 隨訪

19例患兒中，12例失訪，7例不定期于我院復診。截至2023 年4 月14 日，中位隨訪時間26（范圍：16～69）個月，7 例患兒腎功能均正常，病情未進展。

3 討論

AS 是一種預后較差的遺傳性腎臟疾病，由于病情進展速度較快，早期診斷十分重要。據(jù)報道，皮膚基底膜Ⅳ型膠原α5 鏈免疫熒光染色、腎活檢電鏡檢查及基因檢測對AS的檢出率分別為77.8%、92.6%和96.6%［8］。因此，腎活檢及基因檢測對診斷該病是必要的。

本研究有11 例患兒行腎活檢，10 例患兒行Ⅳ型膠原免疫熒光染色，結果顯示Ⅳ型膠原染色診斷率為90%（9/10），電鏡下診斷率為55%（6/11），Ⅳ型膠原免疫熒光檢測診斷率較高，電鏡診斷率較低，可能與樣本量較少有關。研究證明基因檢測對診斷AS 至關重要［9］。本研究有1 例患兒（例13），家族史陽性，臨床表現(xiàn)無特異性，腎活檢無AS 典型改變，但基因檢測結果提示為COL4A5基因突變的AS。另有1例患兒（例15），以反復出血性皮疹入院，臨床診斷IgA血管炎腎炎，因患兒合并孤立性血尿，行腎活檢提示未見典型基底膜致密層撕裂、分層改變，Ⅳ型膠原染色顯示α5 鏈表達缺失。追問病史有血尿家族史，基因檢測出COL4A5基因突變c.3372A＞G(p.P1124=)，該變異為同義突變。以上結果提示基因檢測是十分必要的。

隨著基因檢測的普及，多基因遺傳模式開始被發(fā)現(xiàn)，Mencarelli等［10］最先提出了雙基因遺傳的可能性。研究表明，COL4A5合并COL4A3或COL4A4的雙基因突變患兒臨床表現(xiàn)的嚴重程度介于ARAS 與ADAS 之間。Choi 等［11］研究也提出，AS 可能由雙基因控制，但該研究并未證實臨床表型加重是兩種基因共同作用的結果或是兩種基因中的一種突變所致。Zhang 等［12］報道稱，COL4A5合并COL4A3或COL4A4基因突變的男性XLAS 患兒會有更嚴重的蛋白尿。胡寧寧等［13］研究發(fā)現(xiàn)COL4A5合并COL4A3或COL4A4雙基因突變女性XLAS患者發(fā)病年齡較早，且合并有不同程度的蛋白尿。此外，Savige 等［14］研究表明具有致病性COL4A3或COL4A4基因突變可能表現(xiàn)出比單個突變更嚴重的臨床表型。本研究中，4例患兒存在雙基因突變，其中3例為COL4A5合并COL4A4基因，1例為COL4A5合并COL4A3基因。研究發(fā)現(xiàn)，4例患兒中，2 例表現(xiàn)為肉眼血尿合并蛋白尿，1 例肉眼血尿及1例鏡下血尿。該4例患兒是由雙基因突變所致的AS，但由于觀察例數(shù)偏少，且未進行生物學功能驗證，還需進一步研究。

有關男性XLAS患者基因型與表型相關性研究中，具有大片段缺失的突變比錯義突變臨床表現(xiàn)更為嚴重［15-17］。本研究中，3例患兒存在大片段缺失，其中2 例男性患兒均有肉眼血尿合并蛋白尿，臨床表型較重。另1例（例14）為女性患兒，其父親與叔叔均被診斷為慢性腎臟病5期，并伴聽力減退，而該患兒目前僅表現(xiàn)出鏡下血尿，可能是該患兒年齡較小，疾病進展未達到肉眼血尿水平，需要進一步隨訪。

Plant 等［18］曾報道1 例年輕女性雜合子，4 歲時即有血尿表現(xiàn)，腎活檢支持AS 診斷，其父親DNA 的單鏈構象多態(tài)性分析顯示，擁有大致等量的正常和突變等位基因，但當時父親表型正常，43 歲時才有腎功能衰竭表現(xiàn)。該研究指出不排除XY/XXY的體細胞嵌合體可能，且由于嵌合體的出現(xiàn)，導致其表型更類似于雜合子女性患者的表型，使得父親表型更輕微。本研究中的例3，臨床表現(xiàn)為鏡下血尿，基因突變來自母親，但其母親無臨床表現(xiàn)。我們推測，（1）X 染色體失活：Navarro-Cobos 等［19］研究表明，XX 雌性和XY 雄性之間的等效X 連鎖基因表達通常通過X 染色體失活來實現(xiàn)，但X 染色體的失活并不是100%，大約有15%的X連鎖基因在一定程度上出現(xiàn)基因逃逸，且這些逃逸的失活基因仍可有不同程度的表達。我們推測，該患兒母親體內(nèi)出現(xiàn)致病基因的失活，當致病基因傳遞給該患兒后，失活的基因出現(xiàn)不同程度的表達，從而表現(xiàn)出母親表型正常，女兒患病。（2）嵌合體：嵌合體是一種由至少兩個具有不同基因型的細胞群組成的個體。當攜帶者中存在足夠比例表達正?；虻募毎麜r，則臨床表現(xiàn)正常；若表達異?；虻募毎壤嘤谡＜毎?，則出現(xiàn)相應的臨床表現(xiàn)［20］。因此，該患兒體內(nèi)由于表達異常細胞的比例高于正常細胞，從而出現(xiàn)臨床表型。

綜上所述，本研究拓寬了已知的COL4A5基因突變譜及臨床表型，對AS 的診斷和遺傳咨詢、預后有一定的指導意義。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突關系。