李燕 陸斯良 莫艷 經(jīng)連芳 姚麗平 譚偉 韋秋芬

（廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院新生兒醫(yī)療中心/廣西兒科疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣西南寧 530003）

神經(jīng)發(fā)育損害（neurodevelopmental impairment，NDI） 是一組由中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）生長(zhǎng)發(fā)育異常所導(dǎo)致的復(fù)雜疾病，包括運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知、語言發(fā)育遲緩等［1］。早產(chǎn)是導(dǎo)致NDI 的一個(gè)重要因素，胎齡越小NDI 發(fā)生率越高。本項(xiàng)目組前期多中心研究發(fā)現(xiàn)，廣西地區(qū)胎齡＜28周早產(chǎn)兒NDI 的發(fā)病率高達(dá)35.9%［2］，形勢(shì)嚴(yán)峻，但目前NDI 的治療缺乏有效手段，仍以預(yù)防為主，嚴(yán)重影響著兒童的健康和生活質(zhì)量，已成為廣西地區(qū)新生兒科醫(yī)師重點(diǎn)關(guān)注的一個(gè)臨床問題。

腸道菌群被認(rèn)為是人體的第二個(gè)基因組，已有研究證實(shí)了它與CNS 之間的潛在聯(lián)系，二者可通過內(nèi)分泌/神經(jīng)、免疫和直接的神經(jīng)作用進(jìn)行雙向“溝通”，即微生物-腸-腦軸［3］。在生命早期，腸道內(nèi)的微生物對(duì)CNS 的發(fā)育至關(guān)重要，大腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的成熟、突觸的發(fā)生、軸突的生長(zhǎng)等過程都與腸道菌群關(guān)系密切［4］。與足月兒相比，早產(chǎn)兒腸道菌群多樣性低、定植速度慢、成熟晚，易受外界因素影響，導(dǎo)致菌群的定植與發(fā)育模式發(fā)生改變［5-6］?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，精神分裂癥譜系障礙（乳桿菌屬等豐度增加）、孤獨(dú)癥譜系障礙（雙歧桿菌屬等豐度減少）及注意缺陷多動(dòng)障礙（雙歧桿菌屬等豐度增加）等NDI的發(fā)生發(fā)展與早期腸道內(nèi)菌群的失調(diào)相關(guān)聯(lián)［7-9］，但受研究設(shè)計(jì)、樣本數(shù)量及地域等因素的影響，此類的研究結(jié)果存在異質(zhì)性。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于NDI早產(chǎn)兒腸道微生物組特征的研究主要為橫斷面研究，難以系統(tǒng)地、詳盡地了解菌群的演替過程，因此，為探索腸道菌群與疾病之間的關(guān)聯(lián)性，縱向性的研究是必要的。

本研究采用了前瞻性、縱向、單中心隊(duì)列的設(shè)計(jì)，收集多個(gè)時(shí)間點(diǎn)早產(chǎn)兒的糞便樣本，應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)分析NDI與非NDI早產(chǎn)兒之間腸道菌群的差異，旨在豐富NDI早產(chǎn)兒腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究數(shù)據(jù)。本研究對(duì)揭示腸道菌群與早產(chǎn)兒NDI之間的聯(lián)系，拓展早產(chǎn)兒NDI防治的新思路具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象及分組

本研究為前瞻性、縱向、單中心隊(duì)列研究，選取2019年9月1日—2021年9月30日我院新生兒重癥監(jiān)護(hù)室（neonatal intensive care unit，NICU）收治的胎齡＜32 周且出生體重＜1 500 g 的早產(chǎn)兒為研究對(duì)象。在糾正胎齡1.5～2歲時(shí)行格塞爾發(fā)育量表評(píng)估，動(dòng)作能、應(yīng)物能、言語能、應(yīng)人能任何一部分得分＜76分納入NDI組，反之為正常組。本研究得到我院醫(yī)學(xué)科研與臨床試驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（桂婦保院醫(yī)倫快審2019-4號(hào)），新生兒父母或法定監(jiān)護(hù)人知情同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）胎齡＜32 周，體重＜1 500 g；（2）生后立即轉(zhuǎn)入NICU 治療；（3）新生兒父母或法定監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）窒息或診斷為缺血缺氧性腦病；（2）中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染；（3）磁共振成像檢查提示存在大腦發(fā)育異?；蚧危唬?）遺傳代謝性疾??；（5）急、慢性膽紅素腦??；（6）明確頭顱外傷；（7）自動(dòng)出院或死亡。

1.2 一般資料采集

采用自制的廣西胎齡＜32周早產(chǎn)兒病例資料收集表采集早產(chǎn)兒的相關(guān)資料，包括父母及新生兒出生基本信息、圍生期情況、母親孕期情況、疾病及診治情況、出院及預(yù)后等。

1.3 糞便標(biāo)本采集

采用一次性無菌糞便凍存管收集出院前1 d、輔食添加前1 d 及糾正胎齡1 歲3 個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的糞便樣本，在1.5 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至-80℃保存待用。

1.4 樣本DNA提取及測(cè)序

采用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（Omega Bio-Tek，Norcross，GA，U.S.）試劑盒提取DNA，NanoDrop 2000檢測(cè)DNA濃度及純度，-20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增16S rRNA-V4 區(qū)，引物序列為338F （5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'） 和 806R （5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。PCR 產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences， Union City，CA，USA）進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，檢測(cè)定量后使用Illumina MiSeq PE300 平臺(tái)上機(jī)測(cè)序，測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.5 生物信息學(xué)分析

測(cè)序數(shù)據(jù)采用FLASH 軟件將序列進(jìn)行拼接，用Uparse 軟件過濾嵌合體，獲得優(yōu)化數(shù)據(jù)后使用序列降噪方法（DADA2/Deblur 等）處理，獲得擴(kuò)增序列變體（amplicon sequence variant，ASV）代表序列和豐度信息，隨后分析菌群多樣性及組成。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和率或構(gòu)成比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況

本研究共納入455 例極低出生體重（very low birth weight，VLBW）早產(chǎn)兒，中途失訪68例，隨訪387 例，排除糞便樣本采集不全172 例，最終入組215 例，其中正常組115 例，NDI 組100 例。住院期間經(jīng)磁共振成像檢查，除NDI組的2例早產(chǎn)兒有少量腦實(shí)質(zhì)出血，在隨訪期間出現(xiàn)腦軟化外，其余早產(chǎn)兒均未見明顯異常。兩組早產(chǎn)兒性別、胎齡、出生體重、出生頭圍、出生身長(zhǎng)等一般情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組早產(chǎn)兒一般情況比較

2.2 糞便樣本收集及ASV分析

共收集糞便樣本645 份，其中正常組在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)各115 份，NDI 組各100 份。兩組早產(chǎn)兒在ASV水平上的Venn圖結(jié)果如圖1所示，整體上正常組所獨(dú)有的ASV 數(shù)量更多，3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別獨(dú)有602、1 134、712 個(gè)物種，NDI 組則有613、595、544個(gè)物種，6個(gè)亞組所共有的物種數(shù)量為308個(gè)。

圖1 兩組早產(chǎn)兒在不同時(shí)間點(diǎn)的ASV 分類學(xué)水平物種Venn圖 不同顏色代表不同的分組，重疊部分（白色）表示多個(gè)分組中共有的物種，未重疊的部分表示該分組特有的物種，數(shù)字表示對(duì)應(yīng)的物種數(shù)目。M 表示正常組，N 表示NDI 組，數(shù)字1、2、3分別對(duì)應(yīng)出院前1 d、輔食添加前1 d、糾正胎齡1歲。

2.3 物種多樣性分析

2.3.1 α 多樣性分析 NDI 組早產(chǎn)兒Shannon 多樣性指數(shù)在糾正胎齡1歲時(shí)高于正常組（P＜0.05），見表2。

表2 兩組早產(chǎn)兒Shannon多樣性指數(shù)比較 （± s）

表2 兩組早產(chǎn)兒Shannon多樣性指數(shù)比較 （± s）

注：［NDI］神經(jīng)發(fā)育損害。

?

2.3.2 β多樣性分析 主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）顯示，屬水平上兩組早產(chǎn)兒腸道菌群的組成在出院前1 d 時(shí)相似（R2=0.008，P=0.130）。至添加輔食前，菌群的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)差異，可在一定程度上區(qū)分兩組樣本（R2=0.035，P=0.001），其中PC1可解釋24.51%的差異。在糾正胎齡1歲時(shí)，兩組早產(chǎn)兒腸道菌群的組成已出現(xiàn)明顯的差異（R2=0.022，P=0.003），在PCoA圖中可區(qū)分大部分樣本，其中PC1 可解釋25.80%的差異。見圖2。

圖2 兩組早產(chǎn)兒在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腸道菌群屬水平PCoA 分析 A、B、C 圖分別對(duì)應(yīng)出院前1 d、添加輔食前1 d、糾正胎齡1歲，藍(lán)色圓點(diǎn)表示正常組，紅色三角形表示NDI組，每個(gè)小圖形代表1個(gè)樣本，置信橢圓水平為95%，橫坐標(biāo)表示主坐標(biāo)成分1，縱坐標(biāo)表示主坐標(biāo)成分2，分析采用Bray-Curtis距離算法。

2.4 物種組成及差異分析

門水平上，兩組早產(chǎn)兒均以放線菌門、變形菌門、厚壁菌門為主，占全部菌門的90%以上。在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，正常組早產(chǎn)兒的優(yōu)勢(shì)菌門分別為變形菌門（49.21%）、厚壁菌門（33.96%）、放線菌門（38.72%）。NDI組早產(chǎn)兒除了出院前1 d以變形菌門（44.26%）為優(yōu)勢(shì)菌門外，其余時(shí)間點(diǎn)均以放線菌門（輔食添加前1 d：43.57%，糾正胎齡1歲：49.85%）為主，見圖3A。

圖3 兩組早產(chǎn)兒菌群組成分布條形圖 A圖表示門水平分布條形圖，B圖表示屬水平分布條形圖，圖例從上至下按照相對(duì)豐度由大到小排序，M 表示正常組，N 表示NDI 組，數(shù)字1、2、3 分別對(duì)應(yīng)出院前1 d、輔食添加前1 d、糾正胎齡1歲，屬水平上僅展示豐度排行前15的物種。

屬水平上，正常組和NDI組早產(chǎn)兒各時(shí)點(diǎn)腸道內(nèi)菌群主要由雙歧桿菌屬、大腸埃希菌屬-志賀菌屬、腸球菌屬、克雷伯氏菌屬、未分類腸桿菌屬、鏈球菌屬、狹義梭菌屬1及乳桿菌屬組成，多數(shù)以雙歧桿菌為優(yōu)勢(shì)菌屬。隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，兩組早產(chǎn)兒腸道內(nèi)的雙歧桿菌的豐度逐漸增加（正常組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別為16.38%、26.07%、36.24%；NDI組分別為21.46%、40.97%、46.64%），一些條件致病菌如克雷伯氏菌、腸球菌的豐度則逐漸降低。見圖3B。

NDI組腸道內(nèi)雙歧桿菌屬豐度在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于正常組（出院前1 d：Z=-2.162，P=0.031；添加輔食前1 d：Z=-3.729，P＜0.001；糾正胎齡1歲：Z=-2.429，P=0.015），腸球菌屬的豐度在輔食添加前1 d、糾正胎齡1 歲時(shí)也高于正常組（Z=-3.687，P＜0.001；Z=-2.782，P=0.005）。正常組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)腸道內(nèi)嗜黏蛋白阿克曼菌（以下稱Akk菌）屬的豐度分別為1.0%、3.6%、3.0%，NDI組分別為0.7%、0.5%、0.1%，在輔食添加前1 d時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-3.250，P=0.002）。見圖4。

圖4 兩組早產(chǎn)兒各時(shí)點(diǎn)屬水平群落組成差異柱狀圖 A、B、C圖分別對(duì)應(yīng)出院前1 d、添加輔食前1 d、糾正胎齡1歲，圖中左半部分表示物種豐度占比，不同顏色代表不同分組，右半部分則表示兩組相比物種豐度的差值，圓點(diǎn)顏色顯示為物種豐度較大的分組。最右側(cè)為P值，*0.01＜P≤0.05，**0.001＜P≤0.01，***P≤0.001。

以屬水平的角度進(jìn)行線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA），出院前1 d 時(shí)造成兩組早產(chǎn)兒腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異的主要菌屬為雙歧桿菌屬（LDA=4.57）、皮桿菌屬（LDA=4.24）及難辨梭菌屬（LDA=4.32）；添加輔食前1 d 為Akk菌屬（LDA=4.20）、雙歧桿菌屬（LDA=4.85）、腸球菌屬（LDA=4.57）；糾正胎齡1 歲時(shí)為雙歧桿菌屬 （LDA=4.70）、 腸球菌屬 （LDA=4.31）。見圖5。

圖5 兩組早產(chǎn)兒各時(shí)點(diǎn)LDA判別柱形圖 A、B、C圖分別對(duì)應(yīng)出院前1 d、添加輔食前1 d、糾正胎齡1歲，LDA閾值設(shè)定為L(zhǎng)DA＞4，圖中所展示的是差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的物種。

3 討論

生命早期的1 000 d 是大腦發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期，抗生素的應(yīng)用、飲食和環(huán)境等因素都有可能通過微生物-腸-腦軸的“溝通”間接影響這一過程［10-11］。本研究發(fā)現(xiàn)，NDI 組早產(chǎn)兒腸道菌群的Shannon 指數(shù)在糾正胎齡1 歲時(shí)顯著高于正常組，但此時(shí)兩組早產(chǎn)兒的腸道菌群仍處于發(fā)育階段，菌群的多樣性在接下來的時(shí)間里仍會(huì)發(fā)生明顯變化［12］，因此還難以對(duì)NDI 早產(chǎn)兒菌群的多樣性特征下定論。

門水平上，兩組早產(chǎn)兒腸道內(nèi)菌群主要由放線、變形、厚壁3 大菌門組成，這與LaTuga 等［13］的研究結(jié)果一致。正常情況下，人類腸道內(nèi)最先定植的菌群通常為兼性厭氧菌，隨著氧氣的消耗，嚴(yán)格厭氧菌如擬桿菌等才得以大量定植，之后便逐漸成熟形成以厭氧菌為主導(dǎo)的菌群結(jié)構(gòu)［14］，因此正常足月兒腸道內(nèi)擬桿菌門通常占比較高，從這一角度來看，VLBW早產(chǎn)兒的腸道環(huán)境可能并不適合擬桿菌生存。從屬水平上分析，兩組早產(chǎn)兒腸道內(nèi)檢出8 種主要的核心菌屬，與Seki 等［15］的研究結(jié)果相似。該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)克雷伯氏菌在腸道中過度生長(zhǎng)是腦損傷的一個(gè)高度預(yù)測(cè)因素，然而在本研究中并未發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象，且兩組早產(chǎn)兒克雷伯氏菌在任一時(shí)間點(diǎn)相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其可能的原因是醫(yī)療環(huán)境等因素的影響。兩組早產(chǎn)兒對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，NDI組腸道內(nèi)雙歧桿菌屬豐度在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于正常組，一些條件致病菌如腸球菌屬豐度也顯著增加。此外，PCoA分析顯示，出院前1 d兩組早產(chǎn)兒腸道菌群結(jié)構(gòu)相似，出院后由于接觸了復(fù)雜的自然環(huán)境，菌群組成差異便可明顯區(qū)分開來，以上結(jié)果表明兩組早產(chǎn)兒腸道菌群可能存在著不同的定植和發(fā)育模式。

值得注意的是，本研究中兩組早產(chǎn)兒都出現(xiàn)了以雙歧桿菌為優(yōu)勢(shì)菌屬的結(jié)構(gòu)，這可能是因?yàn)镹ICU 內(nèi)廣譜抗生素和益生菌的應(yīng)用。VLBW 早產(chǎn)兒因其免疫系統(tǒng)發(fā)育相對(duì)不成熟，易并發(fā)各種感染，NICU 內(nèi)應(yīng)用抗生素的現(xiàn)象十分常見，長(zhǎng)期抗生素應(yīng)用可導(dǎo)致腸道內(nèi)物種數(shù)量及豐度顯著下降，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用益生菌，菌群將逐漸過渡并轉(zhuǎn)變?yōu)橐噪p歧桿菌為主導(dǎo)的結(jié)構(gòu)，然而這種早期建立起來的菌種將在生命后期占據(jù)重要的生態(tài)位［16］，整個(gè)過程相當(dāng)于“重塑”了菌群的組成。雙歧桿菌對(duì)兒童腸道的健康和免疫系統(tǒng)十分重要，它有助于加強(qiáng)腸道屏障功能并可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)活性物質(zhì)發(fā)揮腦保護(hù)的作用［17-19］。Beghetti等［20］研究發(fā)現(xiàn)，VLBW早產(chǎn)兒出生后1個(gè)月腸道內(nèi)雙歧桿菌豐度的降低與遠(yuǎn)期NDI的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，然而在本研究中早產(chǎn)兒腸道內(nèi)雙歧桿菌豐度的增高似乎不能預(yù)測(cè)或阻止NDI的發(fā)生，這可能與診療操作和觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)的不同有關(guān)，因此本研究還無法確定雙歧桿菌在NDI中的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，NDI組早產(chǎn)兒腸道內(nèi)Akk菌的豐度始終低于正常組，Akk菌是一種腸道共生菌，正常情況下在生后逐漸增加，在宿主平衡健康與疾病的過程中起著重要作用，已有研究證明了Akk 菌的缺乏與多種疾病如炎癥、肥胖相關(guān)聯(lián)，同時(shí)也包括了CNS 疾病［21］，證明了腸道內(nèi)Akk菌與大腦之間的聯(lián)系，而Akk菌是否在NDI的發(fā)生發(fā)展中起到了關(guān)鍵作用？還需要更深入的研究來證明。

綜上，在糾正胎齡1歲時(shí)，NDI組早產(chǎn)兒腸道內(nèi)菌群的多樣性顯著高于正常組；NDI組腸道內(nèi)雙歧桿菌屬豐度在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于正常組；Akk 菌屬豐度均低于正常組，僅在添加輔食前1 d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，NDI組腸道內(nèi)腸球菌屬豐度在添加輔食前1 d 和糾正胎齡1 歲時(shí)顯著高于正常組；造成兩組早產(chǎn)兒菌群存在差異的主要菌屬為雙歧桿菌、Akk菌和腸球菌?？傊狙芯拷Y(jié)果表明NDI與非NDI早產(chǎn)兒腸道菌群的組成存在顯著差異。本研究也存在一些局限性：首先，僅設(shè)計(jì)了3個(gè)糞便樣本收集的時(shí)間點(diǎn)，無法更好地觀察NDI早產(chǎn)兒腸道菌群的演替過程，未來應(yīng)增加早期（如6 個(gè)月內(nèi)）及糾正胎齡2、3 歲時(shí)等觀察時(shí)間點(diǎn)；其次，VLBW早產(chǎn)兒個(gè)體間腸道菌群存在高度變異，本研究的樣本量有限，菌群的多樣性和構(gòu)成分析可能存在偏倚，還有待后續(xù)更大規(guī)模的隊(duì)列研究；最后，本研究?jī)H為16S rRNA 的描述性研究，無法對(duì)腸道內(nèi)菌群的代謝產(chǎn)物變化和相應(yīng)的分子機(jī)制作出分析，這有待更深入的研究以揭示腸道菌群在NDI中的潛在作用。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。