邱雪萌， 鄭娟， 薛威， 毋少宇， 祁陳， 韓月月， 燕永亮， 戰(zhàn)崳華

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

氮素是植物重要的營養(yǎng)元素之一，也是農(nóng)作物產(chǎn)量及品質(zhì)的限制因素，工業(yè)氮肥的過度施用造成了土壤板結(jié)、水體富營養(yǎng)化等環(huán)境問題[1-2]。自然界中，某些原核微生物在常溫常壓下通過固氮酶將空氣中的氮素轉(zhuǎn)化為銨，這一過程稱為生物固氮[3]，利用生物固氮減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對工業(yè)氮肥的依賴，最終實現(xiàn)主要農(nóng)作物自主固氮是生物固氮領(lǐng)域的研究熱點。然而，天然固氮體系易受氧氣等環(huán)境因素的影響、固氮菌株宿主范圍較窄，使得生物固氮至今難以大規(guī)模應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[1-4]?？茖W(xué)家們對此提出了3種技術(shù)策略：擴大根瘤菌的宿主范圍、構(gòu)建高效聯(lián)合固氮體系以及人工設(shè)計固氮裝置[5]。

自1972年以接合轉(zhuǎn)移的方法首次成功構(gòu)建人工固氮大腸桿菌以來[6]，隨著生物固氮基因工程和合成生物學(xué)的發(fā)展，通過將固氮相關(guān)基因轉(zhuǎn)移到不同的底盤生物中，并經(jīng)過人工改造進一步提高固氮裝置中固氮模塊的表達，在構(gòu)建自主固氮植物領(lǐng)域取得了一系列重要進展[7]。耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans）R1是1株進化地位特殊的革蘭氏陽性菌，具有極強的輻射抗性[8]。同時，耐輻射異常球菌因具有獨特的生長特性以及表達新型工程功能蛋白的能力，已經(jīng)作為新的底盤微生物在生物技術(shù)和生物修復(fù)中得以應(yīng)用[9]。類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）WLY78是1株革蘭氏陽性固氮菌，P. polymyxaWLY78含有1個由9個固氮基因（nifB, nifH, nifD, nifK,knife, nifN, nifX, hesA, nifV）組成的最小固氮基因簇，并且該固氮基因簇的9個基因為共轉(zhuǎn)錄表達，組成了1個轉(zhuǎn)錄單元，將此固氮基因簇轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中能使大腸桿菌成功表達固氮酶活性[10]。

本研究通過將革蘭氏陽性類芽孢桿菌WLY78的固氮模塊導(dǎo)入耐輻射異常球菌R1中獲得重組耐輻射異常球菌R78，對該菌株在不同水平的表達特性進行探究，同時結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析，初步明確固氮基因簇在重組耐輻射異常球菌的表達特征，以期為進一步固氮模塊設(shè)計和底盤優(yōu)化奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與培養(yǎng)條件 耐輻射異常球菌R1、質(zhì)粒pRADZ3以及施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501為本實驗室保存，質(zhì)粒pHY300PLK-78由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)贈予。高頻轉(zhuǎn)化宿主菌株DH5α購自北京康為世紀公司，高頻轉(zhuǎn)化宿主菌株JM109購自Solarbio公司。大腸桿菌采用LB培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)，耐輻射異常球菌及其衍生菌株采用TGY培養(yǎng)基置于30 ℃培養(yǎng)。

1.1.2 試劑與耗材 限制性核酸內(nèi)切酶購自NEB公司，質(zhì)粒提取試劑盒以及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自Magen公司，細菌基因組DNA提取試劑盒購自Tiangen公司，細菌RNA提取試劑盒購自Analytik Jena公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，熒光定量PCR試劑購自Vazyme公司。試驗所涉及的引物合成以及測序均由生工生物公司完成。

1.1.3 主要儀器 PCR儀（型號ABI Veriti? Dx）和實時熒光定量擴增儀（型號ABI 7500）均購自美國Thermo Fisher公司，數(shù)字PCR儀（型號Naica）購自Stilla公司，超微量分光光度計（型號NanoPhotometer-NP80）購自德國Implen公司，紫外可見光分光光度計（型號U-3010）購自日本Hitachi公司，臺式高速冷凍離心機（型號5424R）購自德國Eppendorf公司，全溫培養(yǎng)器（型號THZC-1）購自北京天林恒泰公司，核酸蛋白提取儀（型號MP-FastPrep-24）購自美國Thermo Fisher公司，凝膠成像系統(tǒng)（型號GelDoc XR）購自美國Bio-Rad公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 重組耐輻射異常球菌R78的構(gòu)建方法 通過酶切連接反應(yīng)，用XbaⅠ、BamHⅠ 限制性內(nèi)切酶以及T4 DNA連接酶將質(zhì)粒pHY300PLK-78上完整的固氮基因簇（nifBnifHnifDnifKnifEnifNnifXhesAnifV）克隆到穿梭質(zhì)粒pRADZ3中，獲得重組質(zhì)粒pRADZ3-78。采用熱擊轉(zhuǎn)化的方法將驗證后的pRADZ3-78質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109中，篩選獲得重組大腸桿菌Escherichia coliZ3，通過對E. coliZ3進行固氮酶活性測定，并采用化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法[11]使pRADZ3-78質(zhì)粒轉(zhuǎn)入耐輻射異常球菌R1中，驗證后獲得重組耐輻射異常球菌R78。試驗中所用PCR引物如表1所示。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 生長曲線測定 將活化后的D. radioduransR1、D. radioduransR78菌株接種至含有相應(yīng)抗生素的TGY液體培養(yǎng)基中，置于30 ℃、220 r·min-1過夜培養(yǎng)至穩(wěn)定期，按照初始OD600=0.1轉(zhuǎn)接菌株培養(yǎng)液于新鮮的培養(yǎng)基中，每種菌株設(shè)置3個平行重復(fù)。將菌液置于30℃、220 r·min-1繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3 h取樣并測定樣品的OD600，連續(xù)測定36 h。最后根據(jù)所得數(shù)據(jù)，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線圖。

1.2.3 固氮酶活性測定 采用乙炔還原法在厭氧管中測定固氮酶活性[12]。將待測菌株進行固氮條件的脅迫培養(yǎng)，并收集厭氧管中的氣體用氣相色譜法檢測并記錄乙烯峰面積。通過繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定并計算蛋白含量。同時，使用氣象色譜儀標(biāo)定1 nmol乙烯的量，根據(jù)以下公式計算固氮酶活性。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄水平表達測定 收集6種不同銨氧條件（0 mmol·L-1+0.0% O2、0 mmol·L-1+0.5%O2、0 mmol·L-1+1.0% O2、0 mmol·L-121.0% O2、100 mmol·L-1NH+4+0.5% O2、100 mmol·L-1+21.0% O2）下培養(yǎng)的D. radioduransR78的菌體，利用細菌RNA提取試劑盒提取菌體中的總RNA，并利用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒制備cDNA，通過qPCR分析D. radioduransR78中固氮基因在不同銨氧條件下的表達差異，進一步通過熒光染料法基于Naica Geode微滴生成擴增系統(tǒng)和Naica Prism3微滴閱讀分析系統(tǒng)以及Crystal Miner數(shù)據(jù)分析進行數(shù)字PCR。試驗所涉及的反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參考相應(yīng)試劑盒說明書。

1.2.5 翻譯水平表達測定 收集6種不同銨氧條件下培養(yǎng)的D. radioduransR78菌體，使用Western Blot的方法檢測NifH蛋白表達情況。將上述菌體使用超聲破碎儀器在20%功率下，工作3 s，間隔3 s進行超聲破碎提取菌株的總蛋白，將總蛋白離心后，分別收集蛋白上清液及沉淀，通過12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠對蛋白樣品進行分離，然后利用半干轉(zhuǎn)移的方法進行蛋白的分離與轉(zhuǎn)膜，經(jīng)過2次抗體孵育以及HRP-DAB(horseradish peroxidase-diaminobenzidine)顯色后，利用放射自顯影儀器拍攝PVDF膜。

1.2.6 轉(zhuǎn)錄組測定 在高氮、好氧（100 mmol·L-1+21.0% O2）和無氮、厭氧條件（0 mmol·L-1+0.0% O2）下，30 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)D.radioduransR78至對數(shù)初期，離心收集菌體并用液氮速凍。通過Illumina第二代高通量測序技術(shù)對轉(zhuǎn)錄組進行測序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組耐輻射異常球菌R78構(gòu)建及驗證

前期研究發(fā)現(xiàn)，將含有類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）WLY78固氮基因簇的質(zhì)粒pHY300PLK-78導(dǎo)入大腸桿菌JM109能使大腸桿菌在一定程度上表達固氮酶活性，為探究P. polymyxaWLY78的固氮基因簇能否在D. radioduransR1中有效表達，首先將該固氮基因簇通過酶切、連接反應(yīng)克隆到穿梭質(zhì)粒pRADZ3中，通過PCR擴增與測序驗證后獲得重組質(zhì)粒pRADZ3-78，并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109，獲得重組大腸桿菌E. coliZ3（圖1A）。通過乙炔還原法測定了E. coliZ3在0 mmol·L-1NH+4+和0.0%O2含量條件下的固氮酶活性，并以施氏假單胞菌（P. stutzeri）A1501作為對照。結(jié)果（圖2）顯示，固氮條件下的E. coliZ3和A1501乙炔還原能力隨時間的增加而增大，且在增加速率最快的時間段里（24～48 h）E. coliZ3固氮酶活性約為A1501的11%，表明pRADZ3-78固氮功能完整，可作為轉(zhuǎn)化耐輻射異常球菌R1的功能模塊。進一步通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法將pRADZ3-78導(dǎo)入耐輻射異常球菌R1中，PCR擴增驗證后獲得重組耐輻射異常球菌R78（圖1B）。

圖1 重組耐輻射異常球菌R78構(gòu)建及驗證Fig. 1 Construction and verification of recombinant D. radiodurans R78 strain

圖2 菌株的固氮酶活性Fig. 2 Nitrogenase activities of bacteria

2.2 重組耐輻射異常球菌R78表型測定

為探究固氮基因簇轉(zhuǎn)入耐輻射異常球菌R1是否會影響其正常生長，測定了正常培養(yǎng)條件下的野生型D. radioduransR1和重組菌株D. radioduransR78的生長曲線，結(jié)果（圖3）表明,固氮基因簇轉(zhuǎn)入耐輻射異常球菌R1對其各個時期的菌株生長情況影響較小。同時，為探究固氮條件（厭氧或微好氧）下D. radioduransR1和D. radioduransR78的生長情況，利用紫外分光光度計測定了2種菌株在不同氧含量下于TGY培養(yǎng)基中的OD600變化情況（初始OD600=0.1），結(jié)果（表2）顯示，氧氣含量的變化對野生型菌株D. radioduransR1和重組菌株D. radioduransR78的生長情況都有影響，但是在厭氧和微好氧條件下，野生型菌株R1和重組菌株R78都能微弱生長，這保證了固氮酶能夠在耐輻射異常球菌R1底盤中不失活，也表明后續(xù)的固氮活性測定以及固氮基因表達分析中能夠選擇厭氧和微好氧條件作為培養(yǎng)條件。

圖3 野生型D. radiodurans R1和重組菌株D. radiodurans R78在TGY培養(yǎng)基的生長曲線Fig. 3 Growth curves of the wild-type strain D. radiodurans R1 and recombinant strain D. radiodurans R78 in TGY medium

表2 不同氧含量下野生型D. radiodurans R1和重組菌株D. radiodurans R78在TGY培養(yǎng)基中的生長Table 2 Growth of wild-type D. radiodurans R1 and recombinant strain D. radiodurans R78 in TGY medium under different oxygen contents

為探究固氮基因簇轉(zhuǎn)入耐輻射異常球菌R1能否賦予其固氮活性，采用乙炔還原法測定重組菌株D. radioduransR78在6種不同銨氧條件下的固氮酶活性，結(jié)果（圖4）顯示，重組菌株D. radioduransR78在6種不同銨氧條件下均未表現(xiàn)出乙炔還原能力，表明該固氮基因簇不能在耐輻射異常球菌R1底盤中表達固氮酶活性，需要進一步分析D. radioduransR78中固氮基因的表達特性。

圖4 重組耐輻射異常球菌R78和野生型施氏假單胞菌A1501的固氮酶活Fig. 4 Nitrogenase activities of recombinant strain D. radiodurans R78 and wild type P. stutzeri A1501

2.3 固氮相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平表達分析

為探究D. radioduransR78中固氮基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達情況，利用瓊脂糖凝膠電泳的方法對6種不同銨氧條件下D. radioduransR78的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進行驗證，結(jié)果（圖5）顯示，不同處理中重組菌株D. radioduransR78中的9個固氮基因在mRNA水平都有表達產(chǎn)物，并且表達水平差異不明顯。為進一步探究固氮基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達差異，通過qPCR比較了不同銨氧條件下nifH基因的表達量，結(jié)果（圖6）顯示，不同銨氧條件下nifH基因的表達量都有微小的上調(diào)或者下調(diào)（0.57～1.10），其中無氮厭氧條件（0 mmol·L-1NH+4+0.0% O2）下nifH基因的表達量相對上調(diào)最大，此研究結(jié)果與已報道的將固氮基因簇轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109底盤所得到的結(jié)果一致[10]。同時，采用數(shù)字PCR分析不同銨氧條件下D. radioduransR78中固氮基因nifH的絕對表達量，并與施氏假單胞菌A1501在固氮條件下nifH的絕對表達量進行比較，結(jié)果（表3）顯示，與A1501在固氮條件（無氮微好氧）下相比，D. radioduransR78中nifH基因絕對表達量有2個數(shù)量級的降低，表明D. radioduransR78中固氮基因盡管可以在轉(zhuǎn)錄水平表達，但是表達水平較低，這可能是D. radioduransR78不能檢測到固氮酶活性的原因。

圖5 不同銨氧條件下耐輻射異常球菌R78中固氮相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平表達Fig. 5 Transcription level expression of nif genes in D. radiodurans R78 under different NH4+ and O2 conditions

圖6 耐輻射異常球菌R78中nifH基因在不同銨氧條件下的相對表達量Fig. 6 Relative expression of nifH of the D. radiodurans R78 in different NH+4 and O2 conditions

表3 數(shù)字PCR研究銨和氧對不同菌株固氮酶編碼基因nifH轉(zhuǎn)錄的影響Table 3 Effects of NH+4 and O2 on nifH gene transcription in different strains by dPCR

進一步利用轉(zhuǎn)錄組測序，分析固氮條件（無氮厭氧，0 mmol·L-1NH+4+0.0% O2）和非固氮條件下（高氮好氧100 mmol·L-1NH+4+21.0% O2）D. radioduransR78中基因表達量變化情況，結(jié)果顯示，相比于高氮好氧條件，無氮厭氧條件下顯著上調(diào)表達（P-adjust＜0.05且log2FC ≥1）的差異基因193個，顯著下調(diào)表達（P-adjust ＜ 0.05 且 log2FC≤-1）的差異基因有195個，其中，參與能量傳遞、氮代謝以及鐵硫轉(zhuǎn)運的相關(guān)基因的表達變化可能是影響重組菌株中固氮酶表達的限制因子（圖7）。

圖7 重組耐輻射異常球菌R78碳代謝途徑中的差異表達基因Fig. 7 Differentially expressed genes in carbohydrate metabolism of recombinant strain D. radiodurans R78

2.4 固氮基因的翻譯水平表達

為驗證重組耐輻射異常球菌R78中的固氮基因在蛋白水平上的表達情況，采用Western Blot的方法檢測了6種不同銨氧條件下D. radioduransR78中NifH蛋白的表達，并以無氮厭氧（0 mmol·L-1NH+4+0.0% O2）條件下30 ℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 h的野生型D. radioduransR1為陰性對照，以無氮微好氧（0 mmol·L-1NH+4+1.0% O2）條件下30 ℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 h的野生型A1501為陽性對照，結(jié)果如圖8所示，在不同銨氧條件下，重組耐輻射異常球菌R78中NifH蛋白的表達量特別低，甚至沒有表達。結(jié)合數(shù)字PCR結(jié)果，推測由于NifH極低水平的表達導(dǎo)致D. radioduransR78沒有固氮酶活性。

3 討論

生物固氮作為生態(tài)系統(tǒng)中有效氮的重要合成途徑，能夠提供大量可被利用的綠色氮源[13]。然而，天然固氮體系存在易受環(huán)境影響、具有較強的寄主特異性等限制，難以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，以不同微生物為底盤構(gòu)建人工高效聯(lián)合固氮體系，最終實現(xiàn)真核生物自主固氮成為了生物固氮領(lǐng)域的研究前沿，也是世界性的農(nóng)業(yè)科技難題[14]。固氮酶是一種對氧敏感的金屬酶，在固氮微生物的基因組中，固氮相關(guān)的nif基因以1個或多個基因簇存在，這些nif基因在固氮酶的生物合成中發(fā)揮重要作用[15-17]，此外，全基因組測序發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的固氮微生物都含有nifH、 nifD、 nifK、 nifE、 nifN以及nifB基因，這與在體外組裝固氮酶組分FeMo-co所需的最小nif基因數(shù)量一致[18]，這也為人工設(shè)計固氮裝置提供了理論基礎(chǔ)。

研究表明，將類芽孢桿菌WLY78的固氮基因簇轉(zhuǎn)移到與其同屬的大腸桿菌JM109中能夠使大腸桿菌成功表達固氮酶活性，并且重組大腸桿菌固氮基因的轉(zhuǎn)錄不受銨和氧調(diào)控[10]。而耐輻射異常球菌R1作為進化地位特殊的新底盤微生物，與類芽孢桿菌WLY78同為含有σ70因子的革蘭氏陽性菌株，因此，將類芽孢桿菌WLY78中的固氮基因簇轉(zhuǎn)移到耐輻射異常球菌R1中，不僅有利于固氮基因啟動子的選擇，也為探究將固氮基因簇轉(zhuǎn)移到遠緣微生物底盤甚至進一步轉(zhuǎn)移至真核微生物中提供了試驗依據(jù)。

本研究將類芽孢桿菌 WLY78中的固氮基因簇轉(zhuǎn)移到耐輻射異常球菌 R1中，獲得重組耐輻射異常球菌R78，并利用PCR和Western Blot等方法，發(fā)現(xiàn)外源固氮基因簇能夠在耐輻射異常球菌R78中正常轉(zhuǎn)錄，但不能完成固氮酶鐵蛋白的翻譯，從而不具有固氮酶活性。通過轉(zhuǎn)錄組測定及分析發(fā)現(xiàn)，相比于高氮好氧條件，無氮厭氧條件下重組耐輻射異常球菌R78中三羧酸循環(huán)途徑、磷酸戊糖途徑、氮代謝和鐵硫轉(zhuǎn)運系統(tǒng)相關(guān)基因下調(diào)顯著，其中編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的aceE和aceF基因均下調(diào)（分別為0.290和0.397倍），丙酮酸脫氫酶能夠催化丙酮酸生成乙酰-CoA，而乙酰-CoA能夠在NifV蛋白的催化下與α-酮戊二酸縮合形成R-高檸檬酸，R-高檸檬酸參與FeMo-co的合成過程，推測三羧酸循環(huán)途徑相關(guān)基因表達量較低造成重組耐輻射異常球菌R78中能量代謝效率降低，導(dǎo)致固氮酶合成受到影響不能發(fā)揮功能。研究結(jié)果為進一步的固氮模塊設(shè)計和底盤優(yōu)化，并最終構(gòu)建人工高效固氮裝置提供理論指導(dǎo)。