吳其妹　李影　李志榮　劉明容　馬繼敏　余念念　 陳榮祥　周亞平

摘 要：? 為研究牡荊葉指紋圖譜與抗氧化活性的譜-效關(guān)系，該研究首先建立了18批牡荊葉的高效液相色譜-電化學(xué)檢測法（HPLC-ECD）指紋圖譜，對(duì)不同來源牡荊葉藥材進(jìn)行聚類分析，鑒定主要酚類化合物且測定其含量，分析牡荊葉的總酚和總黃酮含量，并采用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法、氧自由基吸收能力法及鐵離子還原能力法考察其體外抗氧化活性，通過皮爾遜相關(guān)分析、灰度關(guān)聯(lián)分析及偏最小二乘回歸分析法研究牡荊葉的譜-效關(guān)系。結(jié)果表明：（1）牡荊葉的指紋圖譜標(biāo)定21個(gè)共有峰，共指認(rèn)出10個(gè)峰，其含量順序?yàn)榫G原酸>異葒草苷>木犀草苷>異牡荊素>異綠原酸A>異綠原酸C>原兒茶酸>葒草苷>異綠原酸B>新綠原酸；不同產(chǎn)地樣品間相似性較高，相似度結(jié)果為0.816～0.983。（2）系統(tǒng)聚類分析顯示，樣品含量對(duì)分類有一定影響，不同來源樣品被分為3類，其中南北方樣品存在一定差異。（3）牡荊葉中總酚和總黃酮的含量分別為15.82～61.83 mg·g-1和27.85～157.65 mg·g-1，樣品均具不同程度的抗氧化活性。（4）譜-效關(guān)系表明，牡荊葉的抗氧化活性是多種化合物協(xié)同作用的結(jié)果，峰9（異葒草苷）、峰4和峰5（綠原酸）等化合物對(duì)牡荊葉藥材抗氧化活性的貢獻(xiàn)最大。綜上表明，牡荊葉具有較好的抗氧化活性，其中主要的活性指標(biāo)是異葒草苷和綠原酸。該研究結(jié)果可為牡荊葉抗氧化活性成分的篩選及其質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 牡荊葉， HPLC， 電化學(xué)檢測， 抗氧化， 譜-效關(guān)系， 總酚， 總黃酮

中圖分類號(hào)：? Q946文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A文章編號(hào)：? 1000-3142（2023）06-1124-11

Spectrum-effect relationship of antioxidant activity in Vitex negundo var. cannabifolia leaves based on HPLC-ECD

WU Qimei1， LI Ying1， LI Zhirong2， LIU Mingrong1， MA Jimin2， YU Niannian2， CHEN Rongxiang2，3， ZHOU Yaping1*

（ 1. School of Pharmacy， Zunyi Medical University， Zunyi 563000， Guizhou， China; 2. School of Basics Medicine， Zunyi Medical University，

Zunyi 563000， Guizhou， China; 3. Zunyi Engineering Technology Research Center of Physical and Chemical Analysis， Zunyi 563000， Guizhou， China ）

Abstract：? In order to study the spectrum-effect relationship between fingerprint and antioxidant activity of the leaves of Vitex negundo var. cannabifolia， the fingerprints of 18 batches of V. negundo var. cannabifolia leaves were established by high performance liquid chromatography-electrochemical detection （HPLC-ECD）， and the cluster analysis of medicinal materials from different sources was performed simultaneously. The main phenolic compounds from V. negundo var. cannabifolia leaves were identified and determined. The contents of total phenolics and total flavonoids in V. negundo var. cannabifolia leaves were analyzed， and the antioxidant activities in vitro were evaluated by the methods of DPPH radical scavenging capacity， ABTS radical scavenging capacity， oxygen radical absorbance capacity and ferric ion reducing ability power. The spectrum-effect relationships of V. negundo var. cannabifolia leaves were analyzed by Pearson correlation analysis， gray relational analysis and partial least square regression analysis. The results were as follows： （1） The fingerprints of V. negundo var. cannabifolia leaves were established with 21 common peaks and a total of 10 peaks were identified. The order of content was? chlorogenic acid > isoorientin > luteoloside > isovitexin > isochlorogenic acid A > isochlorogenic acid C > protocatechuic acid > orientin > isochlorogenic acid B > neochlorogenic acid. The similarity among the samples from different producing areas was high， and the values were ranged from 0.816 to 0.983. （2） The results of the cluster analysis showed that the content of the compounds had a certain influence on the classification and the samples from different sources were divided into three categories， among which the samples from the south and the north were different. （3） The contents of total phenolics and total flavonoids in V. negundo var. cannabifolia leaves were 15.82 to 61.83 mg·g-1 and 27.85 to 157.65 mg·g-1， respectively， and the antioxidant activity of all samples from V. negundo var. cannabifolia leaves existed differences. （4） The spectrum-effect relationship indicated that the antioxidant activity of V. negundo var. cannabifolia leaves was the result of the synergistic effect of many compounds， and compounds such as peak 9 （isoorientin）， peak 4 and peak 5 （chlorogenic acid） made the greatest contribution to the antioxidant activity of V. negundo var. cannabifolia leaves. V. negundo var. cannabifolia has good antioxidant activity， and the main activity indexes are isoorientin and chlorogenic acid. This study can provide a reference basis for the screening and quality control of antioxidant components in V. negundo? var. cannabifolia.

Key words： Vitex negundo var. cannabifolia leaves， HPLC， electrochemical detection， antioxidation， spectrum-effect relationship， total phenolics， total flavonoids

牡荊（Vitex negundo var. cannabifolia）是馬鞭草科牡荊屬植物，分布于中國華東各省及廣西、廣東、河北、貴州、四川等地，其葉具有解表化濕、祛痰平喘等功效（《全國中草藥匯編》編寫組，1996；國家藥典委員會(huì)，2020）。牡荊主要成分為酚酸、黃酮、木脂素和萜類等化合物?，F(xiàn)代藥理研究表明，牡荊具有抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌、抗腫瘤等生物活性（舒柄垚等，2020）?？寡趸悄登G的主要生物活性之一，向蓉等（2021）研究表明牡荊水提取物和醇提取物均具有一定的抗氧化活性，其中酚酸和黃酮類物質(zhì)是其主要活性成分。Hu等（2015）研究上證實(shí)大部分酚酸類物質(zhì)具有較強(qiáng)的2， 2′-聯(lián)氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）自由基清除活性。然而，其抗氧化活性藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，并且未將指紋圖譜結(jié)合生物活性進(jìn)行質(zhì)量控制評(píng)價(jià)研究。

譜-效關(guān)系研究是將藥用植物的指紋圖譜與其藥效結(jié)果相結(jié)合起來，通過建立“譜-效”數(shù)學(xué)模型來反映中藥的內(nèi)在品質(zhì)，其廣泛應(yīng)用于藥用植物內(nèi)在質(zhì)量控制評(píng)價(jià)研究（王勤等，2017；晏朝操和張建峰，2020）。HPLC具有靈敏度高、分離度和重現(xiàn)性好、高效快速、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，目前已成為色譜指紋圖譜研究的首選方法，而電化學(xué)檢測法（electrochemical detection， ECD）通過測量物質(zhì)的電信號(hào)變化，可選擇性地檢測具有氧化還原性質(zhì)的化合物，如帶有硝基、巰基、酚羥基等基團(tuán)的有機(jī)化合物。因此，可用HPLC-ECD篩查藥用植物的抗氧化活性成分（羅敏等，2020; Zhang et al.， 2021）。目前，譜-效關(guān)系研究的分析方法眾多，其中灰度關(guān)聯(lián)分析法（gray relational analysis， GRA）能夠分析共有峰峰面積的變化與藥效指標(biāo)的變化趨勢(shì)，偏最小二乘回歸分析法（partial least square regression analysis， PLSR）對(duì)于系統(tǒng)的信息和噪聲更易于辨別，可以彌補(bǔ)灰度關(guān)聯(lián)分析法中關(guān)聯(lián)度均為正值所帶來的分析誤差（劉曉燕等，2020）。因此，常將GRA和PLSR相結(jié)合應(yīng)用于譜-效關(guān)系分析研究。

本研究收集18批不同來源的牡荊葉樣品，采用HPLC-ECD和體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方法，通過建立HPLC-ECD指紋圖譜且結(jié)合樣品含量測定、系統(tǒng)聚類分析（hierarchical cluster analysis， HCA）和譜-效關(guān)系分析，擬探討以下問題：（1）牡荊葉的化學(xué)成分及其含量；（2）牡荊葉不同化學(xué)成分對(duì)抗氧化活性的貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材與試劑 新鮮牡荊葉樣品采自廣西、廣東和河北，按照2020年《中國藥典》中牡荊葉的鑒定要求，經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)孟令杰博士鑒定為馬鞭草科牡荊屬牡荊（Vitex negundo var. cannabifolia）的葉，其詳細(xì)信息見表1。新鮮牡荊葉于40 ℃下烘干后，分別粉碎并過50目篩，放置在4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

原兒茶酸、綠原酸、木犀草苷、沒食子酸、奎諾二甲基丙烯酸酯（Trolox）（阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)分別為K1717091、J1523050、10122401、L1810248、A2010059，純度≥97%）；葒草苷、異葒草苷、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為20031202、20052201、19042305、20032601、20032602、20080802，純度≥98%）；異牡荊素 （上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)為ST09650120，純度≥ 98%）；蘆?。▏幖瘓F(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為2016092，純度≥95%）；甲醇、乙腈均為色譜級(jí)，均購自北京伊諾凱科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.1.2 儀器 Thermo UltiMate 3000 bio-RS型HPLC儀，檢測器為ECD-3000 RS；Sorvall ST 8R型高速離心機(jī)（美國賽默飛世爾科技有限公司）；SpectraMax i3x型多功能酶標(biāo)儀［美谷分子儀器（上海）有限公司］；ME104E型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；Purelab Chorus 2型純水超純水系統(tǒng)（英國埃爾格公司）；GZX-9070MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取原兒茶酸、新綠原酸、綠原酸、葒草苷、異葒草苷、異牡荊素、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C適量，用甲醇溶解制成2 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，于-20 ℃下冷凍保存以備用。

1.2.2 供試品溶液的制備 分別精密稱取不同批號(hào)的牡荊葉樣品，以80%甲醇為溶劑，按1∶30 （g·mL-1）的料液比在25 ℃下超聲提取30 min，于9 000 r·min-1條件下離心5 min，取上清液加80%甲醇按1∶1等體積稀釋混勻，過0.22 μm有機(jī)濾膜即制得供試品溶液。

1.2.3 色譜條件 XBridge BEH Shield RP18色譜柱（3.0 mm × 150 mm， 2.5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-甲酸銨檸檬酸混合溶液（B）（25 mmol·L-1甲酸銨溶液和25 mmol·L-1檸檬酸溶液以1∶1等體積混勻，用甲酸調(diào)pH至2.6）梯度洗脫（0 ～ 9.5 min， 5% → 7.5% A; 9.5 ～ 12.5 min， 7.5% → 12% A; 12.5 ～ 30 min，保持12% A; 30 ～ 40 min， 12% → 19% A; 40 ～ 48 min，保持19% A; 48 ～ 53 min， 19%→ 45% A; 53～55 min， 45%→80% A）；ECD檢測電壓700 mV；流速0.6 mL·min-1；柱溫45 ℃，樣溫12 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

1.2.4 總酚、總黃酮含量測定及體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 總酚含量測定 參照DDzugan等（2018）的方法并稍作修改，先吸取250 μL供試品稀釋液（加80%甲醇稀釋40倍）和250 μL 0.25 mol·L-1 Folin酚試劑混合靜置3 min后，加入500 μL 15% Na2CO3溶液混勻后暗反應(yīng)30 min，離心取上清液于酶標(biāo)儀760 nm處測定吸光度。以沒食子酸溶液為標(biāo)準(zhǔn)，所有樣品測量結(jié)果均以沒食子酸當(dāng)量（mg·g-1）表示。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品與吸光度值的回歸方程為y=0.014 2x+0.062 5， R2= 0.998 8。

1.2.4.2 總黃酮含量測定 參照He等（2015）的方法并稍作修改，先吸取500 μL供試品稀釋液（加80%甲醇稀釋5倍）、1 000 μL 80%甲醇、250 μL 5% NaNO2 溶液，混勻放置6 min后，再加入250 μL 10% Al（NO3）3溶液，混勻放置6 min后，又加入2 000 μL 4% NaOH溶液，混勻放置15 min后，于酶標(biāo)儀510 nm處測定吸光度。以蘆丁溶液為標(biāo)準(zhǔn)，所有樣品測量結(jié)果均以蘆丁當(dāng)量（mg·g-1）表示。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品與吸光度值的回歸方程為y=0.000 9x + 0.046 0， R2=0.999 2。

1.2.4.3 鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power， FRAP）測定 參照王金梅等（2017）的方法并稍作修改，分別吸取供試品稀釋液（加入80%的甲醇稀釋60倍），加入80%的甲醇至100 μL后，加入300 μL TPTZ工作液混勻反應(yīng)，5 min后于酶標(biāo)儀593 nm處測定吸光度。以Trolox溶液為標(biāo)準(zhǔn)，所有樣品測量結(jié)果均以Trolox當(dāng)量（mg·g-1）表示。Trolox標(biāo)準(zhǔn)品與吸光度值的回歸方程為y=0.019 2x + 0.022 2， R2=0.996 9。

1.2.4.4 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn) 參照Zhang等（2015）的方法并稍作修改，分別吸取80 μL的供試品稀釋液（加入80%的甲醇稀釋20倍），加入80%的甲醇至200 μL后，再加入DPPH自由基母液［DPPH∶80%甲醇=1∶10 （mg·mL-1）］400 μL，搖勻，暗反應(yīng)10 min后，于酶標(biāo)儀517 nm處測定吸光度。以80%甲醇為空白組，不同濃度的Trolox溶液為對(duì)照組。所有樣品測量結(jié)果均以清除率表示，清除率計(jì)算公式：

DPPH清除率=（A空白組-A樣品組）/A空白組×100%（1）

1.2.4.5 ABTS 自由基清除實(shí)驗(yàn) 參照Aati等（2018）的方法并稍作修改，分別吸取100 μL的供試品稀釋液（加入80%的甲醇稀釋30倍），加入200 μL的ABTS工作液，混勻暗反應(yīng)20 min后，于酶標(biāo)儀734 nm處測定吸光度。以80%甲醇為空白組，不同濃度的Trolox溶液為對(duì)照組。所有樣品測量結(jié)果均以清除率表示，清除率計(jì)算公式：

ABTS清除率=（A空白組-A樣品組）/A空白組×100%（2）

1.2.4.6 氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity， ORAC）測定 在供試品溶液中加入磷酸鹽緩沖溶液稀釋500倍得到供試品稀釋液，實(shí)驗(yàn)步驟參照徐維盛等（2014）的方法，每隔5 min測定一次熒光強(qiáng)度，總時(shí)間為3 h。以磷酸鹽緩沖溶液為空白組，不同濃度的Trolox溶液為對(duì)照組。所有樣品測量結(jié)果均以Trolox（mg·g-1）表示，具體計(jì)算公式表示為式（3）和式（4）：

AUC=0.5 ×? ［ 2 × （f0 + f1 + … + fn-1 + fn） - f0 - fn ］ × △t（3）

式中：AUC為熒光衰退曲線下面積；fn為第n個(gè)測定點(diǎn)的相對(duì)熒光強(qiáng)度；△t為測定熒光強(qiáng)度的時(shí)間間隔。

ORAC值=［（AUC樣品組-AUC空白組）/（AUCTrolox-AUC空白組）］ × CTrolox/C樣品組）（4）

Trolox標(biāo)準(zhǔn)品與凈熒光衰退曲線下面積（AUCTrolox-AUC空白組）的回歸方程為y=1.368 0x + 8.301 9， R2=0.994 6。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析 采用Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和灰度關(guān)聯(lián)分析；采用SPSS 26軟件進(jìn)行皮爾遜相關(guān)分析和系統(tǒng)聚類分析；采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行PLSR分析。色譜圖和PLSR結(jié)果通過Origin 2021軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.1.1 精密度試驗(yàn) 取牡荊葉（批號(hào)為S2），按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，于“1.2.3”項(xiàng)的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，21個(gè)共有峰保留時(shí)間的RSD≤0.45%，峰面積的RSD≤1.31%，這說明試驗(yàn)方法符合分析檢測要求。

2.1.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取牡荊葉（批號(hào)為S2），按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備成6份供試品溶液，于“1.2.3”項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)樣分析，21個(gè)共有峰保留時(shí)間的RSD≤1.72%，峰面積的RSD≤4.81%，結(jié)果表明試驗(yàn)建立的方法重復(fù)性較好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取牡荊葉（批號(hào)為S2）按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，在“1.2.3”項(xiàng)的色譜條件下分別于0、4、8、12、16、18、24 h進(jìn)樣分析，21個(gè)共有峰保留時(shí)間的RSD≤0.58%，峰面積的RSD≤3.94%，結(jié)果表明24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2 HPLC-ECD指紋圖譜的建立及共有峰指認(rèn)

分別取18批牡荊葉，按照“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，同“1.2.3”條件測定并記錄色譜圖和總峰面積，將色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，以S8為參照?qǐng)D譜，生成牡荊葉HPLC-ECD指紋圖譜（圖1）、混合標(biāo)準(zhǔn)品圖（A）和對(duì)照指紋圖譜（B）（圖2）。通過多點(diǎn)校正和Mark峰匹配得到21個(gè)共有峰，其中峰1、2、5、8、9、11、12、14、15、17分別為原兒茶酸、新綠原酸、綠原酸、葒草苷、異葒草苷、異牡荊素、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C。計(jì)算其與對(duì)照指紋圖譜的相似度，相似度結(jié)果為0.816～0.983，樣品S1-S18的相似度分別為0.843、0.983、0.967、0.959、0.953、0.916、0.969、0.966、0.968、0.980、0.978、0.953、0.974、0.947、0.964、0.847、0.816、0.950。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限

分別取“1.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液制備成系列質(zhì)量混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在“1.2.3”條件下，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以信噪比為3∶1計(jì)算分析方法的檢測限（LOD）。結(jié)果顯示各化合物在一定的質(zhì)量濃度范圍下，峰面積有良好的線性相關(guān)性（表2），相關(guān)系數(shù)大于0.999，LOD為2.2～30.4 ng·mL-1。

2.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

稱取已知含量的牡荊葉樣品，平行精密稱定6份，加入一定量的對(duì)照品混合儲(chǔ)備溶液，于“1.2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析。表2結(jié)果顯示，10種化合物的回收率為90.13%～99.56%，RSD≤6.41%，該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.5 含量測定

按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于“1.2.3”項(xiàng)的色譜條件下，測定不同產(chǎn)地牡荊葉的10個(gè)化合物含量，結(jié)果見表3。由表3可知，牡荊葉含有豐富的酚酸和黃酮類化合物，不同批次和產(chǎn)地的各成分含量存在較大差異。以各批次含量的平均值計(jì)算，含量最高的化合物為綠原酸，其次分別為異葒草苷、木犀草苷、異牡荊素、異綠原酸A、異綠原酸C、原兒茶酸、葒草苷、異綠原酸B、新綠原酸。

2.6 聚類分析

為了研究產(chǎn)地與含量之間的關(guān)系，以21個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積為變量，采用HCA分析方法，通過SPSS 26軟件采用平方歐式距離為測量度對(duì)18批牡荊葉樣品進(jìn)行聚類分析（圖3）。圖3結(jié)果表明，當(dāng)歐式距離為4左右時(shí)，藥材可分為3類，即測定的10個(gè)化合物總含量分別為13.06～31.69、38.01～41.03、78.99 mg·g-1。河北產(chǎn)地藥材為13.06～31.69 mg·g-1，而廣東和廣西的在分類中存在交叉情況。

2.7 總峰面積、總酚含量、總黃酮含量及體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

18批牡荊葉HPLC-ECD總峰面積、總酚、總黃酮含量及體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，不同批次牡荊葉的總酚、總黃酮類化合物存在較大差異，其含量分別為15.82～61.83 mg·g-1和27.85～157.65 mg·g-1。牡荊葉具有一定的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、氧自由基吸收能力及鐵離子還原能力，說明牡荊葉80%甲醇提取物具有一定抗氧化活性。

2.8 譜-效關(guān)系分析

2.8.1 皮爾遜相關(guān)分析 對(duì)牡荊葉HPLC-ECD樣品的總峰面積、總酚含量、 總黃酮含量分別與體外抗氧化活性進(jìn)行皮爾遜相關(guān)分析比較，結(jié)果見表5。

由表5可知，牡荊葉中總酚、總黃酮含量分別與DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、ORAC氧自由基吸收能力及鐵離子還原能力均呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)大于0.77。ECD檢測器可選擇性地檢測具有氧化還原性質(zhì)的化合物，同時(shí)，分析結(jié)果表明HPLC-ECD樣品中總峰面積與總酚、總黃酮的含量和體外抗氧化活性均呈顯著正相關(guān)。

2.8.2 灰度關(guān)聯(lián)分析 采用均值化法對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行無量化處理。以不同批次牡荊葉的抗氧化結(jié)果作為母序列，以共有峰峰面積作為子序列，分辨系數(shù)ρ取0.5，按照文獻(xiàn)（帖曉燕等，2021; Du et al.， 2021）的方法計(jì)算共有峰與藥效之間灰度關(guān)聯(lián)度系數(shù)（r）的大小，結(jié)果見表6。

由表6可知，牡荊葉中的共有峰與各抗氧化活性的關(guān)聯(lián)度很高，關(guān)聯(lián)度均大于0.79，表明牡荊葉的抗氧化活性是多種化合物的協(xié)同作用結(jié)果。以4種抗氧化活性關(guān)聯(lián)度的平均值計(jì)算，關(guān)聯(lián)度最高的10個(gè)峰依次為峰9（異葒草苷）>峰4>峰2（新綠原酸）>峰5（綠原酸）>峰6>峰11（異牡荊素）>峰20>峰12（木犀草苷）>峰15（異綠原酸A）>峰14（異綠原酸B）。

2.8.3 PLSR分析 PLSR分析是以典型相關(guān)分析、主成分分析和多元線性回歸分析方法為基礎(chǔ)的多元統(tǒng)計(jì)方法， 能反映共有峰對(duì)藥效指標(biāo)的綜合貢獻(xiàn)程度，相關(guān)系數(shù)大于0，表明二者之間呈正相關(guān)，反之為負(fù)相關(guān)；在重要投影（VIP）模型中，VIP值>1，表明該成分對(duì)模型有顯著影響（劉曉燕等，2020）。本研究以不同批次的牡荊葉HPLC-ECD指紋圖譜中各共有峰的峰面積為自變量（X），以不同批次牡荊葉的抗氧化結(jié)果為因變量（Y），采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行PLSR分析，計(jì)算X對(duì)應(yīng)Y的回歸系數(shù)和VIP值，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，峰1（原兒茶酸）和峰16與抗氧化效果呈負(fù)相關(guān)，其余共有峰在PLSR模型中與各抗氧化活性的回歸系數(shù)均呈正相關(guān)。共有峰與抗氧活性呈正相關(guān)且VIP值大于1的峰有3、4、5（綠原酸）、6、8（葒草苷）、9（異葒草苷）、19、20。

3 討論與結(jié)論

本研究建立了18批牡荊葉藥材的HPLC-ECD指紋圖譜，提取出21個(gè)共有峰，相似度在0.816以上，說明不同來源的牡荊葉樣品質(zhì)量較為相近。通過參考文獻(xiàn)（羅婭君等，2011; Huang et al.， 2015）等資料，借助超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀定性和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，共指認(rèn)出10個(gè)峰，并對(duì)其進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明牡荊葉主要成分為綠原酸、異葒草苷、木犀草苷和異牡荊素等。通過HCAFRAP表示鐵離子還原能力； DPPH表示1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力； ABTS表示2， 2′-聯(lián)氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）自由基清除能力； ORAC表示氧自由基吸收能力。

分析可知，牡荊葉藥材可能受到采收季節(jié)、氣候和新老葉等的影響，樣品分類存在產(chǎn)地交叉情況，而我們所測定化合物的含量差異可能對(duì)樣品分類起著相對(duì)重要的作用。

對(duì)牡荊葉進(jìn)行體外抗氧化實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行皮爾遜相關(guān)分析比較，結(jié)果表明牡荊葉具有較強(qiáng)的抗氧化活性，樣品中的總峰面積、總酚、總黃酮和體外抗氧化活性相互之間均呈顯著相關(guān)性，這與前人的研究結(jié)果（Hu et al.， 2015; Wang et al.， 2022）相符，說明總酚、總黃酮可能是牡荊葉抗氧化活性的主要化合物，HPLC-ECD能夠檢測牡荊葉中的抗氧化活性物質(zhì)。借助GRA和PLSR分析方法對(duì)牡荊葉的共有峰與抗氧化活性進(jìn)行譜-效關(guān)系研究。GRA分析結(jié)果表明牡荊葉的抗氧化活性是多種成分協(xié)同作用產(chǎn)生的，同時(shí)，結(jié)合PLSR分析，對(duì)牡荊葉抗氧化活性貢獻(xiàn)最大的為峰9（異葒草苷），其次為峰4和峰5（綠原酸）。綠原酸已被報(bào)道可能是區(qū)分牡荊不同藥用部位的潛在化學(xué)標(biāo)志物，能作為牡荊質(zhì)量控制的定量指標(biāo)之一（Hu et al.， 2015），其具有多種功能的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗菌等（王文龍等，2017）。同時(shí)，Deepha等（2014）研究表明異葒草苷因含有3′-OH的B環(huán)、分子內(nèi)氫鍵、O-H等結(jié)構(gòu)，在藥物植物中表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化活性（Deepha et al.， 2015）。因此，現(xiàn)有研究可反向說明該譜-效關(guān)系結(jié)果的準(zhǔn)確性。

綜上所述，本研究首次基于HPLC-ECD建立牡荊葉藥材的指紋圖譜，本方法篩選得到的抗氧化活性化合物主要為綠原酸類化合物和黃酮類化合物，化合物含量差異對(duì)樣品分類有一定的影響，其中異葒草苷和綠原酸對(duì)牡荊葉藥材抗氧化作用有重要貢獻(xiàn)。本方法可為牡荊葉藥材關(guān)鍵成分的質(zhì)量控制及質(zhì)量標(biāo)志物篩選提供參考，對(duì)牡荊葉藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的完善具有重要意義。

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（責(zé)任編輯 鄧斯麗 蔣巧媛）

收稿日期：? 2022-07-29

基金項(xiàng)目：? 國家自然科學(xué)基金（21665031， 81760652）。

第一作者： 吳其妹（1995-），碩士研究生，研究方向?yàn)樗幱弥参镩_發(fā)與利用，（E-mail）510578364@qq.com。

*通信作者：? 周亞平，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樗幬锓治?，（E-mail）yaping20302@163.com。