杜曉琴，馬瑛，謝剛，陳麗娟，潘長清，張勇

作者單位：電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬綿陽醫(yī)院·綿陽市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 綿陽 621000

宮頸癌是臨床上一種常見的惡性腫瘤，流行病學(xué)研究提示［1］，近幾年宮頸癌的發(fā)病年齡呈現(xiàn)顯著的下降趨勢，呈現(xiàn)顯著的低齡化趨勢，對于女性的生命安全以及生命質(zhì)量造成嚴(yán)重的威脅［2］。目前已經(jīng)證實［3］，機(jī)會性感染高危型人乳頭狀瘤病毒是造成宮頸癌的重要危險因素，隨著病毒對病灶部位的不斷侵染，病灶部位的病變逐步由癌前病變向腫瘤進(jìn)行發(fā)展，所以早期對宮頸癌的癌前病變進(jìn)行診斷，對于病人的預(yù)后具有積極的意義［4］。B 淋巴細(xì)胞瘤-2 關(guān)聯(lián)永生基因3（BAG3）BAG 基因是腫瘤細(xì)胞凋亡的抑制性因素，該系列的基因?qū)τ诙喙δ艿慕Y(jié)合蛋白的分泌功能的顯著調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步對腫瘤細(xì)胞的增殖周期進(jìn)行調(diào)控［5］。多重腫瘤抑制基因1（P16）蛋白通過對腫瘤細(xì)胞周期蛋白D1 的特異性結(jié)合，進(jìn)一步對腫瘤細(xì)胞的顯著抑制［6］，阻礙腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展。本研究主要通過BAG3蛋白、P16在宮頸癌癌前病變病人中表達(dá)及聯(lián)合液基細(xì)胞學(xué)檢查的臨床意義分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇綿陽市中心醫(yī)院2015 年6 月至2017 年6 月在婦科門診篩查并經(jīng)陰道鏡宮頸活檢確診的120 例宮頸病變病人為研究對象，病人年齡（37.56±2.69）歲，根據(jù)其病變情況分為癌前病變組和宮頸癌組。其中，癌前病變組69 例，年齡（37.36±2.63）歲，身體質(zhì)量指數(shù)（24.34±2.03）kg/m2，宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級（CINⅠ）15 例， CINⅡ 20 例、CINⅢ 34 例；宮頸癌組51 例，年齡（37.76±3.27）歲，體質(zhì)量指數(shù)（24.76±2.24）kg/m2，宮頸癌的國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟FIGO 分期：Ⅰ~Ⅱ期23 例，Ⅲ~Ⅳ期28 例，病理類型：鱗癌34 例，腺癌17 例。兩組年齡、身體質(zhì)量指數(shù)等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有臨床可比性。

病人或其近親屬對研究方案簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

宮頸癌病人的納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合宮頸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］；②不存在其他原發(fā)性腫瘤；③病人的卡式評分均在60 分以上［8］。排除標(biāo)準(zhǔn)：①精神異常；②無法正常溝通；③哺乳期或妊娠期；④其他生殖系統(tǒng)疾病。癌前病變病人納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)人乳頭瘤病毒檢查確診為宮頸癌前病變；②出現(xiàn)白帶異常、宮頸糜爛等表現(xiàn)；③性生活后有出血。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集所有檢測指標(biāo)均定期進(jìn)行室間質(zhì)控以及室內(nèi)質(zhì)控，保證檢測指標(biāo)的穩(wěn)定性以及準(zhǔn)確性。使用棉簽于病人的宮頸口部位進(jìn)行逆時針刮取采樣，采樣取3 次，停留時間為10 s，將樣本置于細(xì)胞保存液的收集瓶中進(jìn)行保存。

1.2.2 樣本處理宮頸組織細(xì)胞樣本經(jīng)液基細(xì)胞學(xué)檢測 采用液基薄層細(xì)胞自動制片機(jī)（新順國際有限公司，Autocyteprep）對以上樣本進(jìn)行檢測。將以上樣本進(jìn)行3 500 r/min 離心15 min 后，使用樣本吸取機(jī)對樣本進(jìn)行混懸，隨后使用比重液對病人的以上混懸液繼續(xù)離心，使用樣本吸取機(jī)對富集于試管底部的細(xì)胞進(jìn)行收集，并在振蕩器的作用下，重新使細(xì)胞處于混懸狀態(tài)。將以上液體置于液基薄層細(xì)胞自動制片機(jī)中，在液基薄層細(xì)胞自動制片機(jī)進(jìn)行巴氏染色，染色結(jié)束后，對以上玻片進(jìn)行二甲苯處理后，保證玻片的濕潤狀態(tài)，使用中性樹膠進(jìn)行封固。

1.2.3 BAG3 蛋白、P16 水平檢測將以上樣本進(jìn)行研磨后，采用二甲苯漂洗15 min，采用95%的乙醇進(jìn)行漂洗2 次，漂洗時間設(shè)定為3 min，使用80%的乙醇溶液進(jìn)行漂洗3 min，蒸餾水漂洗3 min，使用蘇木精染色5 min，使用流水洗去染色，1%的鹽酸乙醇洗滌3 s，蒸餾水洗3 s，使用80%的乙醇溶液進(jìn)行漂洗3 s，使用95%的乙醇溶液進(jìn)行漂洗3 s，使用100%的乙醇溶液進(jìn)行漂洗3 s，中性樹膠進(jìn)行封片。將上述膠片使用過氧化物酶阻斷溶液進(jìn)行浸泡50μL，室溫下孵育時間為10 min，使用磷酸緩沖鹽溶液進(jìn)行沖洗3 次，每次沖洗時間設(shè)定為3 min，去掉磷酸緩沖鹽溶液后，再次對膠片進(jìn)行正常非免疫動物血清進(jìn)行室溫孵育，孵育時間設(shè)定為10 min，再次去除血清后，使用BAG3、P16血清單抗進(jìn)行檢測，在400 倍顯微鏡下對病人的膠片進(jìn)行觀察，在觀察過程中，取5 個視野，在每個視野對計數(shù)100 個腫瘤細(xì)胞，根據(jù)染色深度進(jìn)行評價，沒有染色為0 分，染色為淡黃色則為1 分，染色為棕黃色則為2 分，染色為黃褐色則為3分，陽性細(xì)胞的比例：病人的陽性細(xì)胞的比例在5%以下則為0分，陽性細(xì)胞的比例在5%~25%則為1 分，陽性細(xì)胞的比例在26%~50%則為2分，陽性細(xì)胞的比例在51%~75%則為3 分，陽性細(xì)胞的比例在76%~100%則為4 分，以染色情況以及陽性細(xì)胞的比例的乘積作為病人的BAG3、P16的表達(dá)量［9］。所有檢測指標(biāo)均定期進(jìn)行室間質(zhì)控以及室內(nèi)質(zhì)控，保證檢測指標(biāo)的穩(wěn)定性以及準(zhǔn)確性。

1.3 觀察指標(biāo)觀察癌前病變組以及宮頸癌組BAG3、P16 水平。觀察不同嚴(yán)重程度宮頸病變病人的BAG3、P16水平。CINⅠ為輕度非典型增生，細(xì)胞異型性低，排列不整齊，但仍保持極性，異常增生的宮頸細(xì)胞僅限于上皮層的下1/3；CINⅡ為中度非典型增生，細(xì)胞異型性較為明顯，排列紊亂，異常增生的宮頸細(xì)胞占上皮層的下2/3；CINⅢ為重度非典型增生，細(xì)胞異型性明顯，極性消失，異常增生的宮頸細(xì)胞占上皮層的下2/3以上。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 進(jìn)行，正態(tài)分布的計量資料以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗比較，三組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，BAG3、P16 水平與液基細(xì)胞學(xué)檢查的聯(lián)合檢測對宮頸癌癌前病變的診斷效能進(jìn)行分析，分別計算靈敏度、特異度、符合率、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值，宮頸癌癌前病變診斷效能評價采用受試者操作特征曲線（ROC 曲線），曲線下面積（AUC）比較采用Z檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組BAG3、P16 水平比較宮頸癌組BAG3、P16 水平顯著高于癌前病變組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 宮頸病變120例B淋巴細(xì)胞瘤-2關(guān)聯(lián)永生基因3（BAG3）蛋白、多重腫瘤抑制基因1（P16）水平比較/

表1 宮頸病變120例B淋巴細(xì)胞瘤-2關(guān)聯(lián)永生基因3（BAG3）蛋白、多重腫瘤抑制基因1（P16）水平比較/

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2.2 不同嚴(yán)重程度宮頸癌癌前病變病人的BAG3、P16水平比較不同嚴(yán)重程度宮頸癌癌前病變病人的BAG3、P16 水平之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，經(jīng)兩兩比較，病人的BAG3、P16 水平從低到高為CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組。見表2。

表2 不同程度宮頸癌癌前病變B淋巴細(xì)胞瘤-2關(guān)聯(lián)永生基因3（BAG3）蛋白、多重腫瘤抑制基因1（P16）比較/

表2 不同程度宮頸癌癌前病變B淋巴細(xì)胞瘤-2關(guān)聯(lián)永生基因3（BAG3）蛋白、多重腫瘤抑制基因1（P16）比較/

注：①與CINⅠ組比較，P<0.05。②與CINⅡ組比較，P<0.05。

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2.3 聯(lián)合檢測效能分析聯(lián)合診斷對于宮頸癌癌前病變的診斷特異度、準(zhǔn)確率、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值均顯著高于單獨(dú)檢測（P<0.05）。見表3。

表3 聯(lián)合檢測效能分析

2.4 ROC 曲線分析通過ROC 曲線分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測對于宮頸癌癌前病變的診斷ROC 曲線下面積顯著高于單獨(dú)檢測，聯(lián)合診斷與 BAG3 比較，Z=4.13，P<0.001；聯(lián)合診斷與 P16 比較，Z=3.76，P=0.008；聯(lián)合診斷與液基比較，Z=3.03，P=0.022。見表4。

表4 聯(lián)合檢測對于宮頸癌癌前病變的診斷ROC曲線分析

3 討論

宮頸癌是臨床較為常見的女性惡性腫瘤之一，流行病學(xué)調(diào)查顯示［10］，我國每年的新發(fā)宮頸癌的病例在13 萬以上，其中死亡病例在3 萬以上，其發(fā)病率以及死亡率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，同時從年齡的構(gòu)成上比較，宮頸癌病人的年齡呈現(xiàn)顯著的年輕化趨勢。在宮頸癌疾病的進(jìn)展中，疾病的進(jìn)展較為緩慢，具有明顯的癌前病變特征［11］，所以在臨床診斷中，通過對病人的特異性診斷，顯著提升宮頸癌以及宮頸癌前病變的診斷準(zhǔn)確性，對于臨床早期開展干預(yù)具有積極的意義。而在常規(guī)的診斷中，通常采取液基細(xì)胞學(xué)檢查，但是已有報道［12］指出，其對宮頸癌的癌前病變的診斷具有一定的局限性，所以在臨床診斷中，通過多種靈敏度較高的指標(biāo)診斷，對于提升對癌前病變的診斷具有積極的意義［13］。P16蛋白由腫瘤抑制基因CDKN2A 在9 號染色體編碼，作用是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，P16INK4a的過度表達(dá)可作為一個致癌型HPV 病毒破壞細(xì)胞周期的替代標(biāo)志物，所以在機(jī)體的病變組織的分析中，隨著機(jī)體的P16蛋白被特異性受體的結(jié)合，病人的P16 呈現(xiàn)下降的趨勢［14］。隨著機(jī)體P16 水平的下降，機(jī)體的腫瘤細(xì)胞增殖周期顯著激活，對于腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步浸染具有重要作用［15］。以往的研究已經(jīng)證實，雖然P16INK4a 彌漫的染色主要與CINⅡ（75.5%~100%）和CINⅢ（100%）有關(guān)，然而值得注意的是，大約50%以上的CINⅠ也有強(qiáng)的P16INK4a表達(dá)［12］。但是單獨(dú)通過對病人的P16表達(dá)水平的檢測，并不能對病人的疾病進(jìn)展進(jìn)行診斷，需要與多種指標(biāo)的聯(lián)合診斷，以期提高對宮頸癌的診斷效能。劉峰等［13］通過對宮頸癌病人的P16 水平的分析，病人的P16 水平顯著上升，與本研究結(jié)果一致。BAG3 蛋白廣泛存在于腫瘤細(xì)胞中，在腫瘤進(jìn)展中起著重要作用，研究［14-17］表明，宮頸癌病人的疾病進(jìn)展以及疾病的復(fù)發(fā)與機(jī)體的BAG3 蛋白呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性，在長期的隨訪分析中，較高BAG3 蛋白表達(dá)水平是病人的良好預(yù)后的重要指標(biāo)。

另外，通過對聯(lián)合檢測效能的分析，聯(lián)合診斷對于宮頸癌的診斷效能顯著高于單獨(dú)檢測，提示，通過對腫瘤細(xì)胞增殖周期的預(yù)測，聯(lián)合對腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)的研究，可顯著提升宮頸癌癌前病變的診斷效能。但本研究還存在一定的局限性，由于納入樣本量較低，有待在日后研究中進(jìn)行大樣本研究。

綜上所述，隨著宮頸癌前病變的進(jìn)展，P16、BAG3表達(dá)增加，BAG3蛋白、P16聯(lián)合液基細(xì)胞學(xué)檢查對于病人的診斷具有積極的意義。