胡小騫，王琴

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)院感染管理辦公室，安徽 合肥 230601

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）約占醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房（intensive care unit， ICU）革蘭陰性桿菌感染的15%［1］，是人體內(nèi)呼吸道和腸道的常見定植菌，易引起免疫力低下病人呼吸道、血液、消化道等部位的感染。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）最初于1996 年在美國的北卡羅來州被Yigit 等［2］發(fā)現(xiàn)，隨后傳播至全球各大洲國家。由于碳青霉烯類抗生素的抗菌活性強(qiáng)、抗菌譜廣，近年來臨床治療重癥感染病人時(shí)廣泛應(yīng)用碳青霉烯類藥物，致使CRKP逐年增加，而治療CRKP的抗菌藥物的選擇有限，感染病人的死亡率較高［3］，國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道為29.53%～76.19%［4］，國外文獻(xiàn)報(bào)道為42.14%［5］，給臨床抗感染工作帶來了艱巨的挑戰(zhàn)。近年，我國CRKP 的耐藥形勢(shì)逐漸嚴(yán)峻，全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)（China antimicrobial resistance surveillance system，CARSS）“2013—2017 年的全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)報(bào)告”分析顯示，5年期間CRKP檢出率與其他常見耐藥菌的檢出率相比仍處于持續(xù)上升的狀態(tài)。CHINET（China antimicrobial surveillance network）統(tǒng)計(jì)2005—2019年15年的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示KP對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率呈持續(xù)上升趨勢(shì)（3.0%、2.9%對(duì)25.3%、26.8%）［6］。本研究對(duì)某三甲醫(yī)院ICU 的19株CRKP 進(jìn)行全基因組測(cè)序（whole genome sequenc?ing， WGS），通過分析其耐藥基因型、多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）、核心基因組多位點(diǎn)序列分型（core genome multilocus sequence typing，cgMLST）、莢膜型，以及構(gòu)建最小生成樹（minimum spanning tree，MST）、最大似然樹（maxi?mum likelihood tree，MLT），研究該院ICU內(nèi)CRKP菌株的分子生物流行病學(xué)特點(diǎn)，旨在指導(dǎo)臨床合理使用抗生素，為醫(yī)院感染防控措施的落實(shí)提供參考依據(jù)，遏制多重耐藥菌在院內(nèi)的播散。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及藥敏鑒定收集安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院2018 年3—7 月ICU 分離的19 株CRKP，排除同一病人的重復(fù)菌株。應(yīng)用法國VITEK-2 Compat 全自動(dòng)細(xì)菌分析系統(tǒng)和配套試劑GN/GN13，進(jìn)行革蘭陰性菌的鑒定及藥敏試驗(yàn)。以大腸埃希菌ATCC 25922，肺炎克雷伯菌ATCC 700603，銅綠假單胞菌ATCC 27853，陰溝腸桿菌ATCC 700323 為質(zhì)控菌株，質(zhì)控菌株購自國家衛(wèi)健委臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 儀器與試劑儀器主要為法國生物梅里埃VI?TEK-2 Compat 全自動(dòng)細(xì)菌分析系統(tǒng)，英國Biochrom超微量分光光度計(jì)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司恒溫培養(yǎng)搖床，美國Bio-Rad 電泳儀，美國Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)。試劑主要為Oxoid 公司的藥敏紙片、M-H 培養(yǎng)基，DNA Marker D、上海生工生物工程股份有限公司的4S Red plus 核酸染色劑、上樣緩沖液，天根生化科技有限公司的細(xì)菌DNA 提取試劑盒。

1.3 菌株DNA 提取挑取CRKP 菌株接種于LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃復(fù)蘇24 h 后，挑取單克隆菌落于LB 液體培養(yǎng)基中，于37 ℃搖菌過夜。取1 mL 細(xì)菌培養(yǎng)液，10 000 r/min 離心1 min，棄上清液，并用DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA。

1.4 基因組DNA 提取物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)取適量DNA 提取產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)純度和濃度。純度要求OD260∶OD280 值于1.8~2.0 范圍內(nèi)，以避免RNA 干擾；DNA濃度要求數(shù)值≥20 μg/L，并且電泳條帶清晰無雜帶，總量于1.0~2.0 μg范圍內(nèi)。

1.5 細(xì)菌全基因組測(cè)序運(yùn)用Illumina Hiseq 2500第二代高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行2×100 bp Paired-End測(cè)序，主要步驟包括對(duì)細(xì)菌DNA 樣本進(jìn)行建庫、擴(kuò)增測(cè)序及質(zhì)控。

1.6 測(cè)序結(jié)果組裝在Linux 系統(tǒng)中運(yùn)行SPAdes-2.0 軟件將測(cè)序原始FASTQ 結(jié)果拼接為FASTA 文件，運(yùn)行命令參考SPAdes-2.0 軟件網(wǎng)址https：//github.com/ablab/spades。

1.7 耐藥基因型檢測(cè)應(yīng)用staramr 軟件的Res?Finder， PointFinder 和PlasmidFinder 數(shù)據(jù)庫，通過與數(shù)據(jù)庫的耐藥基因進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)菌株攜帶的耐藥基因［7］。

1.8 MLST 分型、莢膜型、cgMLST 分型及MST 構(gòu)建、最大似然樹構(gòu)建應(yīng)用MLST軟件對(duì)CRKP基因組的7 個(gè)管家基因：gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB進(jìn)行比對(duì)，以檢測(cè)CRKP 的ST 型［8］，CRAB 菌株的莢膜型鑒定應(yīng)用Linux 系統(tǒng)運(yùn)行Kaptive 軟件檢測(cè)。應(yīng)用Ridom SeqSphere+軟件進(jìn)行cgMLST 分型及MST 構(gòu)建，其通過將菌株基因組與www.cgMLST.org 網(wǎng)站上的4 647 個(gè)參考核心基因組進(jìn)行比對(duì)，掃描基因序列間的差異，將特定等位基因類型的菌株定義為相應(yīng)的CT 型（complex type）編號(hào)。菌株間的比對(duì)結(jié)果被可視化以構(gòu)建MST，相同CT型編號(hào)的菌株聚攏為一簇，并對(duì)每個(gè)菌株的差異等位基因數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，同簇菌株間等位基因差異的閾值為15，差異的等位基因數(shù)越少表示親緣性關(guān)系越近［9］。

同時(shí)，依據(jù)全基因組序列的單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism，SNP）分析，以AY7001 號(hào)菌株序列作為參考，應(yīng)用CGE 的CSI Phy?logeny1.4 工具（網(wǎng)址：https：//cge.cbs.dtu.dk/services/CSIPhylogeny/）及FigTree v1.4.4 軟件構(gòu)建19 株CRKP 的最大似然樹，按親緣性遠(yuǎn)近分組，分析其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用WHONET 5.6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)數(shù)資料以率和例數(shù)進(jìn)行描述。

2 結(jié)果

2.1 CRKP 的臨床資料19 株CRKP 菌株標(biāo)本來源分別為痰（16 株84.21%）、腹水（1 株5.26%）、血（1株5.26%）、靜脈導(dǎo)管尖端（1 株5.25%），病人性別分別為男性（14 例73.68%）、女性（5 例26.32%）。見表1。

表1 19株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的分布情況

2.2 CRKP 的藥敏試驗(yàn)結(jié)果19 株CRKP 對(duì)頭孢菌素類、青霉素類、碳青霉烯類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、磺胺類等抗菌藥物的耐藥率均為100%，而對(duì)替加環(huán)素均敏感，耐藥率為0%。見表2。

表2 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥情況

2.3 耐藥基因分析結(jié)果19 株CRKP 的WGS 結(jié)果顯示，其共攜帶11種耐藥基因和4種質(zhì)粒，包括3種β-內(nèi)酰胺酶，19 株（100%）攜帶blaKPC-2、blaTEM-1B，15 株（78.95%）攜帶blaSHV-66；2 種氨基糖苷類中，19 株（100%）攜帶rmtB，17 株（89.47%）攜帶aa?dA2；喹諾酮類耐藥基因只有1 種為qnrS1，19 株（100%）均攜帶該基因；磺胺類耐藥基因有2 種，分別為19 株（100%）攜帶的sul2，17 株（89.47 %）攜帶的sul1；19 株（100%）均攜帶磷霉素耐藥基因fosA6、四環(huán)素耐藥基因tet（A）。另外，19 株（100%）CRKP均攜帶四種不同的質(zhì)粒，包括ColRNAI、IncFII、In?cHI1B、IncR。見圖1。

圖1 19株CRKP的耐藥基因分布

2.4 MLST 分型、莢膜型、cgMLST 分型及系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果19 株CRKP 的MLST 分型結(jié)果均為ST11 型，其莢膜型結(jié)果均為KL64 型，初步結(jié)果顯示19株CRKP具有較高親緣性。

通過cgMLST 分型，19 株CRKP 為一個(gè)譜型：CT1774 型，同一譜型聚集為一簇，簇中心菌株與周圍菌株具有1~15個(gè)等位基因的差異，本研究的中心菌株與周圍菌株具有較近的親緣性關(guān)系。MST 圖顯示中心菌株AY7007 與AY7002、AY7005、AY7008、AY7009、AY7010、AY7012、AY7013、AY7014、AY7016、AY7017、AY7018、AY7019 的等位基因差異數(shù)為6個(gè)以內(nèi)，親緣性關(guān)系較近；中心菌株AY7003 與AY7001、AY7004、AY7010、AY7011 的等位基因差異數(shù)為2 個(gè)以內(nèi)，親緣性關(guān)系相近；同時(shí)，AY7006 與AY7009 的等位基因差異數(shù)為5，AY7015與AY7016 的等位基因差異數(shù)為2，其親緣性關(guān)系相近。見圖2。

圖2 19株CRKP的最小生成樹

19 株CRKP 的MLT 結(jié)果顯示，AY7007 位于進(jìn)化樹的根部，以AY7007 為進(jìn)化祖先向周圍進(jìn)化出分支菌株，19 株菌株的進(jìn)化關(guān)系較近。根據(jù)分支節(jié)點(diǎn)上Bootstrap 值越大該節(jié)點(diǎn)置信度越高的判斷標(biāo)準(zhǔn)分為四組克隆型，Ⅰ組為AY7001、AY7003、AY7004、AY7011，Ⅱ組為AY7006、AY7009，Ⅲ組為AY7012、AY7018，Ⅳ 組 為 AY7015、AY7016。見圖3。

圖3 19株CRKP的最大似然樹

3 討論

CRKP 的耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，主要包括產(chǎn)碳青霉烯酶、高產(chǎn)AmpC酶、膜孔蛋白的缺失、主動(dòng)外排泵過度表達(dá)等。其中，產(chǎn)碳青霉烯酶為其主要的耐藥機(jī)制，本研究中19 株CRKP 均攜帶β-內(nèi)酰胺類耐藥基因肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶2 型（β-lactamase Klebsiella pneumonia carbapenemase，blaKPC-2），與碳青霉烯類抗生素亞胺培南、厄他培南、美羅培南（耐藥率均為100%）的藥敏結(jié)果相一致，blaKPC-2是一種常見的碳青霉烯類藥物的耐藥基因，于2007年首次在中國一家醫(yī)院被發(fā)現(xiàn)［10］，KPCs酶通常由質(zhì)粒編碼，產(chǎn)酶菌株僅對(duì)少數(shù)抗菌藥物敏感，感染病人的死亡率較高［11-12］。氨基糖苷類耐藥基因中，rm?tB檢出率為100%，aadA2檢出率為89.47%，aadA2檢出率小于阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素的藥敏結(jié)果（耐藥率100%），說明aadA2并非引起氨基糖苷類耐藥的主要原因。喹諾酮類耐藥基因qnrS1檢出率100%與環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的藥敏結(jié)果（耐藥率100%）相一致。19株CRKP均攜帶四環(huán)素類耐藥基因tet（A）與替加環(huán)素耐藥表型（耐藥率0%）并不一致，說明tet（A）不是替加環(huán)素的耐藥基因。tet（A）屬于MFS 外排泵，而RND 型外排泵、AcrAB 型外排泵和核糖體蛋白的突變才是導(dǎo)致替加環(huán)素耐藥的主要機(jī)制［13-14］。同時(shí)，質(zhì)粒在傳播細(xì)菌的耐藥性和毒力方面也起著關(guān)鍵作用［15］，本研究篩選出四種質(zhì)粒如ColRNAI、IncFII、IncR、IncHI1B，其中，ColRNAI、IncFII、IncR為耐藥性質(zhì)粒，19 株CRKP 均攜帶此三種質(zhì)粒，并同時(shí)存在于產(chǎn)KPC-2的ST11型菌株，與Yu 等［16］的研究相符，此三種質(zhì)?？赡芘c攜帶blaK?PC-2耐藥基因相關(guān)。IncHI1B是一種可攜帶耐藥基因和毒力基因的結(jié)合性質(zhì)粒，國外一家醫(yī)院曾報(bào)道陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌和弗勞地氏桿菌的IncHI1B質(zhì)粒中均攜帶blaNDM［2］，該質(zhì)?？稍诓煌N間進(jìn)行碳青霉烯類耐藥基因的水平傳播［17］。如此嚴(yán)峻的耐藥情況和復(fù)雜多樣的耐藥基因給臨床抗感染治療帶來了困難，當(dāng)耐藥菌防控措施落實(shí)不當(dāng)、醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生依從性低、抗生素的使用不合理等情況發(fā)生時(shí)，耐藥菌將在醫(yī)院內(nèi)、科室間進(jìn)行傳播流行，將會(huì)給病人帶來健康和經(jīng)濟(jì)損失，給社會(huì)造成一定的危害。因此，有效的防控措施至關(guān)重要。

本研究的19 株CRKP 均為ST11-KL64 型，均攜帶blaKPC-2耐藥基因。ST11 已成為我國CRKP 的優(yōu)勢(shì)克隆型，約占60%百分比［18］。國內(nèi)有研究曾報(bào)道某院的ST11-KL47型CRKP自2016年后發(fā)生亞克隆轉(zhuǎn)移為ST11-KL64 型，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示ST11-KL64 型由ST11-KL47 型祖系重組所產(chǎn)生。ST11-KL64 型CRKP 感染病人的30 d 病死率高于其他型別CRKP 感染病人，其高毒力表型與生物膜產(chǎn)生較多相關(guān)，致使該型抵抗人中性粒細(xì)胞的殺滅能力、對(duì)大蠟螟幼蟲感染模型的殺滅作用均高于ST11-KL47 型，并且調(diào)控黏液表型基因（regulator of mu?coid phenotype gene A，rmpA）的rmpA-rmpA2共同存在于ST11-KL64 型菌株亦使其毒力增強(qiáng)，rmpA-rm?pA2基因通過毒力質(zhì)粒進(jìn)行亞克隆轉(zhuǎn)移，而該型對(duì)于干燥環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，進(jìn)一步促進(jìn)其在醫(yī)院內(nèi)的傳播［19］。blaKPC-2耐藥基因的保守移動(dòng)元件在質(zhì)粒上的傳播致使我國CRKP 菌株的廣泛流行［18］。因此，對(duì)于攜帶blaKPC-2耐藥基因的ST11-KL64 型CRKP 進(jìn)行前瞻性主動(dòng)篩查，提前對(duì)感染病人進(jìn)行主動(dòng)干預(yù)的意義十分重要。

傳統(tǒng)的病原菌分型與溯源方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）［20-21］等，其中PFGE被視為同源性分析的“金標(biāo)準(zhǔn)”， 但亦具有耗時(shí)長(zhǎng)、操作難度大、批次間差異性大的缺點(diǎn)［22］。隨著全基因組測(cè)序（whole genome sequenc?ing，WGS）技術(shù)的迅速發(fā)展，及測(cè)序成本的降低，WGS 結(jié)合生物信息學(xué)分析的方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于分子生物流行病學(xué)研究中，技術(shù)方法包括MLST 分型、cgMLST 分型、SNP 等，cgMLST 分型和SNP 具有較好的分辨率、準(zhǔn)確性、可比性、可操作性，有利于實(shí)驗(yàn)室間的標(biāo)準(zhǔn)化［23-24］。本研究同時(shí)應(yīng)用cgMLST分型和SNP 兩種方法對(duì)19 株CRKP 的親緣性關(guān)系進(jìn)行溯源。其中，基于cgMLST 的Ridom SeqSphere+軟件根據(jù)核心基因組等位基因的差異數(shù)目生成MST，親緣性關(guān)系越近距離越近，并聚集為一簇。本研究MST 圖顯示19 株CRKP 聚集為一簇CT1774型，以AY7007、AY7003 菌株為中心，向周圍菌株進(jìn)化播散，周圍菌株與中心菌株的等位基因差異數(shù)目閾值為15 以內(nèi)，說明19 株CRKP 的親緣性關(guān)系相近。同時(shí)，應(yīng)用FigTree v1.4.4 軟件基于最大似然法的單核苷酸多態(tài)性構(gòu)建MLT圖［25］，結(jié)果顯示19株菌株以AY7007 為進(jìn)化祖先向周圍進(jìn)化分支，Ⅰ組克隆型的4 株菌株（AY7001、AY7003、AY7004、AY7011）分離自2018 年3 月10 日至4 月11 日，Ⅱ組克隆型的2 株菌株（AY7006、AY7009）分離于2018年5 月2 日、5 月4 日，Ⅳ組克隆型的2 株菌株（AY7015、AY7016）分離于2018 年5 月28 日、6 月6日，這三組組間采樣時(shí)間間隔較遠(yuǎn)，但組內(nèi)采樣時(shí)間間隔較近。Ⅰ組、Ⅳ組克隆型組內(nèi)病人床位相鄰，且兩組病人均接受過床旁共用的纖維支氣管鏡檢測(cè)，推測(cè)可能由于床旁物體表面、纖維支氣管鏡或醫(yī)務(wù)人員的手等引起病人間的交叉?zhèn)鞑?。雖然，Ⅱ組克隆型中病人床位不相鄰；Ⅲ組克隆型的2 株菌株（AY7012、AY7018）分離于2018 年5 月21 日、6月24 日，組內(nèi)采樣時(shí)間間隔較遠(yuǎn)，且床位不相鄰或相同，由于CRKP 產(chǎn)生生物膜，生物膜可在醫(yī)院的各類導(dǎo)管及醫(yī)療設(shè)備內(nèi)、外表面長(zhǎng)期存活，能保護(hù)病原菌抵抗外界環(huán)境變化［26-27］，故Ⅱ組、Ⅲ組克隆型仍不能排除醫(yī)務(wù)人員的手或共用檢查設(shè)備表面引起CRKP的傳播。

由于本研究是針對(duì)ICU的醫(yī)院感染病例高發(fā)情況的調(diào)查，因而在菌株收集數(shù)目和標(biāo)本來源方面具有一定的局限性。另外，由于目前缺乏國際通用的細(xì)菌基因組數(shù)據(jù)分析標(biāo)準(zhǔn)化流程，對(duì)于判斷暴發(fā)克隆的SNP 閾值缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，致使系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。后續(xù)筆者將對(duì)以上不足之處進(jìn)行深入研究，優(yōu)化病原菌溯源分析策略，完善菌株數(shù)目及標(biāo)本來源，為多重耐藥菌防控工作提供更科學(xué)的數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，該院ICU 的CRKP 主要耐藥機(jī)制為攜帶blaKPC-2并產(chǎn)KPC 酶；CRKP 分型為ST11-KL64-CT1774型，同源相關(guān)性高，存在科內(nèi)克隆性傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

（本文圖3見封三）