張玉俊，朱琳，趙璇，地力亞爾·吾斯曼江，王巖

作者單位：1新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊 830054；

2新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊 830011

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第三大最常見的惡性腫瘤，也是中國(guó)癌癥相關(guān)死亡的第二大主要原因［1］。目前，手術(shù)切除是早期肝細(xì)胞癌的主要治療方法。然而，由于缺乏特異性癥狀大多數(shù)肝細(xì)胞癌病例在診斷時(shí)已處于晚期階段手術(shù)切除率相對(duì)較低［2］。盡管近年來(lái)在治療方面取得了巨大進(jìn)展，但由于其侵襲性的生物學(xué)特性，復(fù)發(fā)率高達(dá)70%，手術(shù)切除或肝移植成功后5 年生存率低于60%［3］。因此，確定新的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物為HCC 的準(zhǔn)確診斷、個(gè)體化治療和預(yù)后預(yù)測(cè)具有重要意義。

壞死性凋亡（necroptosis）是由受體相互作用蛋白激酶RIPK1，RIPK3 和混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein recombi?nant protein，MLKL）介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡形式，其主要特征為質(zhì)膜完整性的早期喪失，細(xì)胞內(nèi)容物泄漏和細(xì)胞器腫脹［4］。據(jù)報(bào)道，壞死性凋亡在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，例如神經(jīng)退行性疾病，缺血性心血管疾病和癌癥轉(zhuǎn)移［5］。此外，壞死性凋亡通過(guò)在腫瘤微環(huán)境中釋放損傷相關(guān)分子、細(xì)胞因子和趨化因子，從而產(chǎn)生腫瘤促進(jìn)或抗腫瘤作用［6］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long Noncoding RNA， ln?cRNA）是具有超過(guò)200 個(gè)核苷酸轉(zhuǎn)錄本的非編碼RNA，在體內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、mRNA 剪接和mRNA 轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用［7］，與腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移和免疫途徑密切相關(guān)，其可通過(guò)與miRNA 相互作用來(lái)調(diào)節(jié)壞死性凋亡相關(guān)基因產(chǎn)物，從而調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)程［8］。研究表明壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（necroptosis-re?lated long noncoding RNAs，NRLs）與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括胃癌［9］、乳腺癌［10］和肺腺癌［11］，而NRLs 與HCC 間的關(guān)系尚未見廣泛報(bào)道。因此，進(jìn)一步闡明NRLs 與 HCC 間的關(guān)系對(duì)于探索HCC新型治療靶點(diǎn)和改善病人預(yù)后至關(guān)重要。

在這項(xiàng)研究中，通過(guò)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析分析從TCGA 肝細(xì)胞癌（TCGA-LIHC）轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)中挖掘NRLs。然后，通過(guò)單變量Cox 和LASSO-Cox 回歸分析，鑒定出了用于預(yù)測(cè)HCC 病人總生存期（overall survival，OS）的4 個(gè)NRLs 特征。此外，基于4 個(gè)NRLs 預(yù)后特征的藥物敏感性分析為HCC 病人的臨床個(gè)體化治療提供了理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究所有公共數(shù)據(jù)均符合以下納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）納入病人經(jīng)HCC 病理確診；（2）納入病人的臨床資料完整；（3）納入病人有OS 的隨訪信息，且OS 大于30 d。從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得374 份HCC 組織和50 份正常組織樣本的RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)和相應(yīng)臨床信息。根據(jù)壞死性凋亡基因集M24778.gmt和文獻(xiàn)檢索［12］，共獲得67 個(gè)壞死性凋亡相關(guān)基因。從GENCODE（https：//www.gencodegenes.org/，截至2022 年4 月25 日）網(wǎng)站檢索人類LncRNA 的GTF 注釋文件。從以前的文獻(xiàn)中獲得47 個(gè)與免疫檢查點(diǎn)相關(guān)的基因［11］。由于TCGA 數(shù)據(jù)是公開的，本研究不需要當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)的批準(zhǔn)。然而，本研究嚴(yán)格遵守了TCGA數(shù)據(jù)訪問(wèn)政策和出版指南。

1.2 方法

1.2.1 壞死性凋亡相關(guān)LncRNA 的鑒定使用從GENCODE 網(wǎng)站檢索到的人類LncRNA 的GTF 注釋文件，從TCGA-LIHC RNA-seq數(shù)據(jù)中鑒定HCC相關(guān)LncRNA。隨后，通過(guò)Pearson 相關(guān)分析HCC 樣本中壞死性凋亡相關(guān)基因與鑒定出的LncRNA 的共表達(dá)關(guān)系，過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)：（1）|Pearson 相關(guān)系數(shù)|>0.4；（2）P<0.001。為了證明NLRs 和相應(yīng)的靶標(biāo)mRNA 之間的相互調(diào)控連接，使用“igraph”R 包可視化lncRNAmRNA 網(wǎng)絡(luò)。最后，采用“l(fā)imma”R 包鑒定差異表達(dá)NRLs，標(biāo)準(zhǔn)為：（1）|log2 差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）|>1；（2）錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR，P值由Benjamini& Hoch?berg 校正進(jìn)行調(diào)整）<0.05，并采用火山圖進(jìn)行可視化。

1.2.2 預(yù)后模型的建立與驗(yàn)證首先，應(yīng)用單變量Cox 回歸確定預(yù)后相關(guān)的NRLs（P<0.05），為防止模型的過(guò)度擬合使用 “glmnet”和“survminer”R 包進(jìn)行LASSO-Cox 回歸（使用10 倍交叉驗(yàn)證估計(jì)的懲罰參數(shù)）篩選出與HCC 預(yù)后相關(guān)的最佳NRLs，并構(gòu)建預(yù)后模型。接下來(lái)，根據(jù)NRLs 的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平和從LASSO-Cox 回歸分析中得出的回歸系數(shù)計(jì)算每個(gè)HCC 病人的生存風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。計(jì)算公式如下：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=expNRL1×β1 + expNRL2×β2+ expNRL3×β3+… + expNRLn ×βn，“exp”代表已鑒定的NRL 的表達(dá)水平，“β”為通過(guò)LASSO-Cox 回歸確定的系數(shù)。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位值將病人劃分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，使用“survival”R包分析高低風(fēng)險(xiǎn)組間OS是否存在差異（P<0.05），并采用“survminer”R 包分析臨床病理特征分層高低風(fēng)險(xiǎn)組間OS 的差異（P<0.05）以了解NRLs 預(yù)后特征的適用性。隨后，進(jìn)行單變量-Cox 和多變量-Cox 回歸分析，以探索風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分特征是否為HCC 病人的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)（P<0.05）。最后，使用 “timeROC”“survival”R 包繪制了時(shí)間依賴的受試者操作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線以評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型對(duì)1 年、3 年和5 年OS 的預(yù)測(cè)能力，并采用“ROCR” R 包繪制1年ROC曲線比較風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與傳統(tǒng)臨床特征指標(biāo)的預(yù)測(cè)能力。

1.2.3 列線圖的構(gòu)造和校準(zhǔn)使用“rms” R 包，建立整合臨床病理學(xué)特征和壞死性凋亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（NRLs risk-score）的列線圖以預(yù)測(cè)HCC 病人的1 年、3 年和5 年OS。隨后，開發(fā)了校準(zhǔn)曲線來(lái)說(shuō)明實(shí)際結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果之間的一致性。

1.2.4 基因集富集分析使用基因集富集分析（gene set enrichment analyses ，GSEA）軟件4.1.2（http ：//www.gsea-msigdb.org /gsea/index.jsp）鑒定兩組中差異表達(dá)的KEGG 途徑，顯著富集的生物過(guò)程和途徑閾值設(shè)置為P<0.05，F(xiàn)DR<0.25。結(jié)果由“gri?dExtra”“grid”和“ggplot2” R 包進(jìn)行可視化。

1.2.5 腫瘤微環(huán)境分析腫瘤微環(huán)境（tumor micro?environment，TME）由腫瘤、基質(zhì)和免疫細(xì)胞組成?；? 種平臺(tái)（XCELL、TIMER、QUANTISEQ、MCP?COUNTER、EPIC、CIBERSORT-ABS 和CIBERSORT）估計(jì)了TCGA-LIHC 數(shù)據(jù)集中免疫細(xì)胞的表達(dá)，并采用Spearman 相關(guān)性分析評(píng)估了免疫細(xì)胞亞群與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的關(guān)系（P<0.05）。然后，使用“estimate”R 包計(jì)算TME 評(píng)分，包括基質(zhì)評(píng)分（StromalScore）、免疫評(píng)分（ImmuneScore）以及總的估計(jì)評(píng)分（ESTIMATE?Score），并采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)比較腫瘤TIME 在高低風(fēng)險(xiǎn)組間的差異（P<0.05）。通過(guò)單樣本基因集富集分析（single-sample GSEA ，ssGSEA）計(jì)算16 個(gè)免疫細(xì)胞和13 種免疫相關(guān)通路活性在高低風(fēng)險(xiǎn)組間的浸潤(rùn)評(píng)分差異（通過(guò)barplot 可視化）。最后，使用“ggpubr”R 包對(duì)高低風(fēng)險(xiǎn)組間的免疫檢查點(diǎn)激活進(jìn)行比較。

1.2.6 基于NRLs 特征篩選疾病潛在藥物為了預(yù)測(cè)基于NRLs 特征兩種不同風(fēng)險(xiǎn)群體的HCC 病人對(duì)化療藥物的反應(yīng)，使用“pRRophetic”R 包來(lái)評(píng)估第8屆美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）指南強(qiáng)烈推薦的20種普通化療藥物的半最大抑制濃度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）。并采用Wilcoxon 符號(hào)秩檢驗(yàn)分析高低風(fēng)險(xiǎn)組間IC50值的差異（P<0.05）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究中使用的統(tǒng)計(jì)分析工具是R 軟件4.0.2。采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行高低風(fēng)險(xiǎn)組間的差異分析，運(yùn)用Kaplan-Meier 方法和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)比較高低風(fēng)險(xiǎn)組病人的OS。雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本研究納入來(lái)自TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的343 例HCC 病人以1∶1 的比例隨機(jī)分配到訓(xùn)練集（n=172）或測(cè)試集（n=171）。研究流程如圖1所示。

圖1 研究流程圖

2.1 鑒定HCC 病人中壞死性凋亡相關(guān)LncRNA經(jīng)篩選從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中共獲得343 個(gè)HCC 組織和50個(gè)正常組織的樣本。根據(jù)人類LncRNA的GTF注釋文件，從TCGA-LIHC 基因表達(dá)文件中鑒定出16 774 個(gè)LncRNA。同時(shí)，根據(jù)壞死性凋亡基因集共鑒定出67 個(gè)壞死性凋亡基因。通過(guò)Pearson 相關(guān)分析最終獲得989 個(gè)NRLs（圖2A）。差異分析結(jié)果顯示，760 個(gè)NRLs（9 個(gè)下調(diào)，751 個(gè)上調(diào)）在HCC 和正常組織中差異表達(dá)（圖2B）。

圖2 鑒定HCC病人中壞死性凋亡相關(guān)LncRNA:A為壞死性凋亡基因與 lncRNA 之間的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)；B為760個(gè)差異表達(dá)NRLs的火山圖

2.2 模型的構(gòu)建與驗(yàn)證在TCGA 訓(xùn)練集中使用單變量Cox回歸分析，獲得了47個(gè)與OS顯著相關(guān)的NRLs（P<0.05），并制作了熱圖（圖3A、3B）。為了避免過(guò)度擬合并提高預(yù)后特征的準(zhǔn)確性，對(duì)這些NRLs進(jìn)行了LASSO 懲罰的Cox 分析（圖3C、3D），并在交叉驗(yàn)證誤差最小點(diǎn)選擇了4 個(gè)NRLs，使用以下公式計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分：NRLs risk-Score=（0.315 1×ZFPM2-ASI）+（0.863 7×MKLN1-AS）+（0.462 1×LINC0111 6）+（1.055 6×AP003390.1）。

圖3 識(shí)別HCC中NRLs預(yù)后特征：A為單變量Cox回歸分析森林圖；B為NRLs差異表達(dá)熱圖；C為NRLs的LASSO系數(shù)曲線；D為L(zhǎng)ASSO算法中變量選擇的10倍交叉驗(yàn)證

在訓(xùn)練集、測(cè)試集和完整的集合中按風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位值將病人劃分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，比較了HCC 病人的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布、生存狀態(tài)、生存時(shí)間以及NRLs 在兩組病人中的表達(dá)分布（圖4A-J）。這些結(jié)果都表明高風(fēng)險(xiǎn)組病人的預(yù)后較差。同時(shí)，按年齡（Age）、性別（Gender）、分級(jí)（Grade）、分期（Stage）進(jìn)行分組，研究HCC 病人在臨床病理變量中的風(fēng)險(xiǎn)特征與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，除年齡>65 歲和女性外，其余的臨床病理學(xué)特征分層中低風(fēng)險(xiǎn)組的OS均顯著高于高風(fēng)險(xiǎn)組，驗(yàn)證了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的普遍適用性。

圖4 不同集合中風(fēng)險(xiǎn)模型的預(yù)后：A~C為訓(xùn)練集、驗(yàn)證集合完整集合的風(fēng)險(xiǎn)曲線；D~F為訓(xùn)練集、驗(yàn)證集和完整集合的生存狀態(tài)圖；G~I為訓(xùn)練集、驗(yàn)證集和完整集合中4個(gè)NRLs表達(dá)熱圖

在單變量-Cox 和多變量-Cox 回歸中，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的風(fēng)險(xiǎn)比（HR）分別為1.06 和1.07（P<0.05）（圖5A、B）。NRLs 預(yù)后特征的1 年、3 年和5 年ROC 曲線下面積（AUC）分別為0.74、0.66 和0.67（圖5C）。在模型的1 年ROC 中，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的AUC 為0.74，與年齡（Z=10.90，P<0.01）、性別（Z=15.25，P<0.001）、分級(jí)（Z=11.92，P<0.001）、分期（Z=14.45，P<0.001）間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明其具有較強(qiáng)的預(yù)測(cè)能力（圖5D）。

圖5 驗(yàn)證預(yù)后特征的預(yù)測(cè)值：A為臨床病理學(xué)因素和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的單變量-Cox回歸；B為臨床病理學(xué)因素和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的多變量-Cox回歸；C為基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分特征的1年、3年和5年ROC曲線；D為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性與臨床病理特征的比較

2.3 列線圖的構(gòu)造和校準(zhǔn)根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和臨床病理學(xué)因素，開發(fā)了用于預(yù)測(cè) 1 年、3 年和5 年OS的列線圖（圖6A）。校準(zhǔn)曲線顯示出列線圖的預(yù)測(cè)能力與實(shí)際觀察值具有良好的一致性（圖6B）。

圖6 模型的列線圖和校準(zhǔn)曲線：A為用于預(yù)測(cè)HCC病人 1 年、3 年和 5 年OS 的列線圖；B為列線圖的校準(zhǔn)曲線

2.4 GSEA 富集分析為了研究高低風(fēng)險(xiǎn)組間富集途徑的差異，采用GSEA 進(jìn)行KEGG 途徑富集分析。結(jié)果顯示，NOD 樣受體信號(hào)通路、Notch 信號(hào)通路、細(xì)胞周期、RIG-I 樣受體信號(hào)通路、癌癥通路在高風(fēng)險(xiǎn)組中顯著富集；脂肪酸代謝、初級(jí)膽汁酸代謝、藥物代謝細(xì)胞色素P450、PPAR 信號(hào)通路、過(guò)氧化物酶體在低風(fēng)險(xiǎn)組中顯著富集（圖7）。

圖7 高低風(fēng)險(xiǎn)組間GSEA富集分析

2.5 腫瘤微環(huán)境分析首先，我們研究了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與不同平臺(tái)腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，更多的免疫細(xì)胞與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分存在正相關(guān)關(guān)系（表1）。同時(shí)，免疫微環(huán)境分析結(jié)果顯示，高風(fēng)險(xiǎn)病人的ImmuneScore（Z=?3.53，P<0.001）和ESTIMATE?Score（Z=?2.52，P<0.05）明顯高于低風(fēng)險(xiǎn)病人（圖8A~8C）。為了進(jìn)一步探索風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與免疫狀態(tài)之間的相關(guān)性，ssGSEA結(jié)果顯示（圖8D~8E），7種免疫細(xì)胞在高低風(fēng)險(xiǎn)組中存在差異包括：抗原呈遞過(guò)程中像成熟樹突狀細(xì)胞（aDCs）、樹突狀細(xì)胞（DCs）、未成熟樹突狀細(xì)胞（iDCs）、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（pDCs）、Th1 細(xì)胞（Th1 cells）、Th2 細(xì)胞（Th2 cells）、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）且均在高風(fēng)險(xiǎn)組高表達(dá)。10 種免疫相關(guān)途徑在高低風(fēng)險(xiǎn)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且均在高風(fēng)險(xiǎn)組中上調(diào)，包括抗原提呈細(xì)胞共抑制（APC co inhibition）、抗原提呈細(xì)胞共刺激（APC co stimulation）、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體（CCR）、檢查點(diǎn)（check point）、人類白細(xì)胞抗原（HLA）、主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ（MHC class Ⅰ）、副炎癥（Parainfla?mation）、T 細(xì)胞共抑制（T cell co inhibition）、T 細(xì)胞共刺激（T cell co stimulation）、Ⅱ型干擾素反應(yīng)（typeⅡ IFN Reponse）。此外，通過(guò)比較不同風(fēng)險(xiǎn)組之間的免疫檢查點(diǎn)激活，我們發(fā)現(xiàn)幾乎所有免疫檢查點(diǎn)在高風(fēng)險(xiǎn)組中表達(dá)更多的活性（圖8F）。

表1 不同平臺(tái)免疫細(xì)胞與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的相關(guān)性

圖8 腫瘤微環(huán)境分析：A~C為高低風(fēng)險(xiǎn)組間 StromalScore、ImmuneScore 和 ESTIMATEScore 的箱線圖；D~E為風(fēng)險(xiǎn)組中免疫細(xì)胞和免疫功能的ssGSEA評(píng)分；F為風(fēng)險(xiǎn)組間免疫檢查點(diǎn)表達(dá)的差異

2.6 基于NRLs 特征篩選疾病潛在藥物我們計(jì)算了20 種常規(guī)化療藥物在高低風(fēng)險(xiǎn)組中的IC50值，以評(píng)估HCC 病人對(duì)化療的反應(yīng)。結(jié)果顯示，兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組對(duì)16種化療藥物的反應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其中AICAR、Axitinib、Cyclopamine、DMOG、Docetaxel、Gefitinib、Lapatinib、Nilotinib、Vinblastine藥物低風(fēng)險(xiǎn)組的IC50 值較低，表明這些藥物對(duì)低風(fēng)險(xiǎn)組病人的療效較好；而Cisplatin、Doxorubicin、Gemcitabine、Imatinib、Paclitaxel、Salubrinal、Tipifarn?ib 藥物在高風(fēng)險(xiǎn)組中IC50 值較低表明對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)組病人療效較好。其余4個(gè)化療藥物的IC50值在高低風(fēng)險(xiǎn)組間不存在差異。

3 討論

HCC 有較高的發(fā)病率（28.33/10 萬(wàn)）和死亡率（24.69/10 萬(wàn)）對(duì)人類健康構(gòu)成極大威脅，為HCC 病人確定特異和準(zhǔn)確的預(yù)后特征對(duì)于改善預(yù)后至關(guān)重要。先前的研究表明，壞死性凋亡在許多類型癌癥的遷移和侵襲中發(fā)揮重要的作用被認(rèn)為是消除癌細(xì)胞有希望的療法［13］。lncRNA 已被證明廣泛參與癌癥相關(guān)細(xì)胞通路，在預(yù)后和診斷方面具有良好的預(yù)測(cè)能力［14］。在本研究中構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型由4個(gè)NRLs組成，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位值將病人劃分為高低風(fēng)險(xiǎn)兩組。生存分析、Cox 回歸分析、ROC 曲線均表明風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分可作為獨(dú)立預(yù)后因子，構(gòu)建的用于預(yù)測(cè)HCC 病人OS 的列線圖顯示出較好的預(yù)測(cè)性能。腫瘤微環(huán)境分析顯示高低風(fēng)險(xiǎn)組間存在差異。最后，比較了高低風(fēng)險(xiǎn)組間的藥物敏感性，共篩選出16種化療藥物的IC50值在兩組間存在差異。

在這項(xiàng)研究中，獲得了760 個(gè)差異表達(dá)的NRLs來(lái)探索預(yù)后功能。通過(guò)單變量Cox、LASSO 和多變量Cox 回歸分析，最終確定了4 個(gè)NRLs（ZFPM2-AS1、MKLN1-AS、LINC01116、AP003390.1）與HCC病人的OS 顯著相關(guān)，以構(gòu)建NRLs 預(yù)后特征。ZF?PM2-AS1 位于染色體8q23 上，與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如，肺腺癌、甲狀腺癌和胃癌等［15］。研究［16］表明，ZFPM2-AS1 在HCC 組織中過(guò)表達(dá)與較差的總生存期相關(guān)，其可充當(dāng) miRNA海綿通過(guò)多個(gè)軸促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖，凋亡，遷移和侵襲。Yan等［17］在基于TCGA 的HCC 病人預(yù)后特征研究中ZFPM2-AS1 被確定為預(yù)后lncRNA。與此結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)與正常組織相比HCC 組織中ZFPM2-AS1 表達(dá)顯著升高。MKLN1-AS 在HCC 中可起到致癌調(diào)節(jié)劑的作用。Pan 等［18］體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明沉默MKLN1-AS 可抑制HCC 的HuH7 和LM3 細(xì)胞增殖、血管生成、遷移和侵襲。其可通過(guò)作為miR-654-3p的分子海綿來(lái)增加HDGF 表達(dá)，在HCC 過(guò)程中產(chǎn)生促癌作用，并且MKLN1-AS 的下調(diào)可抑制HCC 細(xì)胞的侵襲性表型［19］。MKLN1-AS 在HCC 中被報(bào)道可作為診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物［20］，進(jìn)一步證實(shí)了本研究的可靠性。LINC01116 異常表達(dá)與多種癌癥相關(guān)，包括肺癌，胃癌，結(jié)直腸癌，膠質(zhì)瘤和骨肉瘤［21］。其在HCC中作為癌基因起作用，參與EMT和免疫調(diào)節(jié)，過(guò)表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)EMT 相關(guān)因子的表達(dá)，與HCC 細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展和遷移密切相關(guān)［22］。Jiang 等［23］研究表明，LINC01116 過(guò)表達(dá)的HCC 病人通常具有較低的OS，可作為HCC的預(yù)后生物標(biāo)志物。AP003390.1 與HCC 關(guān)系的研究報(bào)道較少，在本研究中AP003390.1在HCC病人中高表達(dá)與病人的預(yù)后密切相關(guān)。

TME 中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)通常隨著腫瘤的發(fā)生和發(fā)展而變化。在這項(xiàng)研究中，基于TME 評(píng)分，高風(fēng)險(xiǎn)群體中的樣本具有較高的免疫評(píng)分。進(jìn)一步分析表明，aDCs、DCs、iDCs、pDCs、Th1 cells、Th2 cells、Treg 均在高風(fēng)險(xiǎn)組高表達(dá)，表明這些異常浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞可能與HCC 病人的腫瘤啟動(dòng)和發(fā)展有關(guān)。同時(shí)，APC co inhibition、APC co stimulation、CCR、Check point、HLA、MHC class Ⅰ、Parainflama?tion、T cell co inhibition、T cell co stimulation、Type ⅡIFN Reponse 在高風(fēng)險(xiǎn)組病人中具有較高的活性，表明HCC 的發(fā)生和發(fā)展可能與異常激活的免疫相關(guān)途徑存在關(guān)聯(lián)。隨后，分析了常見免疫檢查點(diǎn)表達(dá)與NRLs 預(yù)后特征之間的相關(guān)性。研究［24］指出，免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)水平與免疫療法的療效高度相關(guān)。結(jié)果顯示，與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，高風(fēng)險(xiǎn)HCC 病人中的大多數(shù)免疫檢查點(diǎn)表達(dá)都升高，表明風(fēng)險(xiǎn)較高的HCC 病人接受免疫治療時(shí)療效更好。最后，比較了20種常見化療藥物在高低風(fēng)險(xiǎn)組中的敏感性。結(jié)果顯示，9 種化療藥物對(duì)低風(fēng)險(xiǎn)組病人療效較好，7 種化療藥物對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)組病人療效較好，為指導(dǎo)臨床醫(yī)生為HCC 病人選擇合適的抗癌藥物提供理論基礎(chǔ)。

這項(xiàng)研究仍然存在一些局限性。首先，單因素-Cox 結(jié)果顯示AC138356.1 是唯一對(duì)HCC 發(fā)病具有保護(hù)作用的NRLs，然而僅考慮了統(tǒng)計(jì)學(xué)意義將其排除在模型之外。其次，分析結(jié)果未經(jīng)體內(nèi)和體外驗(yàn)證，生物學(xué)功能需要進(jìn)一步闡明。因此，在接下來(lái)的工作中將收集和擴(kuò)展臨床樣本，并嘗試通過(guò)外部實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證該模型的準(zhǔn)確性。

（本文圖2見插圖8-7，圖3，4見插圖8-8，圖5，6見插圖8-9，圖7，8見插圖8-10）