胡慧玲，李惠武，朱世茂，楊銀銀，海妮薩依姆·圖爾蓀，王永晨，李卉

作者單位：1新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊 830011；

2粵北人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 韶關(guān) 512025；

3新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊830011

食管癌（esophageal cancer，EC）是常見(jiàn)的惡性腫瘤，在全球腫瘤的發(fā)病率與死亡率中分別居第七位與第六位［1］。中國(guó)是食管癌高發(fā)國(guó)家，食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是其主要類型，近年來(lái)，食管癌的診斷與治療雖然取得了較大進(jìn)展，但預(yù)后較差，有效治療藥物較少，5 年相對(duì)生存率和觀察生存率僅為20.9% 和18.4%［2］。因此研究食管癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)其治療及預(yù)后有著重大意義。

基于腫瘤學(xué)和免疫學(xué)的創(chuàng)新與發(fā)展，研究［3］發(fā)現(xiàn)機(jī)體的免疫逃逸與腫瘤的形成密切相關(guān)。免疫逃逸是腫瘤存活和發(fā)展的關(guān)鍵因素，是指腫瘤細(xì)胞在增殖和轉(zhuǎn)移過(guò)程中可以通過(guò)各種機(jī)制逃避免疫系統(tǒng)的識(shí)別和攻擊。利用免疫療法阻斷腫瘤的免疫逃逸，恢復(fù)機(jī)體識(shí)別殺傷腫瘤細(xì)胞的能力是目前的研究熱點(diǎn)，主要為程序性細(xì)胞死亡受體1（pro?grammed cell death protein 1，PD-1）/程序性細(xì)胞死亡配體1（programmed cell death ligand1，PD-L1）拮抗劑［4］。導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵是腫瘤免疫抑制微環(huán)境，腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)PD-L1，通過(guò)與活化的T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 受體特異性結(jié)合，抑制免疫反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和殺傷，導(dǎo)致免疫逃逸。在正常的生理?xiàng)l件下通過(guò)PD-L1/PD-1 軸抑制免疫反應(yīng)有助于維持耐受性和自身免疫之間的平衡。因此，PD-L1 是維持免疫穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)，由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor- alpha， TNF-α）能誘導(dǎo)PD-L1 的表達(dá)。在小鼠模型中，PD-L1 的表達(dá)在單核細(xì)胞成熟為巨噬細(xì)胞的過(guò)程中明顯增加，并在單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞時(shí)達(dá)到其峰值［7］。PD-L1 的表達(dá)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人的單核細(xì)胞中缺乏，但可以通過(guò)外源性添加TNF-α 來(lái)重建［8］。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）具有活化巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞等作用，產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)。腫瘤微環(huán)境在癌癥轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用，并顯著影響癌癥病人的治療效果［9］。近年來(lái)，大量的研究顯示Jak2/Stat3信號(hào)通路的持續(xù)激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密不可分［10］。

本研究自2020 年5―10 月通過(guò)使用LPS 經(jīng)Jak2/Stat3 信號(hào)通路干預(yù)TNF-α 誘導(dǎo)的PD-L1，驗(yàn)證LPS 對(duì)PD-L1 的干預(yù)作用，為食管癌的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料人食管鱗癌Eca-109細(xì)胞株購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD 公司；化學(xué)發(fā)光底物試劑盒（ECL）購(gòu)自安徽Biosharp 公司；BSA 蛋白檢測(cè)試劑盒、彩虹蛋白marker均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、青鏈霉素混合液、磷酸鹽緩沖液（PBS）緩沖液均購(gòu)自以色列Biological Industries 公司；抗體：p-Jak2、p-Stat3、PD-L1、山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG 均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；β 肌動(dòng)蛋白（β-ac?tin）購(gòu)自北京中杉金橋公司；TNF-α細(xì)胞誘導(dǎo)因子購(gòu)自美國(guó)Pepro Tech 公司；LPS 脂多糖購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將人食管癌細(xì)胞株Eca-109 培養(yǎng)于含1%青鏈霉素混合液及10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，置于濕度飽和、5%二氧化碳、37 ℃的培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞匯合度為80%~90%時(shí)，按比例進(jìn)行細(xì)胞傳代。取生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定的細(xì)胞以每孔2×106個(gè)接種于六孔板中，待細(xì)胞貼壁后PBS洗滌并用含1%青鏈霉素混合液及5%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基換液。將實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、TNF-α誘導(dǎo)組、TNF-α+LPS 干預(yù)組，培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法收集已處理的各組細(xì)胞，提取總蛋白。使用BCA 法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，取等量蛋白以10%SDS-PAGE 進(jìn)行電泳使蛋白分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，將PVDF 膜置于5%脫脂奶粉溶液中封閉1 h，孵育單克隆抗體4 ℃過(guò)夜，等滲緩沖鹽溶液（TBST）洗滌后孵育二抗1 h，TBST 再次洗滌，ECL 顯色后凝膠成像設(shè)備采集圖像。

1.2.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)胰酶消化收集24 h 細(xì)胞，使用PBS 制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)，參照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS 對(duì)Eca-109 細(xì)胞中不同時(shí)間點(diǎn)p-Jak2、p-Stat3、PD-L1 蛋白表達(dá)量的影響使用濃度為100μg/L 的LPS 對(duì)Eca-109 細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，并在干預(yù)15 min 后加入濃度為20 μg/L 的TNF-α 誘導(dǎo)1.5、3、6、12、24 h，收集細(xì)胞提取蛋白，應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p-Jak2、p-Stat3、PD-L1 蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比，經(jīng)TNF-α 誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)p-Jak2、p-Stat3、PD-L1蛋白表達(dá)量在24 h明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示TNF-α 在誘導(dǎo)PDL1 表達(dá)升高的同時(shí)激活了Jak2/Stat3 信號(hào)通路。與TNF-α 誘導(dǎo)組相比，TNF-α+LPS 干預(yù)組的p-Jak2、p-Stat3、PD-L1蛋白表達(dá)量在24 h降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明LPS 能通過(guò)干預(yù)Jak2/Stat3 信號(hào)通路下調(diào)PD-L1的蛋白表達(dá)，如表1，圖1所示。

圖1 脂多糖（LPS）干預(yù)后腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞p-Jak2、p-Stat3、序性細(xì)胞死亡配體1（PD-L1）蛋白表達(dá)水平變化

表1 LPS干預(yù)后TNF-α誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞p-Jak2、p-Stat3、PD-L1蛋白表達(dá)水平變化/

表1 LPS干預(yù)后TNF-α誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞p-Jak2、p-Stat3、PD-L1蛋白表達(dá)水平變化/

注：TNF-α 為腫瘤壞死因子α，LPS 為脂多糖，PD-L1為程序性細(xì)胞死亡配體1。①與對(duì)照組相比，均P<0.05。②與TNF-α組相比，均P<0.05。

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2.2 不同濃度LPS 干預(yù)對(duì)Eca-109 細(xì)胞中p-Jak2、p-Stat3、PD-L1 蛋白表達(dá)量的影響使用濃度為100、200、400、800 μg/L 的LPS 對(duì)Eca-109 細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，并在干預(yù)15 min 后加入濃度為20 μg/L 的TNF-α 誘導(dǎo)24 h，收集細(xì)胞提取蛋白進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)后PD-L1蛋白表達(dá)量明顯升高，同時(shí)p-Jak2、p-Stat3的表達(dá)量也升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示在食管鱗癌Eca-109 細(xì)胞中Jak2/Stat3 信號(hào)通路是TNF-α 誘導(dǎo)PD-L1 升高的主要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路。與TNF-α誘導(dǎo)組相比，使用濃度為100、200、400、800 μg/L 的LPS 經(jīng)TNF-α 誘導(dǎo)后進(jìn)行干預(yù)，細(xì)胞內(nèi)p-Jak2、p-Stat3、PD-L1的蛋白表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且呈濃度依賴性。如表2，圖2所示。

圖2 不同濃度脂多糖（LPS）干預(yù)后腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞p-Jak2、p-Stat3、序性細(xì)胞死亡配體1（PD-L1）蛋白表達(dá)水平變化

表2 不同濃度LPS干預(yù)后TNF-α誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞p-Jak2、p-Stat3、PD-L1蛋白表達(dá)水平變化/

表2 不同濃度LPS干預(yù)后TNF-α誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞p-Jak2、p-Stat3、PD-L1蛋白表達(dá)水平變化/

注：TNF-α 為腫瘤壞死因子α，LPS 為脂多糖，PD-L1為程序性細(xì)胞死亡配體1。①與對(duì)照組相比，均P<0.05。②與TNF-α組相比，均P<0.05。

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2.3 LPS干預(yù)后對(duì)Eca-109細(xì)胞凋亡的影響使用濃度為100 μg/L的LPS對(duì)Eca-109細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，并在干預(yù)15 min 后加入濃度為20 μg/L 的TNF-α 誘導(dǎo)24 h，收集細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組（4.77±0.15）%相比，LPS 干預(yù)組（8.20±1.65）%細(xì)胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），TNF-α+LPS 干預(yù)組（7.63±1.37）%較對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率也相應(yīng)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

食管癌是我國(guó)最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，由于早期癥狀不明顯，一般發(fā)現(xiàn)時(shí)到了中晚期，有效治療手段較少，預(yù)后差，故病死率高［11］。因此，尋找新的治療方法來(lái)提高食管癌病人的生存率尤為重要，免疫治療的問(wèn)世，提供了研究思路。

免疫逃逸是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素，PD-L1在多種惡性腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)是常見(jiàn)的免疫逃逸策略，并提示腫瘤治療的預(yù)后不良［12］。本研究采用TNF-α 誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞24 h，成功建立PD-L1高表達(dá)模型，評(píng)價(jià)LPS 對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)PD-L1 表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LPS 干預(yù)能夠顯著降低PD-L1 的蛋白表達(dá)，降低p-Jak2、p-Stat3 的蛋白表達(dá)水平，同時(shí)能促進(jìn)Eca-109 細(xì)胞的凋亡，提示LPS 可能通過(guò)Jak2/Stat3 信號(hào)通路下調(diào)PD-L1 的表達(dá)，由此調(diào)節(jié)腫瘤的免疫逃逸。

近年來(lái)，針對(duì)靶向PD-1/PD-L1 的免疫檢查點(diǎn)抑制劑對(duì)食管癌顯示出較好的療效，部分藥物如納武單抗（nivolumab）已被美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）指南納入晚期ESCC 二線治療的標(biāo)準(zhǔn)選擇之一，卡瑞利珠單抗被2020 年中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（CSCO）指南納入晚期食管癌二線治療的Ⅰ級(jí)專家推薦［13-14］。目前，雖然PD-1/PD-L1 抑制劑在多項(xiàng)臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出較好的療效且有部分藥物已上市，但其臨床應(yīng)用仍存在相應(yīng)的局限性，探究其具體作用機(jī)制仍需要大量的科研工作。據(jù)相關(guān)報(bào)道［15］，實(shí)體瘤可以通過(guò)促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中的TNF-α 誘導(dǎo)PDL1 的蛋白表達(dá)升高，從而抑制機(jī)體的正常免疫應(yīng)答，導(dǎo)致免疫逃逸。研究［16］發(fā)現(xiàn)，TNF-α能誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞系和人前列腺癌LNCaP 細(xì)胞系中PD-L1 mRNA 的表達(dá)。另外Donia 等［17］研究發(fā)現(xiàn)TNF-α 能促進(jìn)PD-L1 在黑色素瘤細(xì)胞中高表達(dá)，從而導(dǎo)致免疫逃逸。本研究采用TNF-α 刺激Eca-109細(xì)胞，PD-L1蛋白表達(dá)增加，說(shuō)明模型建立成功。文獻(xiàn)研究［18］報(bào)道，TNF-α 能誘導(dǎo)并激活腦周細(xì)胞中Jak2/Stat3 信號(hào)通路從而導(dǎo)致腦部炎癥。另有研究［19］報(bào)道，TNF-α 在腸上皮Caco-2 細(xì)胞中的表達(dá)與釋放可能通過(guò)激活Jak2/Stat3 信號(hào)通路導(dǎo)致炎癥性腸病。Jak2/Stat3 信號(hào)通路的持續(xù)激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，活化后的Jak2/Stat3信號(hào)通路能調(diào)控下游基因PD-L1 的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，抑制其凋亡，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展［20］。本研究結(jié)果顯示，Eca-109細(xì)胞經(jīng)TNF-α刺激后高表達(dá)PD-L1，同時(shí)p-Jak2、p-Stat3 的蛋白表達(dá)水平升高，激活Jak2/Stat3 信號(hào)通路，說(shuō)明在食管鱗癌Eca-109 細(xì)胞中Jak2/Stat3 信號(hào)通路是TNF-α 誘導(dǎo)PD-L1高表達(dá)的主要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，加入LPS 干預(yù)后，p-Jak2、p-Stat3、PD-L1 的表達(dá)水平下降，說(shuō)明LPS 能抑制Jak2/Stat3 信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，下調(diào)PD-L1的表達(dá)，從而抑制食管鱗癌Eca-109 細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。提示LPS 可能通過(guò)阻斷Jak2/Stat3 信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

綜上所述，LPS 可能通過(guò)Jak2/Stat3 信號(hào)通路降低PD-L1的表達(dá)，從而誘導(dǎo)食管鱗癌Eca-109細(xì)胞的凋亡來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用，本研究為食管癌的靶向治療提供了新思路。