胡毅翔，左清平，劉任祝，閆慶梓，邢琪昌，劉湘

作者單位：1湘潭市中心醫(yī)院臨床藥學(xué)科，湖南 湘潭 411000；

2長沙市第一醫(yī)院藥劑科，湖南 長沙 410006

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是指肝臟遭到各種致病原侵襲，引起肝臟損害與炎癥反應(yīng)后，導(dǎo)致過度的細(xì)胞外基質(zhì)釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化以及肝臟組織纖維化的病理過程［1-2］。目前臨床尚缺乏治療肝纖維化的有效手段，導(dǎo)致部分病人進(jìn)展為肝硬化，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量［3］。MicroR?NAs （miRNAs）是一類高度保守且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的內(nèi)源性非編碼RNA，多項(xiàng)研究表明miRNA與多種類型的肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)［4］。微小RNA-223-3p（miR-223-3p）具有多種生物學(xué)功能，可抑制肝纖維化的發(fā)生及進(jìn)展［5］。NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域3（NLRP3）炎性體是NOD 樣受體（NLRs）家族成員之一，同時(shí)也細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵起始位點(diǎn)，對(duì)于肝纖維化的進(jìn)展起促進(jìn)作用［6］?；罨腘LRP3炎癥小體可將胱天氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（Caspase-1）剪切成熟，進(jìn)而促進(jìn)反向效應(yīng)分子裂解細(xì)胞膜，釋放成熟形式的白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和IL-18，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生炎癥，而IL-1β 作為早期的炎性細(xì)胞因子在炎癥的發(fā)展過程中起重要作用［7］。本研究自2020 年10 月至2021 年6 月以質(zhì)量濃度為40%四氯化碳（CCl4）腹腔注射誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型，以NLRP3/Caspase-1/IL-1β 信號(hào)通路為切入點(diǎn)，探究miR-223-3p對(duì)小鼠肝纖維化的影響與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組本實(shí)驗(yàn)共計(jì)32只ICR小鼠，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［許可證號(hào)SCXK（湘）2020-0006］，體質(zhì)量范圍為18~20 g，所有小鼠均在同一實(shí)驗(yàn)室按照清潔級(jí)小鼠要求由專人飼養(yǎng)，保持室內(nèi)溫度為20~24 ℃，相對(duì)濕度50%，小鼠自由進(jìn)食攝水，將32 只ICR 小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、miR-223-3p 模擬物（miR-223-3p agomir）組和陰性對(duì)照miRNA 模擬物（agomir-NC）組，每組8 只。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則，經(jīng)湘潭市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)2020-KY-25）。

1.2 試劑和儀器四氯化碳購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（批號(hào)20200106），血清總膽紅素（TBIL）、白蛋白（Alb）、血清透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ?C）購自南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為101547、105647、106784、106541、105861；NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白抗體購自美國Santa Cruz 公司，批號(hào)分別為S5201RTA、S5410RES、S2144RYU；PCR 引物、miR-223-3p agomir 模擬物（批號(hào)20201201）及陰性對(duì)照agomir-NC 和陰性對(duì)照（批號(hào)20201202）購自廣州瑞博生物科技有限公司。

全自動(dòng)酶標(biāo)儀（型號(hào)WD-2102B，北京六一儀器有限公司），病理圖像分析儀（型號(hào)OLYMPUSDP71，奧林巴斯中國有限公司），熒光定量PCR 儀（型號(hào)：IQ5，美國Bio-Rad 公司）凝膠成像儀（型號(hào)：Gel Doc EZ，美國Bio-Rad 公司），DLAB 高速微量離心機(jī)（型號(hào)：D1524R，北京大龍儀器有限公司）。

1.3 肝纖維化小鼠模型制備和給藥將ICR 小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、miR-223-3p agomir 組和NC antagomir 組，每組8 只，共32 只。建立小鼠肝纖維化模型，建模步驟：采用質(zhì)量濃度為40% CCl4花生油溶液腹腔注射，2 mL/kg，每周3 次，連續(xù)4 周。miR-223-3p agomir 組和agomir-NC 組于第4 周末尾靜脈注射miR-223-3p agomir及agomir-NC（給藥劑量均為200 nmol/L），每周給藥3 次，連續(xù)給藥2 周，空白組和模型組尾靜脈注射等量的生理鹽水。

1.4 血清指標(biāo)檢測第6周末，各組小鼠禁食12 h，采用摘眼球取血法取血1 mL，于25 ℃靜置0.5 h 后于3 600 r/min 離心10 min，分離血清收集上清液，將上清液裝置干凈的EP 管中進(jìn)行分裝，置于?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩０凑丈噭┖胁僮鞑襟E測定小鼠血清總膽紅素（TBIL）、白蛋白（Alb）、血清透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型前膠原（PC Ⅲ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）含量。

1.5 HE染色及Masson染色小鼠處死后，將肝臟周圍的韌帶組織游離，把肝臟小心取出，在肝乳頭葉處用剪刀剪下一塊2 cm3的肝組織，甲醛固定后制作石蠟切片。依據(jù)HE 染色及Masson 染色試劑盒說明書處理組織，脫水封片后于顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，觀察各組小鼠肝組織病理變化。

1.6 纖維化半定量評(píng)分用半定量計(jì)分系統(tǒng)（SSS）檢測肝臟的纖維化程度，用膠原纖維面積密度對(duì)肝纖維程度進(jìn)行分析［7］。（1）炎癥活動(dòng)度半定量計(jì)分公式為匯管區(qū)炎癥（0~3 分）+小葉內(nèi)炎癥（0~3 分）+碎屑?jí)乃溃?~2分）+橋接壞死（0~2分）；（2）纖維化半定量計(jì)分公式為小葉內(nèi)炎癥（0~3分）+匯管區(qū)炎癥（0~3分）+纖維間隔數(shù)量×纖維間隔寬度（0~4分）；（3）膠原纖維面積密度：用圖像成像分析軟件對(duì)每張切片的5個(gè)視野中的纖維面積密度進(jìn)行測定。

1.7 miR-223-3p靶基因預(yù)測、GO-KEGG分析采用Targetscan 數(shù)據(jù)庫（https：//www.mirbase.org）對(duì)miR-223-3p 的靶基因進(jìn)行預(yù)測及分析，通過Bioinfo數(shù)據(jù)庫（http：//bioinfo. jialab-ucr. org/CancerMIR?Nome/），將miR-223-3p 的治療靶點(diǎn)導(dǎo)入，進(jìn)行 GO、KEGG 富集分析及功能分析，獲取miR-223-3p 相關(guān)生物進(jìn)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）及KEGG富集分析數(shù)據(jù)，評(píng)價(jià)其生物學(xué)功能。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測分別取各組左葉的相同部位組織，超聲粉碎，將組織用胰蛋白酶消化后加入總RNA 抽提試劑（Trizol）裂解提取總RNA，測定濃度及純度，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，引物序列如表1所示。cDNA 合成過程中采用特異性引物構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄體系，反應(yīng)條件為：90 ℃預(yù)變性10 min，38 ℃40 min，90 ℃ 5 s。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAP?DH）為內(nèi)參，采用2?ΔΔCt法對(duì)NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 引物序列表

1.9 蛋白質(zhì)印跡法檢測肝組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白表達(dá)分別取4 組小鼠50 mg 肝組織，蛋白裂解液裂解，用玻璃均漿器在冰上對(duì)組織進(jìn)行研磨，30 min 后以12 000 r/min 的速度離心5 min，測定蛋白濃度，每個(gè)加樣孔加入60 μg 的蛋白進(jìn)行分析。電泳2 h 后，采用濕法轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），將膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃孵育一抗（Santa Cruz；1∶1 000 稀釋）過夜，次晨采用TBST漂洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（Santa Cruz；1∶3 000 稀釋），37 ℃孵育1 h，凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，以GAPDH 為內(nèi)參，采用Quantity One 軟件測光密度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以表示，多組定量數(shù)據(jù)采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)分析，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝纖維化相關(guān)血清標(biāo)志物檢測與空白組相比，肝纖維化模型組小鼠血清TBIL、Alb、HA、PCⅢ、Ⅳ-C 表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），與模型組相比，miR-223-3p agomir 組小鼠血清TBIL、Alb、HA、PCⅢ、Ⅳ-C 均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示miR-223-3p agomir 可降低小鼠血清肝纖維化指標(biāo)TBIL、Alb、HA、PCⅢ、Ⅳ-C 的表達(dá)水平。見表2。

表2 AF對(duì)肝纖維化小鼠血清生化指標(biāo)的影響/

表2 AF對(duì)肝纖維化小鼠血清生化指標(biāo)的影響/

注：TBIL為血清總膽紅素、Alb為白蛋白、HA為血清透明質(zhì)酸、PCⅢ為Ⅲ型前膠原、Ⅳ-C為Ⅳ型膠原。①與空白組比較，P<0.001。②與模型組比較，P<0.001。

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2.2 各組小鼠肝組織HE 染色比較HE 染色結(jié)果如圖1所示，相較于空白組，模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)受損，組織切片中有大量假小葉形成，壞死病灶面積較大，大量的炎性細(xì)胞浸潤到肝組織中，細(xì)胞排列較亂無規(guī)則。給予miR-223-3p agomir 干預(yù)后，小鼠肝小葉炎癥浸潤情況明顯改善，肝組織內(nèi)浸潤的炎性細(xì)胞明顯減少，壞死病灶也顯著減少，大多數(shù)的肝細(xì)胞都整齊排列，肝小葉結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，說明miR-223-3p agomir 能明顯抑制肝纖維化的進(jìn)展，減少炎癥細(xì)胞浸潤。

圖1 小鼠肝組織（HE染色×100）：A為空白組；B為模型組；C為miR-223-3p agomir組；D為agomir-NC組

2.3 各組小鼠肝組織Masson染色比較Masson染色結(jié)果如圖2所示，相較于空白組，模型組大量炎性細(xì)胞浸潤導(dǎo)致小鼠肝小葉正常結(jié)構(gòu)受損，大量膠原及細(xì)胞外基質(zhì)沉積導(dǎo)致肝細(xì)胞纖維化，膠原纖維增生嚴(yán)重。給予miR-223-3p agomir 干預(yù)后，相較于模型組，小鼠肝臟組織纖維化狀態(tài)顯著改善，肝小葉膠原及細(xì)胞外基質(zhì)明顯減少，局灶性壞死組織顯著減少，從而抑制肝纖維化的形成與進(jìn)展。

圖2 小鼠肝組織（Masson三色染色×100）：A為空白組；B為模型組；C為miR-223-3p agomir組；D為agomir-NC組

2.4 各組小鼠纖維化半定量評(píng)分比較纖維化半定量評(píng)分比較，模型組小鼠炎癥活動(dòng)度半定量評(píng)分、纖維化半定量評(píng)分和膠原纖維面積密度較sham組均顯著升高（P<0.05）；干預(yù)后的miR-223-3p agomir 組小鼠炎癥活動(dòng)度半定量評(píng)分、纖維化半定量評(píng)分和膠原纖維面積密度均得到了明顯的抑制，較HF組顯著降低（P<0.05）。見表3。

表3 各組小鼠肝組織纖維化半定量評(píng)分比較/

表3 各組小鼠肝組織纖維化半定量評(píng)分比較/

注：①與空白組比較，P<0.001。②與模型組比較，P<0.001。

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2.5 miR-223-3p 靶基因結(jié)合位點(diǎn)及GO-KEGG 分析通過DAVID 數(shù)據(jù)庫，獲取miR-223-3p的治療靶點(diǎn)及相關(guān)生物學(xué)過程分析結(jié)果。GO、KEGG 富集及miRNA-mRNA-KEGG 關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，miR-223-3p 可在炎癥、T 細(xì)胞免疫、細(xì)胞周期等的59 個(gè)生命進(jìn)程中發(fā)揮作用。KEGG 結(jié)果中治療靶點(diǎn)共富集FOXO 信號(hào)通路、p53 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路等12 條信號(hào)通路，根據(jù)P 值選出前30 位KEGG 的全部結(jié)果，對(duì)選定的GO、KEGG 結(jié)果中P值取?lgP，并作為橫坐標(biāo)，繪制GO、KEGG 條形圖。Targetscan 數(shù)據(jù)庫對(duì)miR-223-3p 靶基因預(yù)測結(jié)果顯示NLRP3 可能為miR-223-3p 的反向靶基因（圖3）。生物學(xué)靶點(diǎn)預(yù)測分析結(jié)果顯示miR-223-3p 可靶向作用于NLRP3，結(jié)合位點(diǎn)如圖4所示。

圖3 富集分析圖：A為GO生物學(xué)功能；B為KEGG通路

圖4 miR-223-3p與靶基因NLRP3結(jié)合位點(diǎn)分析

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測結(jié)果與空白組比較，模型組小鼠肝組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA 表達(dá)水平明顯上升（P<0.05），與模型組相比，給予miR-223-3p agomir 干預(yù)后，miR-223-3p agomir組小鼠肝組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA 表達(dá)［（1.24±0.12）比（2.17±0.14）、（1.44±0.11）比（2.65±0.18）、（1.31±0.13）比（1.97±0.21）］均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而給予agomir-NC后，NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達(dá)與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表4。

表4 q-PCR法檢測NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果如圖5、表5所示，與模型組比較，給予miR-223-3p agomir干預(yù)后，小鼠肝組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白表達(dá)［（0.89±0.05）比（1.93±0.04）、（1.29±0.07）比（2.15±0.09）、（1.50±0.05）比（2.52±0.12）］均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而給予agomir-NC 后，NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA 表達(dá)與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明miR-223-3p agomir 可抑制小鼠肝組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達(dá)。

圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)情況

表5 q-PCR法檢測NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討論

炎癥被認(rèn)為是宿主對(duì)抗病原體的一種防御機(jī)制，在相關(guān)刺激下可產(chǎn)生炎癥因子激活固有免疫。炎癥小體是細(xì)胞內(nèi)的一種大型多蛋白復(fù)合物，在識(shí)別病原體或危險(xiǎn)信號(hào)后可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的起始，導(dǎo)致細(xì)胞膜裂解，釋放多種炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生及進(jìn)展［8-9］。NLRP3 炎癥小體主要由NOD樣受體NLRP3，銜接分子凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白CARD（ASC）以及效應(yīng)分子pro-caspase-1 組成［10］。在細(xì)胞內(nèi)外刺激下，NLRP3 炎癥小體被激活并剪切pro-caspase-1，誘導(dǎo)效應(yīng)分子在細(xì)胞膜上形成直徑為10~15 nm 的膜孔，進(jìn)而導(dǎo)致IL-1β和IL-18釋放到細(xì)胞外從而促進(jìn)細(xì)胞焦亡的發(fā)生［11］。

肝纖維化早期階段以多種炎性細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞因子浸潤為特征［12］。這一病理過程主要包括3個(gè)階段：①愈合階段，②炎癥階段，③重塑階段。這一炎癥過程主要由上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)，并觸發(fā)炎癥細(xì)胞（包括巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞）的募集。NLRP3炎癥小體表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、肝臟細(xì)胞等細(xì)胞中，NLRP3/Caspase-1/IL-1β 通路激活后可導(dǎo)致炎癥細(xì)胞募集，通過分泌大量的炎癥細(xì)胞因子加速肝細(xì)胞的炎癥性死亡，進(jìn)而導(dǎo)致肝纖維化的進(jìn)展［13］。由于NLRP3 炎癥小體在細(xì)胞焦亡中的重要調(diào)控作用，抑制其活化可能為肝纖維化提供潛在的治療策略。MCC950是一種阻斷NLRP3炎癥小體活化的特異性小分子抑制劑。機(jī)制上，MCC950 直接與NLRP3 的NACHT 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）水解，阻止NLRP3 炎癥小體形成，阻斷經(jīng)典和非經(jīng)典的性NLRP3活化通路［14-15］。研究顯示，miRNA 具有多種生物學(xué)功效，以NLRP3 炎性小體為靶點(diǎn)的miRNA 治療策略是目前肝纖維化治療研究的重點(diǎn)方向［16-17］。

miR-223-3p 由于其廣泛的生物學(xué)作用已成為目前研究者重點(diǎn)關(guān)注的miRNAs 分子。研究表明，miR-223-3p 作為抑癌因子在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中異常低表達(dá)，并調(diào)控細(xì)胞增殖，同時(shí)可發(fā)揮抗炎作用［18］。Ji等［19］的研究發(fā)現(xiàn)，人環(huán)狀RNA-0070963（Hsa_circ_0070963）可通過調(diào)控miR-223-3p 的表達(dá)抑制肝星狀細(xì)胞活化及IL-1β、IL-1β等炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制肝纖維化的發(fā)生及進(jìn)展。另有研究表明，miR-223-3p 可抑制肝細(xì)胞炎癥性損傷，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的沉積［20］。與普通miRNA 模擬物（mimics）相比，miRNA 體內(nèi)模擬物（agomir）與細(xì)胞膜親和力更高，特別適合動(dòng)物體內(nèi)干擾實(shí)驗(yàn)，并且在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中具有更高的穩(wěn)定性和抑制效果，可以采用全身注射或局部注射等多種方式給藥［21］。本項(xiàng)目通過建立小鼠肝纖維化模型，采用靜脈注射的方式給予生物模擬物miR-223-3p agomir，探討miR-223-3p agomir對(duì)肝纖維化小鼠的治療作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-223-3p agomir 可顯著抑制四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝損傷，降低TBIL、Alb、HA、PC Ⅲ、Ⅳ-C 的表達(dá)水平，此外，miR-223-3p agomir 可有效抑制肝纖維化小鼠的炎癥狀態(tài)。HE染色和masson 染色結(jié)果顯示，模型組大量炎性細(xì)胞浸潤導(dǎo)致小鼠肝小葉正常結(jié)構(gòu)受損，大量膠原及細(xì)胞外基質(zhì)沉積導(dǎo)致肝細(xì)胞纖維化，膠原纖維增生嚴(yán)重，細(xì)胞排列較亂無規(guī)則，給予miR-223-3p agomir干預(yù)后，肝臟組織纖維化狀態(tài)顯著改善，肝小葉膠原及細(xì)胞外基質(zhì)明顯減少，局灶性壞死組織顯著減少，表明miR-223-3p agomir 可顯著改善肝纖維化組織炎癥細(xì)胞浸潤，降低肝纖維化組織評(píng)分，抑制肝纖維化的進(jìn)展。此外，miR-223-3p agomir 尾靜脈注射可降低小鼠肝組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白表達(dá)水平，表明 miR-223-3p agomir 可抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡通路的激活。綜上所述，過表達(dá)miR-223-3p 可抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信號(hào)通路的激活，降低機(jī)體炎癥損傷，改善小鼠肝組織損傷，進(jìn)而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

（本文圖1~3見插圖8-6）