陳根光，楊麗娜，周承芳，王慶芬

作者單位：聯(lián)勤保障部隊第九〇九醫(yī)院、廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院藥劑科，福建 漳州 363000

止血化痔合劑由黃芩、地榆炭、炙黃芪、郁李仁、槐花炭、升麻、甘草、黃柏、赤芍等9 味中藥配制而成，具有清熱燥濕、益氣養(yǎng)血、涼血止血和消腫的功效［1］，對痔瘡的治療有積極的作用，其中黃酮類成分為其主要活性成分［2］。近年來，對中藥處方中主要成分進行定量分析被認(rèn)為是對中藥進行質(zhì)量控制的有效方法，但該方法必須提供待測目標(biāo)物的高純度標(biāo)準(zhǔn)品，而一測多評法（QAMS）只須提供一種標(biāo)準(zhǔn)品就可以同時檢測多種成分的含量，能有效減少分析時間，節(jié)省對照品用量，降低檢測成本。由于止血化痔合劑成分復(fù)雜、活性成分種類較多，因此，僅靠對單一成分的定量測定無法完全反映中藥復(fù)方制劑多成分、多靶點、協(xié)同起效等特點，難以實現(xiàn)對該制劑的質(zhì)量控制，故本實驗自2022 年2―5月采用一測多評法，以黃芩苷為內(nèi)參物，通過對止血化痔合劑中黃酮類成分進行含量測定，為止血化痔合劑的質(zhì)量評價提供更全面、多指標(biāo)的質(zhì)量控制依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀［二極管陣列檢測器（DAD），美國Agilent 公司］； AUW120D 型電子分析天平（精度：0.01 mg，島津企業(yè)管理（中國）有限公司）；水為純化水，磷酸、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純。

對照品蘆丁（批號GZDD-0001，純度≥98%），甘草苷（批號GZDD-0388，純度≥98%），黃芩苷（批號GZDD-0037，純度≥98%），槲皮素（批號GZDD-0002，純度≥98%），黃芩素（批號GZDD-0118，純度≥98%），漢黃芩素（批號GZDD-0714，純度≥98%），均購自貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司。止血化痔合劑由本院藥劑科制劑室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 一測多評方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.2%磷酸溶液，梯度洗脫：0～10 min，0%～19%乙腈；10～20 min，19%～23% 乙腈；20～25 min，23%～30% 乙腈；25～30 min，30%～48%乙腈；30～40 min，48%～80%乙腈；流速：1.0 mL/min；檢測波長：275 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。在上述色譜條件下，各成分色譜峰分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于5 000。混合對照品、樣品色譜圖見圖1。

2.1.2 混合對照品溶液的制備分別取蘆丁、甘草苷、黃芩苷、槲皮素、黃芩素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為320.3、64.80、155.7、65.55、180.9、5.00 mg/L的混合對照品儲備液。

2.1.3 供試品溶液的制備精密量取相應(yīng)批號的止血化痔合劑2 mL，置25 mL 量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.4 線性關(guān)系考察分別精密吸取混合對照品溶液3、6、8、10、12、15 μL，注入高效液相色譜儀。以對照品進樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X），以對照品的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各成分的線性回歸方程，見表1。

表1 混合對照品溶液中6種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.1.5 精密度試驗取混合對照品溶液，連續(xù)進樣6 針，計算峰面積。含蘆丁、甘草苷、黃芩苷、槲皮素、黃芩素、漢黃芩素峰面積的RSD 分別為1.0%、1.0%、0.8%、1.2%、2.0%、0.9%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗取止血化痔合劑（批號20211215），按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、24 h 進行測定，計算峰面積。含蘆丁、甘草苷、黃芩苷、槲皮素、黃芩素、漢黃芩素峰面積的RSD 分別為2.9%、1.0%、0.4%、1.5%、3.0%、1.5%。

2.1.7 重復(fù)性試驗取止血化痔合劑（批號20211215），按“2.1.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，分別進樣分析，記錄6 種成分的色譜峰面積。含蘆丁、甘草苷、黃芩苷、槲皮素、黃芩素、漢黃芩素峰面積的RSD 分別為3.1%、2.7%、0.5%、2.2%、2.9%、1.0%。

2.1.8 加樣回收率試驗精密量取6份已知含量的止血化痔合劑（批號20211215），每份1 mL，置25 mL量瓶中，再分別精密量取并加入對照品溶液適量，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10μL，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，含蘆丁、甘草苷、黃芩苷、槲皮素、黃芩素、漢黃芩素的平均加樣回收率分別為99.07%、96.86%、100.43%、95.72%、96.38%、98.93%，RSD 分別為2.7%、2.8%、2.0%、2.5%、3.2%、2.4%。

2.2 相對校正因子（f）的確定依次精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液3、6、8、10、12、15 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積。以黃芩苷（s）為內(nèi)參物，按下列公式分別計算含蘆丁（a）、甘草苷（b）、槲皮素（c）、黃芩素（d）、漢黃芩素（e）的f值。

式中As為內(nèi)參物對照品s峰面積，Cs為內(nèi)參物對照品s濃度，Ai為某待測成分對照品i峰面積，Ci為某待測成分對照品i濃度，結(jié)果見表2。

表2 相對校正因子（f）計算結(jié)果

2.3 相對校正因子的耐用性和系統(tǒng)適用性評價

2.3.1 流速對相對校正因子的影響采用Agilent 1200 高效液相色譜系統(tǒng)和Agilent C18柱，分別考察流速為1.10、1.05、1.00、0.95、0.90、0.80 mL/min 時黃芩苷對其他成分的相對校正因子，結(jié)果各成分相對校正因子在不同的流速下重復(fù)性良好，結(jié)果見表3。

表3 不同流速對相對校正因子（f）的影響

2.3.2 柱溫對相對校正因子的影響采用Agilent 1200 高效液相色譜系統(tǒng)和Agilent C18柱，分別考察柱溫為18、20、25、30、35、40 ℃時黃芩苷對其他成分的相對校正因子，結(jié)果各成分相對校正因子在不同的柱溫下重復(fù)性良好，結(jié)果見表4。

表4 不同柱溫對相對校正因子（f）的影響

2.3.3 不同色譜柱對相對校正因子的影響分別考察依利特Kromasil C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）和Agilent ZORBAXSB-C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）色譜柱測定時，黃芩苷對其他成分的相對校正因子，結(jié)果見表5。

表5 不同色譜柱對相對校正因子（f）的影響

2.4 待測組分色譜峰的定位分別考察保留時間（t）、相對保留時間（r）和相對保留時間差（Δt）在兩種不同色譜柱條件下的穩(wěn)定性。實驗研究發(fā)現(xiàn)采用保留時間時，蘆丁、甘草苷、黃芩苷、槲皮素、黃芩素、漢黃芩素的RSD 值依次為4.0%、5.5%、4.0%、2.2%、1.4%、0.8%；采用相對保留時間時，以黃芩苷為內(nèi)參物，蘆丁、甘草苷、槲皮素、黃芩素、漢黃芩素的RSD 值依次為0.1%、1.5%、1.7%、2.5%、3.2%；采用相對保留時間差時，以黃芩苷為內(nèi)參物，蘆丁、甘草苷、槲皮素、黃芩素、漢黃芩素的RSD 值依次為3.9%、2.5%、4.3%、2.3%、2.9%。結(jié)果表明采用相對保留時間法RSD 均小于或接近于3.0%，對色譜峰定位較為穩(wěn)定，因此對待測組分進行定位時宜選擇相對保留時間法。

根據(jù)以上考察結(jié)果，最終確定蘆丁、甘草苷、槲皮素、黃芩素、漢黃芩素的相對校正因子分別為6.426、3.939、3.215、41.140、0.555。

2.5 樣品測定取11 批樣品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，分別采用一測多評法和外標(biāo)法（ESM）計算樣品中6 種黃酮類成分的含量，結(jié)果見表6。經(jīng)成組t檢驗，表明通過兩種方法的測定結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表6 樣品測定結(jié)果/（mg/g）

3 討論

3.1 一測多評法的優(yōu)勢分析QAMS 技術(shù)由王智民等［2］于2006 年提出，通過將性質(zhì)穩(wěn)定，價廉易得的化學(xué)組分作為內(nèi)參物，利用各組分之間的函數(shù)關(guān)系，實現(xiàn)對多個成分含量的同時測定，能從整體上對中藥、飲片及復(fù)方制劑的質(zhì)量進行控制，具有經(jīng)濟、高效、簡單的優(yōu)勢［3-8］。隨著分析儀器的迭代升級，目前通過QAMS技術(shù)與HPLC、HPLC-MS、UPLC、GC- MS等儀器聯(lián)用，使得該技術(shù)被廣泛應(yīng)用在中藥材及其制劑質(zhì)量的評價，炮制工藝和炮制產(chǎn)品質(zhì)量的評價、原料中農(nóng)藥殘留的測定和多成分定量分析等多個方面［9-10］。

3.2 制劑質(zhì)控指標(biāo)的確定止血化痔合劑中的黃酮類成分，包括有蘆丁、槲皮素、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、毛蕊異黃酮苷、山柰酚、異鼠李素和甘草苷等數(shù)十種，在益氣養(yǎng)血、清熱燥濕、涼血止血消腫等功效中發(fā)揮著重要作用。本實驗所選6種黃酮類成分在供試品溶液中含量較高，且藥理活性與止血化痔合劑的功能主治密切相關(guān)，其中蘆丁和槲皮素是槐花炭的主要活性成分，可涼血止血、清肝瀉火［11］。黃芩可清熱燥濕、瀉火解毒、止血，具有解熱抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用［12］，黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素為其主要黃酮類成分。黃芪中含有槲皮素，與升麻合用，補氣以養(yǎng)血［13］。甘草味甘，性平，可補脾益氣、緩急止痛、清熱解毒、調(diào)和諸藥［14］，甘草苷為其指標(biāo)性成分。因此，將這6 種黃酮類成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)，建立止血化痔合劑多指標(biāo)定量測定方法，可提高該復(fù)方制劑質(zhì)量控制的整體性和特征性。

3.3 色譜條件的考察和內(nèi)參物的選擇本實驗采用DAD 檢測器在波長190～400 nm 范圍內(nèi)掃描混合對照品和供試品溶液，發(fā)現(xiàn)6 種黃酮類成分在275 nm 具有較大吸收，且干擾小，故實驗以275 nm為檢測波長。黃芩苷是黃芩的指標(biāo)性成分，含量較高，其對照品化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且廉價易得，便于長期大量分析實驗中使用，因此實驗選擇黃芩苷為內(nèi)參物進行其他指標(biāo)性成分的一測多評法定量測定。

3.4 相對校正因子差異情況討論本文以黃芩苷為內(nèi)參物，計算供試品中黃芩素和漢黃芩素的相對校正因子，分別為41.140、0.555，兩組數(shù)據(jù)與已報道文獻存在差異，見表7。由于本制劑由9 味中藥材共煎所得，組成較為復(fù)雜，考慮由于煎煮過程中成分間相互作用，造成合劑中黃芩素和漢黃芩素的含量差異。此外通過對比過往文獻，黃芩提取物中黃芩素和漢黃芩素的含量，根據(jù)其處方組成和制劑類型的不同，計算所得的相對校正因子也存在差異。后續(xù)計劃對黃芩單味藥材在相同工藝下進行提取，考察所得藥液中黃芩素和漢黃芩素的含量。

表7 不同參考文獻中黃芩素和漢黃芩素的相對校正因子

研究結(jié)果表明，本實驗所建立的6 種黃酮類成分含量測定的QAMS 方法，其計算結(jié)果與ESM 測定值相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但操作簡便，結(jié)果重現(xiàn)性和可信度較好，可用于止血化痔合劑的含量測定，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善及質(zhì)量評價提供參考。