張歡，尹德錄，路翔宇，蘇炳新

作者單位：連云港市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，江蘇 連云港 222000

益心舒膠囊由人參、麥冬、五味子、黃芪、丹參、川芎、山楂7 味中藥組成，其中人參細(xì)粉入藥，五味子、丹參85%乙醇提取入藥，麥冬等4 味水煎煮入藥；具有益氣復(fù)脈，活血化瘀，養(yǎng)陰生津的功效，主要用于氣陰兩虛，瘀血阻脈所致的胸痹，癥見胸痛胸悶、心悸氣短、脈結(jié)代；冠心病心絞痛見上述證候者［1］。臨床研究表明，益心舒膠囊單獨(dú)用藥或聯(lián)合用藥對(duì)持續(xù)性心房顫動(dòng)、心力衰竭、心絞痛等癥均有效［2-5］。益心舒膠囊現(xiàn)收錄于2020 年版《中國藥典》（一部），作為非處方藥品，在心血管疾病中應(yīng)用廣泛。但是其相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)研究薄弱，藥物組成復(fù)雜，藥效成分不清，進(jìn)而影響了其有效的質(zhì)量控制和更加廣泛的臨床應(yīng)用。

本研究自2021 年9―12 月采用UPLC-Q-TOFMS 技術(shù)對(duì)益心舒膠囊的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)分析與鑒定，為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑益心舒膠囊（貴州信邦制藥股份有限公司，批號(hào)20210109）；人參皂苷Rg1（批號(hào)4318，純度98.0%）、人參皂苷Rb1（批號(hào)2326，純度98.0%）、人參皂苷Rd（批號(hào)3505，純度98.0%）、丹參素鈉（批號(hào)6716，純度98.0%）、丹酚酸B（批號(hào)5853，純度98.0%）、迷迭香酸（批號(hào)2886，純度98.0%）均購自上海詩丹德生物技術(shù)有限公司；丹酚酸 A（批號(hào)O-011-170607，純度98.0%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；人參皂苷Ro（批號(hào)20120805，純度98.0%）購自上海源葉生物科技有限公司；人參皂苷Re（批號(hào)110754-200320，純度96.0%）購自中國食品藥品檢定研究院。

乙腈和甲醇（色譜級(jí)，Thermo Fisher Scientific 公司）、甲酸（色譜級(jí)，阿拉丁試劑優(yōu)有限公司），超純水由純水儀制備（Milli-Q Integral，Millipore，Bedford，USA）。

1.2 儀器Waters ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀（Waters，USA），Waters Synapt G2-Si Q-TOF 質(zhì)譜儀（Waters，USA）；超聲波水?。ǖ聡鳨lma P180H）；電子天平（Quintix 224-1 CN-1，賽多利斯北京有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件色譜柱Waters Acquity HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0~13 min，5%~70% B；13~15 min，70%~95% B；15~17 min，95% B）；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2.0 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源（ESI），正離子和負(fù)離子模式檢測；采集方法：Fast DDA；掃描范圍：m/z50~1 500；采集前三強(qiáng)母離子的二級(jí)碎片；毛細(xì)管噴霧電壓離子：2.0 kV；錐孔電壓：40 V；源溫度：100 ℃；去溶劑氣溫度：450 ℃；去溶劑氣流速：800 L/h，錐孔氣流速：50 L/h；負(fù)離子碰撞能：低質(zhì)量端能量設(shè)置為20~30 V，高質(zhì)量端能量設(shè)置為60~100 V；正離子碰撞能：低質(zhì)量端能量設(shè)置為10~30 V，高質(zhì)量端能量設(shè)置為40~60 V。

1.3.3 溶液制備

1.3.3.1 供試品溶液精密稱取益心舒膠囊粉末20 mg，置于離心管中，加入50%甲醇水溶液1 mL，超聲（功率1 130 W，頻率37 kHz）提取30 min，冷卻至室溫后，離心（14 000 r/min，10 min），取上清，即得。

1.3.3.2 對(duì)照品溶液分別精密稱定對(duì)照品人參皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd、Ro、丹參素鈉、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸各1 mg，分別置于離心管中，加入1 mL 50%甲醇使其溶解，各移取10 μL，再用50%甲醇稀釋，將其制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的混標(biāo)溶液。

1.4 數(shù)據(jù)分析通過文獻(xiàn)檢索，歸納總結(jié)分離自人參、麥冬、五味子、黃芪、丹參、川芎、山楂等7個(gè)益心舒膠囊組成藥味的化學(xué)成分信息，建立化合物庫。數(shù)據(jù)庫中包括各化合物名稱、結(jié)構(gòu)、分子式、分子量等信息，數(shù)據(jù)庫采用Progenesis SDF（Waters，USA）進(jìn)行管理。采用Waters MassLynx V4.1 分析供試品溶液中化合物的保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜、二級(jí)質(zhì)譜等信息，一級(jí)質(zhì)譜中限定質(zhì)量偏差（<5 mDa），根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜推導(dǎo)化合物分子式，分子式輸入Progenesis SDF檢索自建數(shù)據(jù)庫，并與對(duì)照品、文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

2 結(jié)果

在上述實(shí)驗(yàn)條件下采集益心舒膠囊的UPLCQTOF 基峰離子流圖，見圖1。按照“1.3”項(xiàng)下方法，共解析出86 個(gè)化合物，見表1。其中9 種化合物經(jīng)過與對(duì)照品比對(duì)保留時(shí)間及一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行鑒定，其余化合物結(jié)合數(shù)據(jù)庫及參考文獻(xiàn)進(jìn)行鑒定。

圖1 益心舒膠囊正、負(fù)離子模式下基峰離子流圖：A為負(fù)離子模式；B為正離子模式

表1 益心舒膠成分鑒定結(jié)果

2.1 皂苷類化合物皂苷類成分主要來源于人參，益心舒膠囊中共鑒定了35種皂苷類化合物，包括原人參三醇型（PPT）5 個(gè)、原人參二醇型（PPD）12 個(gè)、齊墩果酸型（OA）5 個(gè)、側(cè)鏈雜化型6 個(gè)以及?；?個(gè)。

原人參三醇型與原人參二醇型皂苷負(fù)離子模式下，大多形成甲酸加合離子，二級(jí)裂解時(shí)通常優(yōu)先丟失糖配基，并獲得苷元離子信息，其中原人參三醇型皂苷苷元離子為m/z475.38，原人參二醇型皂苷苷元離子為m/z459.38。中性丟失162.05 Da，146.06 Da 和132.04 Da 分別對(duì)應(yīng)葡萄糖、鼠李糖和木糖/阿拉伯糖。以人參皂苷Re（化合物11）為例，一級(jí)質(zhì)譜在m/z991.546 9 處得到加合離子［M+FAH］?，推導(dǎo)分子式為C48H82O18。二級(jí)碎片信息：m/z945.54 ［M-H］?依次丟失一個(gè)葡萄糖（m/z783.49）、一個(gè)鼠李糖得到（m/z637.43）、及一個(gè)葡萄糖得到苷元離子（m/z475.38），以及苷元離子側(cè)鏈斷裂丟失C6H12產(chǎn)生（m/z391.28）。通過與對(duì)照品比對(duì)，最終確定11號(hào)峰為ginsenoside Re，其質(zhì)譜裂解途徑如圖2 所示?；衔?4 保留時(shí)間為9.73 min，在負(fù)離子模式下可見其甲酸加合離子峰m/z991.548 3 ［M+FA-H］?，二級(jí)質(zhì)譜可以觀察到碎片離子m/z945.54，783.49，621.44，459.38，375.29，分別對(duì)應(yīng)脫氫峰，以及因此丟失三個(gè)葡萄糖及苷元離子側(cè)鏈斷裂，因此化合物44為帶有三個(gè)葡萄糖的原人參二醇型皂苷，通過檢索化合物庫并與文獻(xiàn)［6］對(duì)比，化合物44 鑒定為notoginsenoside K。類似地，還鑒定了4 個(gè)原人參三醇型皂苷（化合物12，24，32，42）和10個(gè)原人參二醇型皂苷（化合物25，26，28，30，34，35，40，51，56，57）。

圖2 ginsenoside Re負(fù)離子下的裂解途徑

側(cè)鏈雜化型皂苷可以通過二級(jí)質(zhì)譜中苷元離子進(jìn)行鑒別，如化合物49 和50 的苷元離子均為m/z457.37，相比于原人參二醇型皂苷苷元，其在苷元C-20側(cè)鏈上多一個(gè)雙鍵，結(jié)合化合物的保留順序［7］，化合物49 和50 分別鑒定為ginsenoside Rg6 和ginsen?oside F4。類似地根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的保留順序［8］，化合物52 和55 分別鑒定為ginsenoside Rk3 和ginsen?oside Rh4。

?；碥崭鶕?jù)酰化基團(tuán)中是否含有羧基分別中性皂苷（乙?；┖退嵝栽碥眨ū；?。乙?；〈碥张c原人參二醇型及原人參三醇型相近，一級(jí)質(zhì)譜主要觀察到甲酸加合離子；丙二酰取代皂苷主要形成［M-H］?。以化合物41為例，在一級(jí)質(zhì)譜圖中，主要形成［M-H］?以及源內(nèi)碎裂形成m/z987.55 ［M-CO2-H］?，在二級(jí)碎片中觀察到脫去丙二?；膍/z945.54 ［M-Mal-H］?，以及相應(yīng)的脫糖碎片m/z783.48，621.44，459.38，因此化合物41 為含有三個(gè)葡萄糖基和一個(gè)丙二?；〈脑藚⒍夹驮碥?，經(jīng)過數(shù)據(jù)庫比對(duì)鑒定為malonyl ginsenoside Rd，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［9］，其質(zhì)譜裂解途徑如圖3所示。

圖3 malonyl ginsenoside Rd負(fù)離子下的裂解途徑

齊墩果酸型皂苷可以通過苷元離子m/z455.35進(jìn)行鑒定，因?yàn)辇R墩果酸型皂苷大多含有葡萄糖醛酸取代，在一級(jí)質(zhì)譜中通常形成［M-H］?。以人參皂苷Ro（化合物33）為例，一級(jí)質(zhì)譜在m/z955.4893 觀察到準(zhǔn)分子離子峰［M-H］-。二級(jí)質(zhì)譜中可以檢測到碎片離子m/z793.44，613.37，569.38，469.38，455.35，由脫糖和二氧化碳等產(chǎn)生，通過與對(duì)照品比對(duì)，最終確定化合物33 為人參皂苷Ro，其質(zhì)譜裂解途徑如圖4所示。

圖4 ginsenoside Ro負(fù)離子下的裂解途徑

2.2 酚酸類化合物酚酸類成分主要為來源于丹參的丹酚酸類化合物，丹酚酸類化合物根據(jù)結(jié)構(gòu)類型可以分為單聚體和多聚體（二聚體、三聚體和四聚體），多聚體由多個(gè)單聚體通過酯鍵或者醚鍵聚合。丹參素（化合物1）為單聚體丹酚酸類成分，其［M-H］-準(zhǔn)分子離子峰為m/z197.0443，碎裂主要產(chǎn)生丟失水分子和CO2產(chǎn)生m/z135.04，丹參素通過與對(duì)照品比對(duì)進(jìn)行鑒定?；衔? 的母離子為m/z359.076 0，分子式推導(dǎo)為C18H16O8，二級(jí)碎片中檢測到與丹參素一致的碎片信息（m/z197.04，135.04，123.04），推定為由丹參素組成的二聚體型丹酚酸類化合物，通過數(shù)據(jù)庫檢索及對(duì)照品比對(duì)鑒定為迷迭香酸，其質(zhì)譜裂解途徑如圖5 所示?；衔? 由一級(jí)質(zhì)譜圖可知，其［M-H］?準(zhǔn)分子離子峰為m/z717.144 7，在二級(jí)質(zhì)譜中主要檢測到m/z321.04 的碎片及相關(guān)離子，其由酯鍵斷裂丟失兩個(gè)C9H10O5生成，通過對(duì)照品比對(duì)，化合物1鑒定為丹酚酸B。

圖5 迷迭香酸負(fù)離子下的裂解途徑

2.3 二萜類化合物本品共鑒定二萜類化合物20個(gè)，主要為來源于丹參中的二萜醌類化合物及其衍生物。以化合物64為例，正離子模式下擬合分子式為C18H14O3，二級(jí)質(zhì)譜中碎片離子m/z261.09，233.10，205.10，190.08，169.06，141.07，分別對(duì)應(yīng)為［M+H-H2O］+，［M+H-H2O-CO］+，［M+H-H2O-2CO］+，［M+H-CO-C5H6O］+，［M+H-2CO-C5H6O］+，與文獻(xiàn)報(bào)道二氫丹參酮Ⅰ碎裂行為基本一致［10］，由此，推測化合物64 為二氫丹參酮Ⅰ，其質(zhì)譜裂解途徑見圖6。

圖6 二氫丹參酮I正離子下的裂解途徑

2.4 木脂素類化合物本品共鑒定9 個(gè)木脂素類化合物，以化合物84 為例，正離子模式下擬合分子式為C23H28O6，二級(jí)質(zhì)譜中碎片離子m/z386.17，370.18，355.15，331.12，316.09，300.10，285.08 分別對(duì)應(yīng)為［M+H-CH3］+，［M+H-OCH3］+，［M+H-CH3-OCH3］+，［M+H-C5H10］+，［M+H-CH3-C5H10］+，［M+HOCH3-C5H10］+，［M+H-OCH3-CH3-C5H10］+，與文獻(xiàn)報(bào)道五味子乙素碎裂行為基本一致［11］，由此，推測化合物84為五味子乙素，其質(zhì)譜理解途徑見圖7。

圖7 五味子乙素正離子下的裂解途徑

2.5 其他除上述化學(xué)成分外，本品還檢測到黃酮類如田薊苷、黃芪異黃烷苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3'-甲氧基大豆黃素，及bornyl 7-O-α-Larabinofuranosyl-（1→6）-β-D-glucopyranoside 與積雪草酸。具體結(jié)果見表1。

3 討論

中藥復(fù)方制劑對(duì)一些疑難病癥療效顯著，然而這些中藥制劑成分復(fù)雜、作用機(jī)制不清，不利于臨床廣泛應(yīng)用。中藥復(fù)方制劑的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)研究是有效性、安全性和質(zhì)量控制的前提［12-13］。液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜具有準(zhǔn)確、靈敏、快速等優(yōu)勢，適用于中藥復(fù)方制劑的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)研究。本研究將UPLC-QTOF-MS 應(yīng)用于臨床常用復(fù)方益心舒膠囊的化學(xué)成分分析，最終確定了86個(gè)成分。

檢測到的成分主要為皂苷類、酚酸類、二萜類及木質(zhì)素類，主要來源于人參、丹參、五味子等三味藥材，可能與益心舒膠囊中各藥味入藥方式有關(guān)。粉末入藥的人參及經(jīng)過乙醇提取五味子、丹參中以次級(jí)代謝物為主，而麥冬、黃芪、川芎、山楂等4味藥為水煎煮提取，低極性的次級(jí)代謝物含量低難以檢測。2020 年版《中國藥典》（一部）分別以人參皂苷Rg1 和人參皂苷Re、丹酚酸B 為指標(biāo)對(duì)人參和丹參進(jìn)行質(zhì)量控制。文獻(xiàn)報(bào)道［14］，五味子甲素和五味子乙素是益心舒膠囊治療心力衰竭的關(guān)鍵活性成分，他們可以通過減弱內(nèi)皮素-1 誘導(dǎo)的收縮功能障礙、腦鈉肽含量升高和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化發(fā)揮治療作用。因此，在益心舒膠囊的質(zhì)量控制中可以進(jìn)一步考慮對(duì)藥味五味子的質(zhì)量控制。

本研究開展了益心舒膠囊的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)研究，值得注意的是，化學(xué)成分并不同等于藥效成分。只有吸收入血的成分才可能是發(fā)揮藥效的直接物質(zhì)，因此后期還需要進(jìn)一步開展益心舒膠囊的藥代及藥動(dòng)學(xué)研究，以及入血成分的活性評(píng)價(jià)以及分子機(jī)制研究，以期更加全面地闡釋益心舒膠囊的作用機(jī)制。