李姍，王榮麗

作者單位：西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，四川 瀘州 646000

急性肺損傷（ALI）是一種由機體創(chuàng)傷、燒傷、重癥感染、休克、彌散性血管內(nèi)凝血等因素觸發(fā)并以逐漸進展的呼吸困難、難以逆轉(zhuǎn)的氧合障礙、非心源性肺水腫為臨床特征［1］的危急重癥。急性呼吸窘迫綜合征是ALI 進展的嚴(yán)重階段，發(fā)病率及死亡率高［2］，至今仍然缺乏特效治療藥物。阿托伐他汀鈣（AVT）屬于3 羥基-3 甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶選擇性、競爭性抑制劑，除針對心血管系統(tǒng)調(diào)節(jié)血脂、抗動脈粥樣硬化外，還可抑制炎癥、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)免疫、改善內(nèi)皮功能等［3-6］。已有文獻［7-8］報道，受核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）調(diào)控的下游因子血紅素加氧酶1（HO-1）表達增強能抑制炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，但AVT 是否也能通過該通路減輕脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的ALI 小鼠炎癥反應(yīng)仍需進一步驗證。研究時間2021年9―12月。

1 材料與方法

1.1 動物15 只4～6 周齡健康雌性BALB/c 小鼠，購自湖北省實驗動物研究中心，合格證號［SCXK（鄂）2020-0018］，體質(zhì)量范圍為19～22 g。

1.2 藥品與試劑AVT（貨號A121956，規(guī)格250 mg，純度98%）；LPS（貨號L118716，規(guī)格10 mg，純度99%），均購自上海阿拉丁有限公司。小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（貨號ELK1395，規(guī)格96T）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）ELISA試劑盒（貨號ELK1271，規(guī)格96T）均購自武漢科鹿生物科技有限公司；山羊抗兔二抗（貨號AS1107，規(guī)格100 μL）購自武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司；Nrf2兔抗鼠抗體（貨號16396-1-AP，規(guī)格150 μL）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；HO-1 兔抗鼠抗體（貨號#43966，規(guī)格100 μL）購自美國CST公司。

1.3 儀器ABL700 全自動血氣分析儀，購自瑞士羅氏公司；RM2016 病理切片機，購自上海徠卡公司； DR-200Bs酶標(biāo)儀，購自Diatek公司。

1.4 小鼠分組及建立ALI模型15只BALB/c 雌性小鼠采用隨機數(shù)字表法分為NS 組、LPS 組、LPS+AVT 組，每組5 只。LPS 組、LPS+AVT 組以尾靜脈注射 LPS 4 mg/kg構(gòu)建ALI動物模型，NS組則以相同方式注射等量生理鹽水。小鼠出現(xiàn)精神萎靡、活動減少、呼吸急促、四肢及口唇發(fā)紺為模型建立成功。建模1 h 后，LPS+AVT 組予以 AVT 10 mg/kg灌胃，其余組分別以等量生理鹽水灌胃。建模后6 h 以水合氯醛腹腔麻醉小鼠，采集腹主動脈血1 mL，并用頸椎脫臼法處死。

1.5 測定動脈氧分壓（PaO2），計算氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）比值取腹主動脈血1 mL，使用全自動血氣分析儀，檢測PaO2并計算PaO2/FiO2比值（呼吸空氣情況下吸入氧濃度FiO2為21%）。

1.6 肺組織HE 染色取出小鼠左肺組織，分別進行固定、脫水、包埋、切片、HE 染色，光鏡下觀察小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變。

1.7 肺組織濕干重（W/D）比值取出右肺中葉，稱重，測定濕質(zhì)量（W）后置于85 ℃恒溫烘干箱中36 h，再稱重測出干質(zhì)量（D），計算W/D比值。

1.8 肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β 檢測處死小鼠后鈍性分離出氣管，進行氣管插管，以1 mL 預(yù)冷生理鹽水灌洗、回抽，重復(fù)3 次。將回收后的灌洗液混勻，在冰凍離心機4 ℃下，以3 000 r/min 離心10 min，取出上清液，據(jù)TNF-α、IL-1β ELISA 試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-1β含量。

1.9 小鼠肺組織Nrf2、HO-1 蛋白檢測取各組小鼠右肺下葉組織，用BAC 法測定肺組織總蛋白濃度后，取40 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，PVDF膜恒流轉(zhuǎn)膜后室溫封閉，加入一抗Nrf2 抗體（稀釋比1∶500）、HO-1 抗體（稀釋比1∶2 000）、GAPDH 單克隆抗體（稀釋比1∶10 000）過夜?；厥找豢梗琓BST 洗滌3次，然后室溫下孵育二抗（稀釋比1∶10 000），TBST洗滌4次。均勻滴加現(xiàn)配的ECL混合溶液（顯影液∶定影液=1∶1）到膜蛋白面?zhèn)龋瑩?jù)光強度不同調(diào)整曝光條件。用AlphaEaseFC 軟件掃描膠片，以目標(biāo)帶與GAPDH 帶的光密度比值作為結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0，計量資料以表示，多組間比較用單因素方差分析，其中兩兩比較行LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺組織病理改變HE 染色可呈現(xiàn)小鼠因肺組織損傷而形成的病理學(xué)改變。如圖1，NS 組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰度、完整度高，肺泡壁均一，肺間隔薄，肺泡腔干凈。LPS組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)混亂不清，肺泡壁不均勻，肺間隔變厚，肺泡腔及間隔里大量炎性細(xì)胞滲出堆積；LPS+ AVT組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)較清晰完整，肺泡壁也較均一，肺間隔輕度增厚，炎性滲出浸潤減少。

圖1 各組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)（HE×100和HE×400）

2.2 小鼠動脈血氣分析由檢測的小鼠PaO2水平了解肺部缺氧程度，并根據(jù)其數(shù)值計算PaO2/FiO2以評估其肺部呼吸功能急性損傷情況。如表1 顯示，LPS 組小鼠的PaO2、PaO2/FiO2均顯著低于NS 組（P<0.05），而LPS+AVT 組小鼠PaO2及PaO2/FiO2均高于LPS組（P<0.05）。

表1 小鼠動脈血PaO2、PaO2/FiO2和肺組織W/D比值/

表1 小鼠動脈血PaO2、PaO2/FiO2和肺組織W/D比值/

注：PaO2為動脈氧分壓，PaO2/FiO2為氧合指數(shù)，W/D為濕/干比值。①與NS組比較，P<0.05。②與LPS組比較，P<0.05。

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2.3 小鼠肺組織W/D 比值檢測小鼠肺組織W/D比值以評估肺部血管滲漏和肺組織水腫程度。如表1顯示，LPS組小鼠W/D比值高于NS組（P<0.05），而LPS+ AVT組小鼠W/D比值低于LPS組（P<0.05）。

2.4 小鼠BALF 中TNF-α 、IL-1β 水平采用ELI?SA 法檢測小鼠BAF IL-1β、TNF-α 的含量，以反映小鼠肺部炎癥水平。根據(jù)結(jié)果分析，LPS 組小鼠的TNF-α、IL-1β 水平均顯著高于NS 組（P<0.05），而LPS+AVT組小鼠上述炎性因子水平均明顯低于LPS組（P<0.05）。見表2。

表2 小鼠BALF IL-1β、TNF-α 水平及肺組織Nrf2、HO-1蛋白表達比較/

表2 小鼠BALF IL-1β、TNF-α 水平及肺組織Nrf2、HO-1蛋白表達比較/

注：BALF為肺泡灌洗液，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-1β為白介素-1β，Nrf2為核因子E2相關(guān)因子2，HO-1為血紅素加氧酶1。①與NS組比較，P<0.05。②與 LPS組比較，P<0.05。

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2.5 小鼠肺組織Nrf2、HO-1 蛋白表達比較通過蛋白質(zhì)印跡法測定小鼠肺組織Nrf2、HO-1蛋白的表達水平，以評估Nrf2/HO-1 通路的激活或抑制狀態(tài)。經(jīng)結(jié)果分析，LPS 組小鼠Nrf2、HO-1 表達水平均顯著低于NS 組（P<0.05），而LPS+AVT 組小鼠Nrf2、HO-1表達水平高于LPS組（P<0.05）。見表2，圖2。

圖2 各組小鼠肺組織中Nrf2、HO-1蛋白水平

3 討論

AVT 對HMG-CoA 還原酶起特異性抑制效應(yīng)，通過阻礙HMG-CoA 向甲羥戊酸轉(zhuǎn)化實現(xiàn)調(diào)脂、抗動脈粥樣硬化作用。研究［9］發(fā)現(xiàn)AVT能下調(diào)黏附分子表達，降低促炎細(xì)胞因子及補體末端產(chǎn)物水平，減少核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65磷酸化，抑制炎癥細(xì)胞浸潤和組織損傷。據(jù)黃興漢［10］研究，腦缺血再灌注后的大鼠經(jīng)AVT 處理，其梗死灶周圍中性粒細(xì)胞較對照組明顯減少，表明AVT 可抑制臟器炎癥損傷中炎癥細(xì)胞的浸潤。為了驗證AVT對ALI小鼠發(fā)揮積極的炎癥保護作用并探索可能存在的新機制，我們開展了這個實驗，以期為AVT 在ALI 的應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

ALI 早期肺泡基底膜受損，肺微血管通透性增加，蛋白質(zhì)、液體在肺間質(zhì)聚集引起水腫，并向肺泡內(nèi)滲漏［11］，隨后出現(xiàn)肺容積減少、順應(yīng)性下降、通氣血流比例失調(diào)等眾多病理生理改變，進而導(dǎo)致以PaO2下降為主的急性呼吸功能衰竭。本研究采用LPS呈現(xiàn)ALI模型，可見ALI小鼠因肺間隔和肺泡腔內(nèi)大量炎性細(xì)胞滲出堆積導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)混亂不清，肺組織含量水高。并且，ALI 小鼠出現(xiàn)低氧血癥的同時，其動脈血氣分析的結(jié)果也符合ALI 的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即PaO2/ FiO2≤300 mmHg［12］。上述結(jié)果均能說明此次LPS 誘導(dǎo)的小鼠ALI 模型是成功的。此外，研究結(jié)果還可見AVT的治療可以減輕ALI小鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞程度，減少炎性細(xì)胞滲出堆積，降低肺組織含水量，改善肺部呼吸功能受損。

LPS 誘導(dǎo)的ALI 病情進展迅速，涉及炎癥、氧化應(yīng)激、離子通道改變、細(xì)胞凋亡等多個環(huán)節(jié)［13-14］。IL-1β、TNF-α 均參與炎癥的級聯(lián)放大效應(yīng)［15］。多形核白細(xì)胞作為主要的炎癥細(xì)胞，通過上調(diào)其表面的細(xì)胞黏附分子CD11/CD18、P-選擇素等，在肺內(nèi)過度聚集、浸潤、活化，釋放許多具有生物損害作用的組織蛋白酶、TNF-α 等炎性物質(zhì)。IL-1β、TNF-α 同時也具備促炎能力，當(dāng)肺內(nèi)巨噬細(xì)胞受到炎性或損傷刺激時也可分泌這兩種物質(zhì)，以作用于多形核白細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞，促使更多的炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子產(chǎn)生、擴散，正反饋循環(huán)得到啟動，加重肺損傷［16］。我們的研究可見，LPS 誘導(dǎo)后的兩組小鼠肺泡灌洗液IL -1β、TNF-α 含量均高，提示炎癥反應(yīng)得到啟動；而LPS+AVT組的小鼠IL -1β、TNF-α水平降低，提示炎癥反應(yīng)有所抑制。因此，若能阻斷炎癥放大反應(yīng)，也許能夠延緩ALI病情進展。

研究表明激活Nrf2/HO-1 通路在氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、組織損傷中具有積極作用［17-19］。Nrf2 為帽領(lǐng)堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子家族成員，由高度保守的結(jié)構(gòu)域Neh1~7 組成，受Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keap1）負(fù)向調(diào)控，是調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要因子，參與抗炎、抗氧化、凋亡等過程。機體處于生理狀態(tài)時，Nrf2 經(jīng)Neh2 與Keap1 結(jié)合在胞質(zhì)中。在各種應(yīng)激情況下，Keap1 末端的半胱氨酸殘基發(fā)生氧化還原反應(yīng)被修飾，因此構(gòu)象改變。從胞質(zhì)中Keap1 上脫離的Nrf2，經(jīng)磷酸化和易位入核，在核內(nèi)同Maf 蛋白和Jun bZip 轉(zhuǎn)錄因子形成異源二聚體，再以Neh4、Neh5 與抗氧化反應(yīng)元件精準(zhǔn)結(jié)合。隨后在環(huán)腺苷酸效應(yīng)元件結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄激活因子等作用下，Nrf2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄過程得以啟動，正向調(diào)控下游靶基因，啟動抗氧化酶、Ⅱ相解毒酶等活性調(diào)節(jié)［7，17，20］。HO-1，又稱熱休克蛋白32，是Nrf2調(diào)控的下游酶物質(zhì)，普遍存在于哺乳動物體內(nèi)血細(xì)胞代謝旺盛的骨髓、肝、脾等臟器中。在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、細(xì)胞色素P450 的參與下［7］，HO-1 將血紅素降解為膽綠素、一氧化碳和亞鐵離子，進而產(chǎn)生抗氧化、抗炎、抗凋亡等積極作用［17，21］。于是，我們作出假設(shè)，AVT 對ALI 小鼠的保護效應(yīng)也可能與此條信號通路有關(guān)。為了驗證這種假設(shè)，本研究以AVT 作為干預(yù)藥物，發(fā)現(xiàn)給予了AVT 灌胃的ALI小鼠Nrf2 和HO-1 蛋白表達均上調(diào)，肺組織損傷和呼吸功能也有所改善，表明AVT 可通過激活Nrf2/HO-1通路發(fā)揮抗炎效應(yīng)。文獻［18］報道，從珍貴的傳統(tǒng)中草藥冬蟲夏草中提取的嘌呤類生物堿冬蟲夏草素能夠誘導(dǎo)Nrf2 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核并激活，以此上調(diào)ALI大鼠肺組織中HO-1的表達和酶活性，從而緩解肺組織損傷。據(jù)此，我們推測，本研究中AVT 對Nrf2/HO-1 通路的激活作用也可能與促進Nrf2 轉(zhuǎn)位入核致Nrf2 轉(zhuǎn)錄增加有關(guān)，但仍需進一步的實驗研究證明。

綜上所述，AVT 可減輕LPS 誘導(dǎo)ALI 小鼠的炎癥反應(yīng)，這可能與激活Nrf2/HO-1通路有關(guān)。