張珍珍，位慧芳，張勇，張輝

作者單位：鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院，a神經(jīng)內(nèi)科，b神經(jīng)外科，河南 鄭州 450000

腦卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是腦卒中后復(fù)雜情感性精神障礙疾病，與海馬內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）表達有關(guān)，BDNF 下調(diào)可能是引起應(yīng)激反應(yīng)中神經(jīng)元萎縮的重要因素［1-3］。環(huán)磷酸腺苷（cyclic AMP，cAMP）/環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）/BDNF 通路是抗抑郁的重要通路以及抗抑郁藥物治療發(fā)揮作用的重要途徑和靶點，但目前其在PSD 中作用機制的研究較少［4］。本研究自2022 年1―3 月通過觀察海馬區(qū)慢病毒載體微注射BDNF 對大鼠PSD 的改善作用，并探討其對cAMP/CREB/BDNF 通路的影響，旨在為臨床治療PSD提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF 級SD 雄性大鼠95 只，6 周齡，體質(zhì)量（180±20）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。置室溫（23±2）℃、濕度60%～65%、人工12 h 晝/夜照明環(huán)境中飼養(yǎng)。本研究中對動物的處置符合動物實驗倫理學(xué)原則。

1.2 主要試劑cAMP/CREB/BDNF 通路抑制劑SQ22536、激活劑forskolin 購自美國Selleck Chemi?cals 公司；兔抗大鼠cAMP、BDNF 單克隆抗體，pCREB 多克隆抗體，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 單抗購自美國Abcam 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）和5-羥色胺（5-hy?droxytryptamine，5-HT）酶聯(lián)免疫試劑盒為日本Ta?KaRa公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 造模及分組采用隨機數(shù)字表法選取80 只大鼠，采用中動脈栓塞法［5］建立腦卒中模型，余15只為假手術(shù)組，僅在頸部正中取切口，分離頸總動脈、頸內(nèi)與頸外動脈，不進行動脈栓塞操作。采用Longa 評分法［6］進行神經(jīng)功能缺損評分：無缺損0分；右前肢無法完全伸展1 分；行走時向右旋轉(zhuǎn)2分；行走時向右傾斜3 分；不能自發(fā)行走，有意識障礙4 分。評分為2~3 分者為建模成功。腦卒中模型制備成功7 d后，參考傅松年等［7］方法給予大鼠慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激，包括夾尾、禁水、禁食、高溫、冰水游泳、晝夜顛倒和水平搖晃7 種刺激，每天1 種刺激，重復(fù)3 周。期間所有大鼠孤養(yǎng)，制備PSD 模型。將造模成功的64 只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為PSD 組、無序干擾組、BDNF 組各12 只，激活劑組和抑制劑組各14只。

1.3.2 干預(yù)方法各組大鼠以3%（質(zhì)量濃度）戊巴比妥鈉按體質(zhì)量40 mg/kg 腹腔注射麻醉，采用腦立體定位儀固定大鼠，于前囟后0.8 mm，右側(cè)旁1.6 mm 部位鉆孔，直徑0.5 mm。無序干擾組注射1 μL含無序干擾序列的重組慢病毒載體，BDNF 干預(yù)組注射1 μL 含過表達BDNF 的重組慢病毒載體，激活劑組和抑制劑組按體質(zhì)量10 mg/kg分別皮下注射含5%二甲基亞砜的forskolin 和SQ22536，假手術(shù)組和PSD組注射等量含5%二甲基亞砜的生理鹽水。

1.3.3 糖水消耗實驗和敞箱實驗（1）糖水消耗實驗：干預(yù)結(jié)束后，將假手術(shù)組、PSD 組、無序干擾組、BDNF 干預(yù)組大鼠單籠飼養(yǎng)，實驗前48 h 進行糖水適應(yīng)訓(xùn)練，訓(xùn)練結(jié)束，禁食禁水12 h，給每籠大鼠放置1瓶已稱重的1%（質(zhì)量濃度）蔗糖水和純水，自由飲水2 h，稱取瓶子重量計算糖水和純水消耗量。糖水消耗百分比=糖水消耗量（g）/（糖水消耗量+純水消耗量）×100%。（2）敞箱實驗：將假手術(shù)組、PSD 組、無序干擾組、BDNF 組大鼠置體積80 cm×80 cm×40 cm、底面由25 塊16 cm×16 cm 的正方形組成的黑箱內(nèi)適應(yīng)10 min 后，將其放入正中央格觀察其5 min內(nèi)活動情況，監(jiān)測指標包括方格間穿行次數(shù)（3 只爪以上跨入鄰格次數(shù)）及豎起修飾次數(shù)（前肢離地1 cm以上次數(shù)）。

1.3.4 組織取材糖水實驗和敞箱實驗結(jié)束，處死所有大鼠，分離雙側(cè)海馬組織。各組取7 只大鼠左側(cè)海馬組織置4%（質(zhì)量濃度）甲醛中固定備用，余海馬組織置?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 海馬BDNF 表達水平檢測假手術(shù)組、PSD組、無序干擾組、BDNF 組分別取7 只大鼠右側(cè)海馬組織，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH 為內(nèi)參基因，進行RT-qPCR 檢測BDNF 相對表達水平。引物序列：BDNF：正向：5′-GACAAGGTCAACTG?GCCTAC-3′，反向：5′-TCGTCATGACCTCTGAACCT-3′；GAPDH：正向：5′-AGACAGCGAGCATCTTCTT?GT-3′，反向：5′-TGATGGCAACGAATGTCCACT-3′。

1.3.6 海馬組織病理學(xué)觀察取假手術(shù)組、PSD組、無序干擾組、BDNF 組經(jīng)4%（質(zhì)量濃度）甲醛固定的左側(cè)海馬組織，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片（片厚4 μm），行常規(guī)HE染色。封片后置顯微鏡下觀察。

1.3.7 海馬組織NE 和5-HT 水平測定假手術(shù)組、PSD 組、無序干擾組、BDNF 組取大鼠左側(cè)海馬組織，勻漿，4 ℃下以3 000 r/min離心10 min（離心半徑8 cm），取上清，采用全自動酶標儀測定5-HT 及NE 450 nm處的吸光值。

1.3.8 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）各組取剩余大鼠右側(cè)海馬組織，提取總蛋白，采用BCA 試劑盒定量，95 ℃水浴使蛋白變性，進行SDS-PAGE凝膠電泳。以β-actin 為內(nèi)參，計算各蛋白條帶灰度值/β-actin 蛋白條帶灰度值表示cAMP、pCREB、BDNF蛋白相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 25.0 軟件分析，計量資料以表示，經(jīng)Levene 與方差齊性檢驗，方差齊，多樣本數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，多組間兩兩比較采取SNK-q檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖水消耗實驗和敞箱實驗與假手術(shù)組比較，PSD 組大鼠糖水消耗量、方格穿行次數(shù)和豎起修飾次數(shù)減少（均P<0.001）；與PSD 組比較，BDNF 組大鼠糖水消耗量較大，方格穿行次數(shù)和豎起修飾次數(shù)較少（均P<0.001），無序干擾組與之差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.871、0.470、0.072）。見表1。

表1 各組大鼠糖水消耗實驗和敞箱實驗結(jié)果比較/

表1 各組大鼠糖水消耗實驗和敞箱實驗結(jié)果比較/

注：PSD為腦卒中后抑郁，BDNF為腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。①與假手術(shù)組比較，P<0.05。②與PSD組比較，P<0.05。③與無序干擾組比較，P<0.05。

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2.2 海馬組織BDNF 相對表達水平與假手術(shù)組（2.62±0.32）比較，PSD 組BDNF 相對表達量（0.62±0.13）降低（P<0.001）；與PSD 組比較，BDNF組BDNF相對表達量（1.68±0.16）升高（P<0.001），與無序干擾組（0.69±0.09）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.139）。

2.3 海馬組織病理學(xué)變化HE 染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組海馬神經(jīng)元細胞排列緊密，形態(tài)規(guī)則；PSD組和無序干擾組海馬神經(jīng)元細胞病理形態(tài)相似，細胞數(shù)目減少，排列紊亂，形態(tài)不規(guī)則，部分細胞出現(xiàn)空泡；BDNF 組海馬神經(jīng)元細胞數(shù)目增加，排列基本緊密，形態(tài)基本規(guī)則。見圖1。

2.4 大鼠海馬組織NE 和5-HT 含量與假手術(shù)組比較，PSD 組大鼠海馬組織NE 和5-HT 含量降低（均P<0.001）；與PSD組比較，BDNF組大鼠海馬組織NE和5-HT 含量較高（均P<0.001），無序干擾組與之差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.460、0.662）。見表2。

表2 各組大鼠海馬組織NE和5-HT含量比較/（ng/g，）

表2 各組大鼠海馬組織NE和5-HT含量比較/（ng/g，）

注：NE 為去甲腎上腺素，5-HT 為5-羥色胺，PSD 為腦卒中后抑郁，BDNF為腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。①與假手術(shù)組比較，P<0.05。②與PSD組比較，P<0.05。③與無序干擾組比較，P<0.05。

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2.5 cAMP/CREB/BDNF 通路在PSD 中的作用與假手術(shù)組比較，PSD 組海馬區(qū)cAMP、pCREB、BDNF 蛋白相對表達量降低（均P<0.001）；與PSD 組比較，BDNF 組、激活劑組海馬區(qū)cAMP、pCREB、BDNF 蛋白相對表達量升高，抑制劑組海馬區(qū)cAMP、pCREB、BDNF 蛋白相對表達量降低（均P<0.001），無序干擾組、抑制劑組與之比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.475、0.508、0.876）。見表3，圖2。

圖2 cAMP、pCREB、BDNF蛋白相對表達量

表3 cAMP、pCREB、BDNF蛋白相對表達量/

表3 cAMP、pCREB、BDNF蛋白相對表達量/

注：cAMP 為環(huán)磷酸腺苷，CREB 為環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，BDNF為腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，PSD為腦卒中后抑郁。①與假手術(shù)組比較，P<0.05。②與PSD組比較，P<0.05。③與無序干擾組比較，P<0.05。

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3 討論

PSD發(fā)病機制可能與一些神經(jīng)遞質(zhì)的分泌失衡有關(guān)。研究［8-9］發(fā)現(xiàn)，BDNF 可能通過促膽堿能神經(jīng)生長調(diào)控海馬學(xué)習與記憶功能，在抑郁相關(guān)的海馬神經(jīng)突觸調(diào)控中發(fā)揮重要作用?！吧窠?jīng)營養(yǎng)因子假說”認為人類的抑郁障礙與腦部BDNF 表達降低及功能下調(diào)有關(guān)［10］。研究［11-13］發(fā)現(xiàn)，抗抑郁治療能提高患者血清BDNF 水平，提示病人BDNF 水平升高可能改善患者的抑郁狀態(tài)。故本研究選用BDNF 作為實驗藥物，分析其對PSD 癥狀及病理的影響，為PSD臨床治療提供借鑒。

目前，PSD 大鼠主要通過Longa 評分法量化其神經(jīng)功能缺陷，本研究利用Longa 評分法確定PSD大鼠造模成功。PSD主要表現(xiàn)為活動、不思飲食、體質(zhì)量下降等，結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，PSD 大鼠糖水消耗量、方格穿行次數(shù)和豎起修飾次數(shù)減少，提示PSD 大鼠活動減少，且存在神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，符合PSD 癥狀表現(xiàn)。與PSD 大鼠比較，BDNF 組大鼠糖水消耗量、方格穿行次數(shù)和豎起修飾次數(shù)增加，提示BDNF 可改善PSD 大鼠活動狀態(tài)以及神經(jīng)功能。研究發(fā)現(xiàn)，PSD 患者海馬狀突起較健康人變小，神經(jīng)元萎縮或神經(jīng)膠質(zhì)細胞數(shù)目減少。本研究通過檢測海馬BDNF 表達水平結(jié)合海馬HE 染色發(fā)現(xiàn)：與假手術(shù)組比較，PSD組海馬神經(jīng)元細胞病理形態(tài)相似，細胞數(shù)目減少，排列紊亂，形態(tài)不規(guī)則，部分細胞出現(xiàn)空泡，而BDNF 組較PSD 組明顯改善，外源BDNF 干預(yù)可作用于海馬區(qū)，并保護神經(jīng)元，阻止神經(jīng)元萎縮與神經(jīng)膠質(zhì)細胞數(shù)量減少等現(xiàn)象，這可能是BDNF 改善PSD 大鼠神經(jīng)功能的原因之一［14］。鮑善娟、邵蓓［15］通過電刺激聯(lián)合舍曲林治療PSD，發(fā)現(xiàn)治療后5-HT和NE水平顯著提高。NE、5-HT能神經(jīng)元位于腦干，卒中后導(dǎo)致腦梗死缺血或腦出血，在病灶處形成缺氧缺血-腦水腫惡性循環(huán)，導(dǎo)致局部血管活性物質(zhì)釋放，促進腦組織變性壞死，影響前述神經(jīng)元及其通路，導(dǎo)致相應(yīng)神經(jīng)遞質(zhì)水平下降，引起抑郁。5-HT 和NE 含量下降可引起失眠、情緒淡漠、空虛、焦慮等抑郁癥狀，故改善5-HT 和NE 水平是治療PSD 的關(guān)鍵。本研究中與PSD 組比較，BDNF 組NE、5-HT 含量明顯升高，提示海馬區(qū)注射BDNF對PSD有改善作用。

cAMP/CREB/BDNF 信號通路是調(diào)節(jié)抑郁癥海馬神經(jīng)元再生的關(guān)鍵通路之一［16］?？挂钟羲幹饕ㄟ^提高cAMP濃度，導(dǎo)致cAMP信號級聯(lián)及其下游靶標pCREB、BDNF 等發(fā)生變化，從而發(fā)揮抗抑郁作用［17］?？挂钟羲幨紫燃せ钕佘账岘h(huán)化酶，催化ATP脫去一個焦磷酸而產(chǎn)生cAMP，接著cAMP 激活蛋白激酶A 使其下游靶標CREB 在133 位上的絲氨酸發(fā)生磷酸化，CREB磷酸化促進其下游靶基因BDNF的表達［18-20］。表3 顯示與PSD 組比較，BDNF 組和激活劑組cAMP、pCREB、BDNF 蛋白相對表達水平較高，而抑制劑組與PSD 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示BDNF可能是通過激活cAMP/CREB/BDNF 信號通路改善PSD大鼠癥狀與病理的。

綜上所述，海馬內(nèi)注射BDNF 對PSD 有改善作用，可能是通過激活cAMP/CREB/BDNF 信號通路發(fā)揮作用的，為PSD臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

（本文圖1見插圖8-2）