張嫻，徐志紅，陳磊垚，許立

作者單位：1南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南京 210014；

2南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023

骨質(zhì)疏松（osteoporosis， OP）是一種全身性骨代謝疾病，主要表現(xiàn)為骨量丟失、骨組織退化和骨微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在絕經(jīng)后女性與老年人中發(fā)病率較高［1-2］。而人口老齡化現(xiàn)象嚴(yán)重，中老年骨質(zhì)疏松病人數(shù)量日益龐大［3］。目前市售抗OP 藥物種類較多，但存在一定的局限性和不良反應(yīng)，病人骨代謝平衡等問題亟待解決［4］。中藥復(fù)方結(jié)合了中醫(yī)的整體觀和辨證論治思想，并且毒副作用小，在骨質(zhì)疏松的治療上具有多靶點等優(yōu)勢［5］。

桃紅四物湯包含桃仁、白芍等六味中藥，是活血化瘀的經(jīng)典方劑。研究發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯可以通過改善血液流變學(xué)特征，促進間充質(zhì)細胞歸巢［6］等治療OP［7］。因此，研究和揭示桃紅四物湯對骨質(zhì)疏松的干預(yù)作用與其機制，對此類活血化瘀類中藥復(fù)方防治骨質(zhì)疏松具有重大意義。

維甲酸誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型的建立相對簡單，無須手術(shù)，而且具有較高的成功率［8］，且與骨質(zhì)疏松病人臨床癥狀、骨組織結(jié)構(gòu)微觀形態(tài)等方面較相似［9］。本研究2021 年11 月至2022 年2 月通過研究桃紅四物湯對維甲酸誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型的骨量丟失、骨微結(jié)構(gòu)退化、破骨細胞與成骨細胞分化的干預(yù)作用，為桃紅四物湯治療OP提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與儀器仙靈骨葆膠囊（批號2004033，0.5 克/粒）購買自貴州同濟堂制藥有限公司，中性樹膠（批號10004160），購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。鈣黃綠素（批號C7600）、維甲酸（批號A9120）、鹽酸四環(huán)素（批號IT0130）購自北京索萊寶科技有限公司；BMP2 抗體（批號18716101901）、番紅固綠（骨組織）染液套裝（批號G1053）、TRAP 染液套裝（批號G1050）、HE 染液（批號G1005）購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

桃紅四物湯6味藥材中川芎（Ligusticum chuanx?iongHort.，批號201201，四川）購于重慶萬力有限公司；白芍（Paeonia lactifloraPall，批號20200401，安徽）購于杭州振德中藥飲片有限公司；熟地黃（Rehmanniae Radix Praeparata，批號210301，河南焦作）、當(dāng)歸（Angelica sinensis，批號210301，甘肅定西）購于亳州市京皖中藥飲片廠；燀山桃仁［Purnus per?sica（L.）Batsch，批號210117，河北］購于江蘇華洪藥業(yè)科技有限公司；紅花（Carthamus tinctoriusL.，批號200810，新疆）購買于江蘇同濟中藥飲片有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)鄒立思老師鑒定為正品，均符合2015年版《中國藥典》規(guī)定。

小動物Micro-CT 影像系統(tǒng)（micro computed to?mography，SkyScan1176，德國Bruker 公司）。鎢鋼刀、自動切片機、硬組織切片機（SP1600，德國Leica公司），組織包埋機（TEC2800，美國Thermo 公司），正置光學(xué)顯微鏡（Eclipse E100，日本尼康公司），小動物麻醉機（Matrx VIP3000，美國 MATRX 公司），低溫離心機（5417R，德國 Eppendorf 公司），酶標(biāo)儀（Synergy H1，美國 BioTek 公司），分析天平（TB-214型，北京賽托利斯儀器有限公司）。

1.2 動物SPF級4月齡SD雌性大鼠40只，上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。體質(zhì)量（280±20）g。實驗前1 周自由飲食及進食，燈光控制晝夜各12 h，環(huán)境適應(yīng)性培養(yǎng)。許可證號SCXK（滬）2017-0005。灌胃針滅菌后備用。

2 方法

2.1 桃紅四物湯水煎劑的制備桃紅四物湯水煎劑，組分配比為桃仁9 g，紅花6 g，白芍9 g，當(dāng)歸9 g，川芎6 g，熟地黃12 g。酒當(dāng)歸制法為取當(dāng)歸凈片適量，加黃酒拌勻，悶透，文火炒干；其余藥味均依照2015 年版《中國藥典》方法炮制。桃仁去皮尖研泥，與紅花、川芎、白芍、當(dāng)歸、熟地黃一同浸泡40 min，以10 倍量體積水煎煮60 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成生藥量為1.0 g/mL 的溶液備用。前期HPLC 檢測發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯水煎液主要含有阿魏酸、苦杏仁苷、芍藥苷、羥基紅花黃色素A、綠原酸沒食子酸、地黃苷A、梓醇8 種特征性成分，與文獻報道一致［10］。

2.2 分組和給藥50 只4 月齡SD 雌性大鼠隨機分組：每組8只，分別為維甲酸模型組、正常對照組、桃紅四物湯高劑量組（0.4 g/kg）、低劑量組（0.2 g/kg）、陽性藥仙靈骨葆膠囊組（0.4 g/kg）。模型組給予維甲酸70 mg/kg；以蒸餾水為溶媒配制藥液，仙靈骨葆膠囊質(zhì)量濃度為0.04 g/mL，桃紅四物湯質(zhì)量濃度為0.02、0.04 g/mL。每天灌胃一次，連續(xù)給藥30 d。骨組織雙熒光標(biāo)記步驟：實驗終點第13 天和第14 天皮下注射四環(huán)素（30 mg/kg）、第3 天和第4 天皮下注射鈣黃綠素（5 mg/kg）。操作在避光環(huán)境下進行。實驗結(jié)束后，處死大鼠，剔除股骨表面肌肉和結(jié)締組織，浸泡于福爾馬林中，用于后續(xù)Micro-CT 實驗、組織形態(tài)觀察及免疫組化分析。

2.3 大鼠股骨 Micro-CT 掃描大鼠右側(cè)股骨固定清洗后進行Micro CT掃描成像。采用軟件對靜態(tài)參數(shù)骨密度BMD、骨小梁與骨組織面積比Tb.Ar、骨小梁寬度Tb.Th、骨小梁數(shù)量Tb.N、骨小梁分離度Tb.Sp進行測定。

2.4 骨組織形態(tài)計量學(xué)參數(shù)的測定大鼠處死后取股骨暴露骨髓腔后制成8 μm厚切片，熒光顯微鏡下觀察雙熒光，測定動態(tài)參數(shù)：骨礦化表面積MS/BS、雙熒光間平均距離Ir.L Wi、熒光周長L.Le、骨形成率BFR/BS、骨礦化沉積率MAR［11］。

2.5 大鼠股骨H&E 染色、番紅固綠染色各組大鼠股骨脫鈣后切片，進行蘇木素-伊紅（HE）和番紅固綠染色，進行脫水、透明、封片后，顯微鏡下觀察。

2.6 大鼠股骨TRAP 染色觀察破骨細胞取大鼠股骨頭冰凍切片回溫自然晾干，?20 ℃甲醇固定10 min 后流水清洗，滴加適量的TRAP 染色液覆蓋標(biāo)本，常溫放置30 min 后進行清洗、透明、封片。于顯微鏡下觀察股骨組織中破骨細胞數(shù)量。

2.7 大鼠股骨免疫組化分析BMP2 表達選取大鼠股骨組織，固定脫鈣后進行包埋，切片脫蠟、抗原修復(fù)、非特異性封閉、免疫反應(yīng)、DAB 顯色、蘇木精復(fù)染后，于顯微鏡下觀察并拍照，檢測股骨中蛋白表達情況。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法所有實驗數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，統(tǒng)計分析應(yīng)用SPASS 11.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，獨立樣本t檢驗比較兩組間數(shù)據(jù)，單因素方差分析比較多組間數(shù)據(jù)，LSD法應(yīng)用于多組間數(shù)據(jù)兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 桃紅四物湯對大鼠股骨松質(zhì)骨骨小梁微結(jié)構(gòu)的影響Micro-CT 觀察大鼠股骨骨小梁微觀結(jié)構(gòu)，正常組松質(zhì)骨緊密排列，骨小梁結(jié)構(gòu)完整彼此連接，基本無鏤空現(xiàn)象，形成織密的網(wǎng)絡(luò)狀連接；維甲酸模型組松質(zhì)骨骨小梁比較疏散，孔隙較大，骨小梁數(shù)量也明顯少于正常對照組，無規(guī)則排列，結(jié)構(gòu)稀疏；陽性藥組和桃紅四物湯高劑量組（0.4 g/kg）骨小梁立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，骨小梁數(shù)量明顯增加（圖1）。

圖1 Micro-CT觀察桃紅四物湯對大鼠股骨骨小梁微結(jié)構(gòu)的影響：A為正常組；B為模型組；C為仙靈骨葆膠囊；D為桃紅四物湯 0.2 g/kg；E為桃紅四物湯 0.4 g/kg

3.2 桃紅四物湯對骨質(zhì)疏松大鼠股骨松質(zhì)骨計量學(xué)參數(shù)的影響模型組大鼠股骨松質(zhì)骨骨密度低于正常對照組，靜態(tài)參數(shù)（Tb.Ar%、Tb.Th、Tb.N）亦小于對照組，說明維甲酸誘導(dǎo)大鼠骨量丟失嚴(yán)重，骨小梁密度降低；與正常組相比，Tb.Sp增加，以上均符合骨質(zhì)疏松大鼠松質(zhì)骨骨小梁分布特征。陽性藥和桃紅四物湯高劑量組（0.4 g/kg）骨密度顯著提高（P<0.01），Tb.N、Tb.Th、Tb.Ar%均顯著高于模型組（P<0.05），Tb.Sp 明顯低于模型組（P<0.05），和正常組接近（表1）。

表1 基于骨質(zhì)疏松大鼠模型評價桃紅四物湯對松質(zhì)骨骨密度以及靜態(tài)參數(shù)的影響/

表1 基于骨質(zhì)疏松大鼠模型評價桃紅四物湯對松質(zhì)骨骨密度以及靜態(tài)參數(shù)的影響/

注：①與正常組比較，P<0.01。與模型組比較，②P<0.05，③P<0.01。

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與正常組相比，模型組熒光周長L.Le、骨礦化表面積MS/BS、雙熒光間平均距離Ir.L Wi、骨礦化沉積率MAR、骨形成率BFR/BS 均顯著降低（P<0.01），提示維甲酸抑制了大鼠松質(zhì)骨的骨形成，陽性藥和桃紅四物湯高劑量組（0.4 g/kg）顯著提高了熒光周長、骨礦化表面積、雙熒光間平均距離和骨礦化沉積率（P<0.05）（表2）。

表2 基于骨質(zhì)疏松大鼠模型考察桃紅四物湯對松質(zhì)骨動態(tài)學(xué)相關(guān)參數(shù)的調(diào)節(jié)作用/

表2 基于骨質(zhì)疏松大鼠模型考察桃紅四物湯對松質(zhì)骨動態(tài)學(xué)相關(guān)參數(shù)的調(diào)節(jié)作用/

注：①與正常組比較，P<0.01。與模型組比較，②P<0.05，③P<0.01。

?

正常組股骨松質(zhì)骨熒光清晰，分布多，連續(xù)性較高，雙熒光表現(xiàn)明顯，四環(huán)素與鈣黃綠素的間距較寬；模型組外側(cè)鈣黃綠素分布多，內(nèi)側(cè)四環(huán)素表現(xiàn)不明顯，熒光強度明顯減弱，分布彌散、模糊、黯淡；陽性藥組和桃紅四物湯高劑量組（0.4 g/kg）雙熒光表現(xiàn)較強，四環(huán)素與鈣黃綠素間距略寬于模型組；桃紅四物湯低劑量（0.2 g/kg）組熒光分布較少，熒光間距較窄，內(nèi)側(cè)熒光不明顯（圖2）。

圖2 大鼠股骨松質(zhì)骨不脫鈣未染色骨片熒光（× 100)：A為正常組；B為模型組；C為仙靈骨葆膠囊0.4 g/kg；D為桃紅四物湯0.2 g/kg；E為桃紅四物湯0.4 g/kg

3.3 桃紅四物湯對骨質(zhì)疏松大鼠股骨病理變化的影響HE 染色結(jié)果可見正常組骨小梁結(jié)構(gòu)緊密、數(shù)量較多，排列均勻整齊，連續(xù)性好；模型組骨小梁結(jié)構(gòu)被破壞，骨小梁較纖細、部分骨小梁不連續(xù)，有斷裂和鏤空現(xiàn)象、數(shù)目明顯減少、骨小梁之間空隙增大；陽性藥組和桃紅四物湯低劑量組可見一小部分的斷裂骨小梁和無骨小梁骨髓區(qū)；桃紅四物湯高劑量組（0.4 g/kg）骨小梁面積有所增大，數(shù)量有所增加，結(jié)構(gòu)緊密。番紅固綠染色的結(jié)果和HE 染色結(jié)果一致（圖3）。

圖3 桃紅四物湯對骨質(zhì)疏松大鼠股骨病理變化的影響（× 1.5）

3.4 桃紅四物湯對BMP2 表達以及破骨細胞的調(diào)控作用正常組可見骨小梁表面成骨細胞面積較大，與其他組相比，BMP2 陽性表達最高，提示其成骨功能良好，破骨細胞表達水平較低；模型組骨小梁表面和骨邊緣鎖鏈狀排列的成骨細胞明顯較少，其中BMP2 陽性的成骨細胞數(shù)量銳減，多細胞核的破骨細胞表達明顯提高。陽性藥組和桃紅四物湯高、低劑量組骨小梁成骨細胞也呈梭狀排列，BMP2陽性表達的成骨細胞比例明顯升高，破骨細胞表達均低于模型組（圖4）。

圖4 桃紅四物湯對BMP2表達以及破骨細胞的影響(×200)）

4 討論

骨密度（bone mineral density， BMD）是骨骼強度的一個重要指標(biāo)，對評價骨質(zhì)疏松程度、骨折風(fēng)險以及后續(xù)骨質(zhì)疏松癥的治療非常重要［12］。骨組織形態(tài)計量學(xué)和骨微結(jié)構(gòu)能從靜態(tài)和動態(tài)兩方面反映骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展?fàn)顩r［13］，對此類代謝性疾病具有重大意義，有重要的應(yīng)用價值。Micro-CT 結(jié)果顯示，維甲酸組大鼠股骨松質(zhì)骨BMD、Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N 降低，Tb.Sp 增加，提示維甲酸造模后，大鼠股骨骨量流失，骨小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，骨密度顯著降低，骨的微觀結(jié)構(gòu)變差，骨折風(fēng)險增加。雙熒光能夠直觀地表現(xiàn)大鼠成骨細胞的功能狀態(tài)，熒光間距反映礦化沉積率，與骨形成的速度有關(guān)［14］。維甲酸組L.Le、MS/BS、Ir.L Wi、MAR、BFR/BS 均顯著降低，提示成骨細胞功能受到抑制，骨形成速率降低，維甲酸抑制松質(zhì)骨的骨形成，以上結(jié)果表明維甲酸誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型成功。與維甲酸組相比，桃紅四物湯高劑量組大鼠股骨松質(zhì)骨的BMD、Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N 顯著升高，Tb.Sp 下降，骨量丟失的情況得到好轉(zhuǎn)，提示桃紅四物湯組大鼠松質(zhì)骨骨量增加，骨的微結(jié)構(gòu)得到改善。同時，骨形成的動態(tài)參數(shù)L.Le、MS/BS、Ir.L Wi、MAR、BFR/BS 則明顯增加（P<0.05），說明桃紅四物湯能夠促進骨的形成。

骨小梁結(jié)構(gòu)是影響骨強度的關(guān)鍵因素，具有承載負(fù)荷等作用，骨小梁結(jié)構(gòu)的病理變化能夠反應(yīng)骨小梁的生物性能，是評價骨質(zhì)疏松癥等疾病的重要指標(biāo)［15-16］。HE 和番紅固綠染色結(jié)果顯示其維甲酸組股骨骨髓腔變空，骨空泡增多，骨小梁斷裂增多，排列順序紊亂，提示維甲酸組骨組織微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。而桃紅四物湯治療后，大鼠骨小梁分離度減小，骨空泡數(shù)量減少，骨質(zhì)疏松小鼠骨髓內(nèi)容物增加，骨小梁數(shù)量增加。

成骨細胞減少以及破骨細胞異常增生導(dǎo)致兩者比例失調(diào)是骨質(zhì)疏松的重要誘因。病理學(xué)上特征性鑒定破骨細胞常用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）這一標(biāo)志酶［17］，可以比較直觀地反映出破骨細胞的分化程度，是評價骨質(zhì)疏松的一個重要指標(biāo)［18］。骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP 對骨形成有重要調(diào)節(jié)作用，可以誘導(dǎo)成骨細胞分化，其中BMP-2 能夠促進骨形成，對于骨修復(fù)極其重要，有較強的成骨能力［19-20］。維甲酸組破骨細胞功能活躍數(shù)量增加，成骨細胞數(shù)量明顯降低，骨吸收的速度與骨形成的速度無法動態(tài)失衡，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。與維甲酸組相比，桃紅四物湯組TRAP 的表達下降，BMP-2 增多，表明桃紅四物湯能夠抑制破骨細胞的骨吸收活性，促進骨形成，改善骨吸收與骨形成的動態(tài)失衡，防治維甲酸誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松。

研究發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯在骨質(zhì)疏松疾病治療中效果顯著。祝佳音等［7］發(fā)現(xiàn)地塞米松誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型小鼠經(jīng)過桃紅四物湯治療后，骨小梁數(shù)目與粗細程度均有改善、排列整齊、面積占比增加。楊國柱等［21］考察桃紅四物湯對斑馬魚模型的作用，潑尼松可誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松，斑馬魚脊椎骨骼熒光強度經(jīng)桃紅四物湯治療后明顯提高。前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯（0.2、0.4 g/kg）對去卵巢模型的骨質(zhì)疏松大鼠有緩解作用，在本研究中，同等劑量的桃紅四物湯對維甲酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠也有一定的治療作用［22］。根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果，本研究中陽性對照仙林骨葆膠囊的劑量設(shè)定為0.4 g/kg，與文獻報道的有效劑量一致［23］，對維甲酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松亦有一定的逆轉(zhuǎn)作用。

綜上所述，本研究通過維甲酸誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠模型，發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯能夠減少骨量丟失，改善骨微結(jié)構(gòu)退化，在一定程度上糾正骨吸收和骨形成的動態(tài)失衡，起到對骨質(zhì)疏松的干預(yù)和改善作用，為發(fā)現(xiàn)中醫(yī)經(jīng)典名方新作用提供了新的參考依據(jù)。

（本文圖2~4見插圖8-1）