郭躍生，穆嶺，張錕，趙大偉，姚太順

作者單位：洛陽正骨醫(yī)院（河南省骨科醫(yī)院）足踝一科，河南 洛陽 471002

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis， OA）為中老年人常見病癥，是一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，其發(fā)病率隨著年齡增長而升高，70 歲以上的老人患病率高達70%［1］。臨床病理表現(xiàn)主要為關(guān)節(jié)腫痛、關(guān)節(jié)軟骨退化或缺失、關(guān)節(jié)活動僵硬等，嚴(yán)重影響病人日常生活［2］。軟骨組織靠關(guān)節(jié)液進行物質(zhì)交換，一旦受到損傷，靠自身代謝修復(fù)組織功能十分困難［4］。OA發(fā)病機制復(fù)雜，目前臨床仍為保守治療，迫切需要尋找更加安全有效的藥物。蒼術(shù)內(nèi)酯（atractyleno?lide， AT）是分離自中草藥白術(shù)的一種生物活性成分，具有良好的抗炎止痛、祛風(fēng)散寒藥理作用，中醫(yī)學(xué)臨床中常用于治療風(fēng)濕和消化系統(tǒng)疾?。?］。研究表明，AT 可以調(diào)節(jié)炎性因子水平，對細胞增殖和凋亡亦有影響，推測其或?qū)浌菗p傷有積極作用［6］。因此，本研究自2022 年1―4 月建立OA 大鼠模型，探討AT 對軟骨損傷的影響，并分析其可能作用機制，旨在為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF 級SD 大鼠，雄性，60 只，7~8周齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK（京）2016-0011。體質(zhì)量210~230 g。飼養(yǎng)條件設(shè)置為：環(huán)境溫度為20~24 ℃，保持良好通風(fēng)，給予充足飲水和普通飼料，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2 藥品、主要試劑和儀器AT（純度≥98%，上海滬崢生物科技有限公司，批號HZ-22023）；腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白細胞介素-6（in?terleukin-6， IL-6）ELISA 試劑盒（北京雅安達生物科技有限公司）；兔抗β-actin 多克隆抗體、高遷移率族蛋白2（high mobility group proteins，HMGA2）、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthetase kinase，GSK-3β）、凋亡蛋白B 細胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)蛋白（bcl-2 related x protein， Bax）多克隆抗體、山羊抗兔二抗IgG（北京索萊寶科技有限公司）；小動物手術(shù)器械（南京賽博生物技術(shù)有限公司）；石蠟包埋機（徠卡-2018型，賽默飛世爾儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 OA 大鼠模型建立采用前后交叉韌帶斷離術(shù)建立OA模型，選取48只大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉進行麻醉后，固定于手術(shù)臺上，將大鼠左后腿毛剃除并消毒，無菌條件下在左側(cè)膝關(guān)節(jié)髕內(nèi)縱向切開皮膚，暴露出整個膝關(guān)節(jié)，止血鉗鈍性分離結(jié)締組織、血管、肌肉等，顯露前交叉韌帶橫向剪斷，切除1/3 半月板，保留關(guān)節(jié)軟骨面，逐層縫合。手術(shù)完畢給各組大鼠腹腔注射青霉素，預(yù)防感染。術(shù)后3 d 內(nèi)，每日將大鼠放入跑步籠中30 min，觀察大鼠狀態(tài)，大鼠出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)腫脹變形，走路跛行或側(cè)倒，視為建模成功［7］。

1.2.2 分組與給藥造模成功大鼠隨機分為模型組、AT 低、中、高劑量組，各12 只，剩余12 只為對照組。參照文獻［8-9］，AT 低、中、高劑量組腹腔注射給藥5、10、20 mg/kg AT 注射液（生理鹽水配制），對照組及模型組給予等量生理鹽水，每組給藥1 次/天，連續(xù)注射30 d。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 標(biāo)本采集末次給藥后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈采血，4 ℃下3 000 r/min 離心15 min，取血清，?20 ℃保存。脊椎脫臼法處死大鼠，取膝關(guān)節(jié)，分離軟骨組織，剪取部分裝入無菌凍存管內(nèi)，?80 ℃保存?zhèn)溆茫溆嘬浌墙M織置入4%多聚甲醛液固定24 h備用。

1.3.2 大鼠軟骨組織Mankin's 評分光學(xué)顯微鏡下觀察軟骨組織形態(tài)變化，并采用Mankin's 軟骨組織學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)對各組大鼠軟骨組織進行評分，從大鼠軟骨結(jié)構(gòu)、軟骨細胞、潮線評定大鼠軟骨組織病變程度，各部分數(shù)相加為最終得分。評分越高表明OA病變程度越嚴(yán)重，詳細評定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 Mankin's軟骨組織學(xué)評定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.3 血清炎性因子水平檢測取出ELISA試劑盒鋁箔袋，置于室溫1 h 平衡溫度后，按照TNF-α、IL-1β、IL-6 試劑盒說明書操作，主要步驟為：取出相關(guān)板條設(shè)置板孔，分別為樣品孔與標(biāo)準(zhǔn)孔，標(biāo)準(zhǔn)孔加入標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔加入10 μL 待測樣本。再添加40 μL 稀釋液于樣品孔，將100 μL 辣根過氧化物酶標(biāo)記好的檢測抗體加入各板孔中，封膜37 ℃孵育60 min，棄液并使用洗滌液清洗×5 次。將50 μL 底物A、B 液加入板孔，封膜37 ℃孵育15 min。終止反應(yīng)于15 min 內(nèi)在酶標(biāo)儀450 nm 處檢測各板孔光密度（OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品梯度濃度結(jié)果建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣本濃度。

1.3.4 軟骨組織HE 染色觀察取出已固定好的軟骨組織，置于10%EDTA 液中脫鈣，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片機切成薄片（4μm），切片再烘干3 h至水分完全消失。將切片放入二甲苯Ⅰ10 min→二甲苯Ⅱ10 min→無水乙醇Ⅰ5 min→無水乙醇Ⅱ5 min→95%乙醇3 min→80%乙醇2 min→75%乙醇2 min 進行脫蠟復(fù)水，分別經(jīng)蘇木素染色10 min，鹽酸分化1 s，伊紅染液染色2 min，脫水透明，中性樹脂封固。置于光學(xué)顯微鏡下觀察軟骨組織病理變化并拍片。

1.3.5 TUNEL 法檢測軟骨組織細胞凋亡取軟骨組織石蠟切片，二甲苯脫蠟，乙醇脫水，浸入枸椽酸緩沖液盒60 min，PBS 沖洗×3 次，嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒說明書操作，加入顯色劑孵育30 min，PBS 沖洗×3 次，復(fù)染后封片，光學(xué)顯微鏡下移動切片觀察軟骨組織神經(jīng)細胞凋亡情況，選擇5個無重復(fù)視野，觀察棕黃色的凋亡細胞數(shù)，計算凋亡率（凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%）。

1.3.6 RT-PCR 檢測miR-98-5p、HMGA2、GSK-3β mRNA 表達取出軟骨組織，預(yù)冷的PBS 清洗后迅速加入500 μL Trizol裂解液，上下吹打混勻，再加入氯仿、異丙醇，12 000 r/min 高速離心機離心15 min，離心后吸取上清，檢測RNA濃度。使用TAKARA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，配制10 μL逆轉(zhuǎn)錄體系得到cDNA。將得到的cDNA 配制PCR 反應(yīng)體系：正、反向引物各0.8 μL，ROX Refermce Dye Ⅱ 0.4 μL，SYBR Premix Ex Tap 10 μL，cDNA 2 μL，RNase free-ddH2O 6 μL。將配置好的反應(yīng)體系混勻后加入PCR 板，于反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s 下進行40 個循環(huán)。取樣本CT值平均數(shù)，以目的基因相對內(nèi)參的表達量計算各樣本之間基因表達差異，2?ΔΔCT為各樣本基因的表達比較倍數(shù)。反應(yīng)引物序列設(shè)計為miR-98-5p：正 向（5′-TATTGTTGTGGGGTAGGGATT-3′），反向（5′-ATAACTTCACCCCAAAAATCG-3′）；U6：正向（5′-CGTTCACGCATCTTTAAAATTGGA-3′），反向（5′-TTATGCGTGTCATCCTTGCG-3′）。HMGA2：正向（5′-CATTGGAGAAAAACGGCCAAG-3′），反向（5′-TTGCGAGGATGTCTCTTCAGT-3′）；GSK-3β：正向（5′-ATGGCAGCAAGGTAACCACAG-3′），反向（5′-TCTCGGTTCTTAAATCGCTTGTC-3′）；以β-actin 為內(nèi)參，β-actin：正向（5′-GGCTG?TATTCCCCTCCATCG-3′），反向（5′-CCAGTTGGTA?ACAATGCCATGT-3′）。

1.3.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測HMGA2、GSK-3β、Bax、Bcl-2 蛋白表達軟骨組織裂解勻漿，4 ℃下12 000 r/min 離心15 min，吸取上清液使用BCA 蛋白濃度測定盒測定蛋白濃度，按照每組蛋白上樣量20 μL，加入4 倍體積的緩沖液混勻放入恒溫水浴鍋中100 ℃加熱10 min 進行變性，加入配制好的分離膠與濃縮膠，進行SDS-PAGE 凝膠電泳，之后將蛋白轉(zhuǎn)至PD?VF 膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入1∶1 000 稀釋的HMGA2、GSK-3β、Bax、Bcl-2 一抗，4 ℃封閉過夜，TBST 洗膜，加入二抗（1∶5 000），室溫封閉60 min，TBST洗膜，滴加顯影液進行顯影，顯影曝光，分析條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法運用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量數(shù)據(jù)以表示，采用單因素方差分析進行多組間比較，LSD-t檢驗進行兩組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 軟骨組織學(xué)評分比較與對照組（1.71±0.12）分比較，模型組大鼠軟骨組織學(xué)Mankin's 評分（8.62±0.69）分升高（P<0.05）。與模型組比較，AT 低（5.05±0.47）、中（4.68±0.36）、高劑量組（2.15±0.23）大鼠軟骨組織學(xué)Mankin's評分均降低（P<0.05）。與AT 低劑量組比，AT 中、高劑量組大鼠軟骨組織學(xué)Mankin's 評分降低（P<0.05）。與AT 中劑量組比，AT高劑量組Mankin's評分降低（P<0.05）。

2.2 血清炎性因子水平比較與對照組比，模型組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平上升（P<0.05）。與模型組比，AT低、中、高劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低（P<0.05）。與AT 低劑量組比，AT 中、高劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平降低（P<0.05）。與AT 中劑量組比，AT 高劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平降低（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清炎性因子水平比較/（ng/L，）

表2 各組大鼠血清炎性因子水平比較/（ng/L，）

注：TNF-α 為腫瘤壞死因子-α，IL-1β 為白細胞介素-1β，IL-6 為白細胞介素-6。①與對照組比，P<0.05。②與模型組比，P<0.05。③與AT 低劑量組比，P<0.05。④與AT中劑量組比，P<0.05。

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2.3 軟骨組織HE 染色比較結(jié)果顯示，對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)完整，基質(zhì)均勻，表層光滑并無裂隙生成，表層細胞形態(tài)正常、排列整齊，中層細胞呈圓形或圓柱形四散分布，各層細胞均未見破壞；未見炎性細胞浸潤、水腫等現(xiàn)象。模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，表層明顯變薄，形成裂隙深達鈣化層，表層細胞缺失，深層細胞排列紊亂，細胞及細胞核明顯受到壓縮；可見大量炎性細胞浸潤。AT 低、中、高劑量組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)受損現(xiàn)象得到改善，表層逐漸平整，結(jié)構(gòu)基本清晰，偶見微小裂隙，骨細胞及細胞核形態(tài)正常；炎性細胞浸潤現(xiàn)象減少。見圖1。

圖1 軟骨組織HE染色結(jié)果（×200）：A為對照組；B為模型組；C為AT低劑量組；D為AT中劑量組；E為AT高劑量組

2.4 軟骨組織細胞凋亡率比較與對照組（8.41±1.74）%比較，模型組大鼠軟骨組織細胞凋亡率（47.82±4.26）%上升（P<0.05）。與模型組比較，AT低、中、高劑量組大鼠軟骨組織細胞凋亡率［（32.05±2.84）%、（23.68±2.89）%、（12.15±2.13）%］下降（P<0.05）。與AT 低劑量組比較，AT 中、高劑量組大鼠軟骨組織細胞凋亡率下降（P<0.05）。與CA 中劑量組比較，AT高劑量組大鼠軟骨組織細胞凋亡率下降（P<0.05）。見圖2。

圖2 軟骨組織TUNEL染色結(jié)果（×200）：A為對照組；B為模型組；C為AT低劑量組；D為AT中劑量組；E為AT高劑量組

2.5 miR-98-5p、HMGA2、GSK-3β mRNA 水平比較與對照組比較，模型組大鼠軟骨組織miR-98-5p表達水平升高，HMGA2、GSK-3β mRNA 水平降低（P<0.05）。與模型組比，AT 低、中、高劑量組大鼠軟骨組織miR-98-5p 表達水平降低，HMGA2、GSK-3β mRNA 表達水平均升高（P<0.05）。與AT 低劑量組比較，AT中、高劑量組大鼠軟骨組織miR-98-5p表達水平降低，HMGA2、GSK-3β mRNA 表達水平升高（P<0.05）。與AT 中劑量組比，AT 高劑量組miR-98-5p 水平降低，HMGA2、GSK-3β mRNA 水平升高（P<0.05）。見表3。

表3 大鼠miR-98-5p及HMGA2、GSK-3β mRNA水平比較/

表3 大鼠miR-98-5p及HMGA2、GSK-3β mRNA水平比較/

注：HMGA2為高遷移率族蛋白2，GSK-3β為糖原合成酶激酶-3β。①與對照組比，P<0.05。②與模型組比，P<0.05。③與AT 低劑量組比，P<0.05。④與AT中劑量組比，P<0.05。

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2.6 HMGA2、GSK-3β、Bax、Bcl-2 蛋白水平比較與對照組比，模型組HMGA2、GSK-3β、Bcl-2 蛋白水平降低，Bax 蛋白水平升高（P<0.05）。與模型組比，AT 低、中、高劑量組大鼠軟骨組織HMGA2、GSK-3β、Bcl-2 蛋白表達水平升高，Bax 蛋白表達水平降低（P<0.05）。與AT 低劑量組比較，AT 中、高劑量組大鼠軟骨組織HMGA2、GSK-3β、Bcl-2 蛋白表達水平升高，Bax 蛋白表達水平降低（P<0.05）。與AT 中劑量組比較，AT 高劑量組大鼠軟骨組織HMGA2、GSK-3β、Bcl-2 蛋白表達水平升高，Bax 蛋白表達水平降低（P<0.05）。見表4，圖3。

圖3 軟骨組織蛋白檢測

表4 大鼠HMGA2、GSK-3β、Bax、Bcl-2 蛋白水平比較/

表4 大鼠HMGA2、GSK-3β、Bax、Bcl-2 蛋白水平比較/

注：HMGA2為高遷移率族蛋白2，GSK-3β為糖原合成酶激酶-3β，Bax為Bcl-2相關(guān)蛋白，Bcl-2為B細胞淋巴瘤因子2。①與對照組比，P<0.05。②與模型組比，P<0.05。③與AT低劑量組比，P<0.05。④與AT中劑量組比，P<0.05。

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3 討論

關(guān)節(jié)軟骨作為骨與骨之間的聯(lián)合，可將外界對人體的作用力均勻分布，人的所有運動都離不開關(guān)節(jié)軟骨的負荷［10］。研究表明，關(guān)節(jié)炎是在機械和生物因素共同影響下，引發(fā)軟骨基質(zhì)降解、軟骨細胞自身代謝紊亂的退行性疾?。?1］。關(guān)節(jié)軟骨由基質(zhì)與軟骨細胞組成，軟骨組織需靠僅占組織1/10 的軟骨細胞進行正常代謝，所以代謝緩慢和修復(fù)能力低都使OA 難以完全治愈，一旦發(fā)病會將不斷反復(fù)發(fā)作，疼痛難忍［12］。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的醫(yī)治方法主要以非甾性抗炎藥為主，但非甾性抗炎藥對腸胃的毒副作用明顯，因此，尋找更加安全、毒副作用低的藥物對OA臨床治療有著重大意義［13］。

AT 是提取自菊科植物白術(shù)根莖的生物活性成分，是一種倍半萜烯類化合物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實了AT 具有多種藥理活性，包括抗炎、抗病毒、抗?jié)?、保肝及抗腫瘤等［14］。中醫(yī)學(xué)對OA 的研究極為久遠，已有研究發(fā)現(xiàn)，AT 可代替非甾性藥物對軟骨損傷修復(fù)有著良好效用［15］。橫斷前后交叉韌帶和切除半月板造模方法可引起軟骨表面缺失、表層基質(zhì)缺陷、軟骨細胞代謝紊亂等改變，與OA 病人臨床表現(xiàn)十分貼近，是公認的OA 造模方法［16］。故本研究建立OA 大鼠模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠軟骨組織學(xué)Mankin's評分降低，血清TNF-α、IL-1β、IL-6、細胞凋亡率水平上升，表明模型組大鼠軟骨組織受到損傷且伴有炎癥反應(yīng)，在給予不同劑量AT 治療后上述指標(biāo)水平降低，提示AT 可緩解大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)，修復(fù)軟骨損傷。此外，軟骨組織HE 染色和TUNEL 染色結(jié)果也表明軟骨各基層結(jié)構(gòu)受損現(xiàn)象得到改善，細胞腫脹、炎性細胞浸潤現(xiàn)象和軟骨細胞凋亡現(xiàn)象明顯減少，進一步證實AT 可以抑制軟骨細胞的凋亡，對軟骨組織損傷具有修復(fù)作用。

在本研究中，模型組大鼠軟骨組織miR-98-5p表達水平升高，HMGA2 和GSK-3β 基因表達和蛋白表達水平明顯降低，同時研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠促凋亡蛋白Bax 蛋白表達水平升高，且抑凋亡蛋白Bcl-2 表達降低。結(jié)合模型組大鼠軟骨細胞凋亡率升高，表明模型組大鼠軟骨組織受到損傷后，體內(nèi)miR-98-5p 水平驟然升高，HMGA2/GSK-3β 信號通路被激活，細胞凋亡與抑凋亡平衡被打破，導(dǎo)致大量骨細胞凋亡流失。微小RNA（microRNA， miR?NA）是一種由19~25 個核苷酸組成的非編碼小RNA，參與機體內(nèi)細胞增殖、分化、遷移、凋亡等生理過程。miR-98-5p 是miRNAs 家族在腫瘤和骨骼方向倍受關(guān)注的成員之一，其可以通過抑制HM?GA2表達抑制細胞凋亡，GSK-3β是一種多功能絲氨酸/蘇氨酸激酶，可調(diào)節(jié)能量代謝、細胞生長和凋亡，是HMGA2 反向底物和效應(yīng)器［17］。miR-98-5p/HM?GA2/GSK-3β 軸是調(diào)控骨細胞生長的重要通路，在正常的生理狀態(tài)下維持著骨組織的動態(tài)平衡［18］。與模型組比較，AT 各劑量組大鼠軟骨組織miR-98-5p 表達、Bax 蛋白表達水平降低，HMGA2、GSK-3β mRNA 和Bcl-2 蛋白表達水平均升高。結(jié)合大鼠軟骨組織細胞凋亡率變化，可見AT 能夠干擾miR-98-5p 促進HMGA2、GSK-3β 蛋白表達抑制軟骨細胞凋亡，對大鼠軟骨損傷有積極影響。

綜上所述，AT 能夠調(diào)整OA 大鼠血清炎性因子水平，抑制軟骨細胞凋亡，可能是通過干擾miR-98-5p，促進HMGA2、GSK-3β 蛋白表達發(fā)揮作用，為臨床治療OA提供實驗依據(jù)。

（本文圖1，2見插圖8-1）