彭楠，張景楠，陳俊玉，滕景芳，孟明，曹彩霞，王彥

作者單位：1河北大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院、河北大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 保定 071000；

2河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；

3保定市中心血站，河北 保定 071000

恒定自然殺傷T 細(xì)胞（invariant nature kiler T cell，iNKT）是T 淋巴細(xì)胞中一個(gè)獨(dú)特的亞群，可識(shí)別 CD1d 分子呈遞的脂類抗原?；罨蠓置诙喾N細(xì)胞因子，直接或間接參與各項(xiàng)機(jī)體免疫反應(yīng)［1］。iNKT 細(xì)胞在胸腺中分化成不同的亞群，包括iNKT1［主要分泌干擾素-γ（IFN-γ）］、iNKT2［主要分泌白細(xì)胞介素-4（IL-4）］、iNKT17［主要分泌白細(xì)胞介素-17A（IL-17A）］［2］。最新研究證明，特異性激活iNKT 細(xì)胞亞群，可以更有效地發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)和治療的作用，在感染、腫瘤等疾病中，我們希望iNKT細(xì)胞產(chǎn)生促炎性因子的作用，而在自身免疫性疾病時(shí)，我們更希望激活iNKT 細(xì)胞的抗炎性免疫反應(yīng)［3-4］。α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺（α-GalCer ）是iNKT 細(xì)胞特異性激活劑，是已知的最有效的iNKT細(xì)胞選擇性抗原［5］。但是大劑量的α-GalCer 刺激，會(huì)使iNKT細(xì)胞在數(shù)月內(nèi)進(jìn)入免疫失能狀態(tài)，對(duì)后續(xù)的抗原刺激反應(yīng)減弱或無應(yīng)答［6］。

在小鼠肺中，iNKT 細(xì)胞在肺脈管系統(tǒng)和間質(zhì)組織間建立了非循環(huán)群體［7］。大多數(shù) iNKT1 和iNKT2細(xì)胞存在于脈管系統(tǒng)中，iNKT17 細(xì)胞主要存在于組織間質(zhì)［8-9］。呼吸系統(tǒng)的免疫系統(tǒng)承受著巨大的負(fù)荷和種類繁多的外來抗原，引發(fā)多種免疫反應(yīng)［10］。因此研究腹腔注射α-GalCer對(duì)小鼠肺iNKT細(xì)胞、細(xì)胞亞群及外周血細(xì)胞因子的影響，觀察其動(dòng)態(tài)變化，從而為后續(xù)獲得臨床免疫細(xì)胞治療提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)，同時(shí)也可為疫苗的研發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6~8 周齡的雄性C57BL/6J 小鼠，引入SPF 級(jí)動(dòng)物室后，進(jìn)行1周適應(yīng)性飼養(yǎng)，隨后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)已通過河北大學(xué)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)且在操作過程中嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》。

1.1.2 主要試劑與儀器α-GalCer（北京Adipo?Gen）；戊巴比妥鈉、小鼠組織淋巴細(xì)胞分離液、0.5 mol/L EDTA（北京索萊寶）；Foxp3/Transcription Fac?tor Staining Buffer（美國(guó)Invitrogen）；FITC Hamster Anti-Mouse TCR-β Chain、AlexaFluor?647-mouse an?ti-PLZF、BV421 Mouse Anti-Mouse RORγt 、PE-Cy?7 Mouse Anti-T-bet（美國(guó)BD）；T-selected-CD1d tetra?mer-PE（日本MBL）；Mouse-IFN-γ ELISA、Mouse-IL-4 ELISA、Mouse-IL-17A ELISA（聯(lián)科生物，杭州）。Olympus-Ⅱ光學(xué)顯微鏡（日本，Olympus）；流式細(xì)胞儀FACSCantoII（美國(guó)，BD Pharmingen ）；酶標(biāo)儀（美國(guó)，Bio-tek EPOCH）；低溫高速離心機(jī)（美國(guó)，Beck?man公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠模型制備及干預(yù)C57BL/6 小鼠，雄性，每只體質(zhì)量（20±2）g，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組和α-GalCer 干預(yù)組，每組30 只，α-GalCer 干預(yù)組每克體質(zhì)量注射α-GalCer 100 ng，正常對(duì)照組注射同等體積的生理鹽水。于小鼠腹腔注射α-Gal?cer 2、4、6、8、10 d 后，檢測(cè)各組小鼠肺內(nèi)iNKT 細(xì)胞及亞群的變化；在2、6、8 d 后檢測(cè)小鼠外周血細(xì)胞因子的變化。

1.2.2 標(biāo)本的獲取與處理腹腔注射1%的苯巴比妥鈉鹽（50 mg/kg）對(duì)小鼠麻醉后進(jìn)行眼球取血，12 000 r/min，4 ℃離心8 min，收集上清轉(zhuǎn)至EP 管中，?80 ℃冰箱低溫保存用于ELISA 檢測(cè)。隨后脫頸椎處死小鼠，用外科剪及鑷子獲取小鼠的肺組織，小鼠肺臟于浸潤(rùn)冰PBS緩沖液的細(xì)胞篩上剪碎、研磨獲取單細(xì)胞懸液。細(xì)胞經(jīng)PBS 洗滌離心2 次，1 000 r/min，4 ℃離心5 min 獲取細(xì)胞沉淀。重懸后過淋巴細(xì)胞分離液，再次經(jīng)PBS 洗滌離心2 次，棄上清后獲取單細(xì)胞懸液。

1.2.3 小鼠外周血血清細(xì)胞因子的檢測(cè)提前將試劑及樣本平衡至室溫并確定所需的酶標(biāo)板孔數(shù)，按照ELISA 試劑盒說明書規(guī)范操作，檢測(cè)小鼠血清IFN-γ、IL-4和IL-17A 的表達(dá)水平。

1.2.4 肺淋巴細(xì)胞中iNKT 頻率檢測(cè)收集“1.2.2”獲取的單細(xì)胞懸液于流式管中，每管106個(gè)細(xì)胞，加入1 μL FITC Hamster Anti-Mouse TCR-β Chain 和1μL PE 標(biāo)記的負(fù)載α-GalCer 的CD1d 四聚體（PE-α-GalCer/CD1d-tetramer），渦旋混勻4 ℃避光孵育30 min，PBS清洗2次后用500 μL 4 ℃的PBS重懸細(xì)胞，吹打混勻經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)iNKT（TCR-β+α-GalCer/CD1d-tetramer+）細(xì)胞頻率。α-GalCer/CD1d-tetramer為本實(shí)驗(yàn)室配制：采用體積分?jǐn)?shù)為0.5%的吐溫?20 和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的生理鹽水將濃度為1 g/L的α-GalCer 貯存液稀釋至200 mg/L，隨后將5 μL 稀釋液加入到100 μL CD1d-tetramer 中，混勻，室溫過夜負(fù)載18~20 h后于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 肺iNKT1、iNKT2、iNKT17 亞群頻率檢測(cè)同上述1.2.4 小節(jié)所述，加入FITC Hamster Anti-Mouse TCR-β Chain 和PE-α-GalCer/CD1d-tetramer 對(duì)分離的淋巴細(xì)胞進(jìn)行表染，PBS 清洗2 次后，按照Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer 試劑盒說明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透化固定處理，進(jìn)行亞群檢測(cè)。每支流式管中加入1 mL 透化固定液于4 ℃避光透化固定45 min；加入1 mL 1×破膜緩沖液使偶聯(lián)熒光素的抗體充分進(jìn)入細(xì)胞，500g，4 ℃離心5 min；棄上清后加入AlexaFluor?647-mouse anti-PLZF、BV421 Mouse Anti-Mouse RORγt、PE/Cyanine7 Mouse Anti-T-bet 各1μL，吹打混勻后4 ℃避光孵育30 min，每管加入1×破膜緩沖液1 mL，500g，4 ℃離心5 min。棄上清后用500 μL 4 ℃的PBS 重懸細(xì)胞，吹打混勻后上機(jī)檢測(cè)iNKT 細(xì)胞亞群頻率。在淋巴細(xì)胞群中以TCR-β+α-GalCer/CD1d-tetramer+雙陽(yáng)性細(xì)胞群為iNKT 細(xì)胞。在iNKT 細(xì)胞群中，以T-bet+PLZF-為iNKT1 亞群，T-bet-PLZF+為iNKT2 亞群，RORγt+PLZF-為iNKT17亞群。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 24.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，兩組不同時(shí)間點(diǎn)之間比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析，同組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺臟iNKT細(xì)胞頻率及亞群的變化

2.1.1 iNKT 細(xì)胞頻率重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果顯示，組別因素（F=12.61，P<0.001）和時(shí)間因素（F=233.41，P<0.001）對(duì)iNKT 細(xì)胞頻率均有影響，且兩者之間存在交互作用（F=195.53，P<0.001）。組內(nèi)分析結(jié)果顯示，對(duì)照組iNKT細(xì)胞頻率在各時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；α-GalCer干預(yù)組iNKT 細(xì)胞頻率在第4、6、8、10 天明顯時(shí)明顯低于第2 天（P<0.05）；組間分析結(jié)果顯示，α-GalCer干預(yù)組iNKT 細(xì)胞頻率在第2 天時(shí)高于對(duì)照組，第6、8、10 天時(shí)低于對(duì)照組（P<0.05）。見表1。

表1 小鼠肺臟恒定自然殺傷T細(xì)胞頻率變化/（%，）

表1 小鼠肺臟恒定自然殺傷T細(xì)胞頻率變化/（%，）

注：①與第2天相比，P<0.05。②與對(duì)照組相比，P<0.05。

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2.1.2 iNKT1亞群細(xì)胞頻率重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果顯示，組別因素（F=176.04，P<0.001）和時(shí)間因素（F=16.41，P<0.001）對(duì)iNKT1 亞群細(xì)胞頻率均有影響，且兩者之間存在交互作用（F=19.70，P<0.001）。組內(nèi)分析結(jié)果顯示，對(duì)照組iNKT1 亞群細(xì)胞頻率在各時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；α-GalCer 干預(yù)組iNKT1 細(xì)胞頻率在第4、6、8、10 天明顯時(shí)明顯低于第2 天（P<0.05）；組間分析結(jié)果顯示，α-GalCer干預(yù)組iNKT1 亞群細(xì)胞頻率在第2、4、6、8、10 天時(shí)均低于對(duì)照組（P<0.05）。見表2。

表2 小鼠肺臟恒定自然殺傷T細(xì)胞1亞群細(xì)胞頻率變化/（%，）

表2 小鼠肺臟恒定自然殺傷T細(xì)胞1亞群細(xì)胞頻率變化/（%，）

注：①與第2天相比，P<0.05。②與對(duì)照組相比，P<0.05。

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2.1.3 iNKT2亞群細(xì)胞頻率重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果顯示，組別因素（F=108.13，P<0.001）和時(shí)間因素（F=92.97，P<0.001）對(duì)iNKT2 細(xì)胞頻率均有影響，且兩者之間存在交互作用（F=92.93，P<0.001）。組內(nèi)分析結(jié)果顯示，對(duì)照組iNKT2 細(xì)胞頻率在各時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；α-GalCer 干預(yù)組iNKT 細(xì)胞頻率在第4、6、8、10 天明顯時(shí)明顯高于第2 天（P<0.05）；組間分析結(jié)果顯示，α-GalCer 干預(yù)組iNKT 細(xì)胞頻率在第2、4、6、8、10 天時(shí)均高于對(duì)照組（P<0.05）。見表3。

表3 小鼠肺臟恒定自然殺傷T細(xì)胞2亞群細(xì)胞頻率變化/（%，）

表3 小鼠肺臟恒定自然殺傷T細(xì)胞2亞群細(xì)胞頻率變化/（%，）

注：①與第2天相比，P<0.05。②與對(duì)照組相比，P<0.05。

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2.1.4 iNKT17 亞群細(xì)胞頻率重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果顯示，組別因素（F=8.21，P=0.001）和時(shí)間因素（F=43.29，P<0.001）對(duì)iNKT17 細(xì)胞頻率均有影響，且兩者之間存在交互作用（F=38.72，P<0.001）。組內(nèi)分析結(jié)果顯示，對(duì)照組iNKT17 細(xì)胞頻率在各時(shí)間點(diǎn)的差異不大；α-GalCer干預(yù)組iNKT 細(xì)胞頻率在第4、6、8、10 天明顯時(shí)明顯高第2 天（P<0.05）；組間分析結(jié)果顯示α-GalCer 干預(yù)組iNKT 細(xì)胞頻率在第2 天時(shí)均低于對(duì)照組，第4、8 天高于對(duì)照組（P<0.05）。見表4。

表4 小鼠肺臟恒定自然殺傷T細(xì)胞17亞群細(xì)胞頻率變化/（%，）

表4 小鼠肺臟恒定自然殺傷T細(xì)胞17亞群細(xì)胞頻率變化/（%，）

注：①與第2天相比，P<0.05。②與對(duì)照組相比，P<0.05。

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2.2 腹腔注射α-GalCer 后不同時(shí)間引發(fā)血清中細(xì)胞因子的變化重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果顯示，組別因素（F=95.95、10.29、64.29，P<0.001、0.003、<0.001）和時(shí)間因素（F=546.35、6.33、14.87，P<0.001、0.006、<0.001）對(duì)IFN-γ、IL-4、IL-17A 水平均有影響，且兩者之間存在交互作用（F=5.87、26.68、3.43，P=0.007、<0.001、0.046）。組內(nèi)分析結(jié)果顯示，對(duì)照組第6 天和第8 天的IFN-γ 水平低于第2 天，第6天的IL-4水平高于第2天，第6天的IL-17A 水平低于第2 天；α-GalCer 干預(yù)組第6 天和第8 天的IFN-γ和IL-4 水平低于第2 天，第6 天的IL-17A 水平低于第2 天；均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。組間分析結(jié)果顯示α-GalCer 干預(yù)組在第2 天時(shí)IFN-γ 和IL-4水平高于對(duì)照組，IL-17A 水平低于對(duì)照組；在第6天時(shí)IFN-γ 水平高于對(duì)照組，IL-4 和IL-17A 水平低于對(duì)照組；在第8 天時(shí)IFN-γ 水平高于對(duì)照組，IL-17A水平低于對(duì)照組；上述均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表5。

表5 小鼠腹腔注射 α-GalCer后血清中細(xì)胞因子變化統(tǒng)計(jì)/（ng/L，）

表5 小鼠腹腔注射 α-GalCer后血清中細(xì)胞因子變化統(tǒng)計(jì)/（ng/L，）

注：α-GalCer為α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺，IFN-γ為干擾素-γ，IL-4為白細(xì)胞介素-4，IL-17A為白細(xì)胞介素-17A。①與第2天相比，P<0.05。②與對(duì)照組相比，P<0.05。

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3 討論

iNKT 細(xì)胞是連接先天性與適應(yīng)性免疫反應(yīng)的橋梁，其恒定的T 細(xì)胞受體識(shí)別MHC-Ⅰ類分子CD1d 呈遞的糖脂類抗原，從而導(dǎo)致細(xì)胞因子達(dá)到“爆炸性”效應(yīng)反應(yīng)［11］。微環(huán)境的改變也可以調(diào)節(jié)肺中iNKT 細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［12］。iNKT 細(xì)胞活化后可分泌Th1型促炎（如IFN-γ）或Th2型抑炎細(xì)胞因子（IL-4）［13］。iNKT 細(xì)胞在肺組織中雖遠(yuǎn)不如在肝臟中豐富，但其確實(shí)對(duì)于某些肺部疾病產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。例如iNKT 細(xì)胞反應(yīng)迅速，因此在對(duì)呼吸道感染的反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［12］；有研究［14］表明iNKT細(xì)胞在介導(dǎo)氣道高反應(yīng)性（AHR）中發(fā)揮作用。

α-GalCer 能夠與抗原提呈細(xì)胞表面CD1d 分子結(jié)合，提呈給iNKT 細(xì)胞表面的TCR 受體，從而激活iNKT 細(xì)胞，發(fā)揮致炎或抑炎作用，有文章［15-16］報(bào)道，腹腔注射抗原最容易被巨噬細(xì)胞所提呈。

研究［16］表明不同的組織中富含不同的 iNKT 細(xì)胞亞群，例如，在小鼠肝臟中iNKT1細(xì)胞亞群占主導(dǎo)地位，而iNKT17 細(xì)胞主要位于肺、淋巴結(jié)和皮膚中。iNKT2 細(xì)胞分布在肺和脾幾個(gè)部位，但它們?cè)谀c系膜淋巴結(jié)中的含量更為豐富［2］。本項(xiàng)研究數(shù)據(jù)中顯示，小鼠肺臟iNKT1 多于iNKT2，推測(cè)原因可能是由于腹腔注射過程中，藥物導(dǎo)致小鼠肺臟中微生物群發(fā)生改變［12］，具體原因還有待進(jìn)一步探查。

有研究［17］表明，在基礎(chǔ)條件下的肺中，iNKT 細(xì)胞主要存在于脈管系統(tǒng)中，而一小部分存在于間質(zhì)中，我們與其所得結(jié)果結(jié)論一致，腹腔注射α-GalCer后，間質(zhì)中iNKT17 亞群頻率隨時(shí)間而升高，脈管系統(tǒng)中的iNKT1 亞群頻率明顯降低，說明在注入激活劑后，肺iNKT 細(xì)胞遷出脈管系統(tǒng)而進(jìn)入間質(zhì)，這種行為有著有著很強(qiáng)的特異性。

通過對(duì)小鼠不同時(shí)間的動(dòng)態(tài)觀察，我們可以發(fā)現(xiàn)，小鼠肺臟中iNKT 細(xì)胞頻率呈現(xiàn)前期（2 d）升高，后期降低的趨勢(shì)，我們推測(cè)是由于注射α-GalCer 2 d 后再取材檢測(cè)，已經(jīng)錯(cuò)過了小鼠體內(nèi)肺iNKT 細(xì)胞頻率達(dá)到最大的時(shí)間，從而后續(xù)時(shí)間內(nèi)，iNKT 細(xì)胞頻率一直降低；小鼠肺臟中iNKT1 亞群頻率在腹腔注射α-GalCer 后一直處于下降的趨勢(shì)，其中第8天達(dá)到最低值（1.88±0.25）%，這可能是由于肺部的微環(huán)境限制了iNKT1 細(xì)胞亞群的增殖，或者已經(jīng)增殖的iNKT1 細(xì)胞遷至外周所致［11］；小鼠肺臟中iNKT2 亞群頻率一直處于上升的趨勢(shì)，其中第4 天達(dá)到最高值（21.83±0.61）%，這可能是由于正常機(jī)體內(nèi)iNKT1與iNKT2是一種平衡關(guān)系，二者此消彼長(zhǎng)，當(dāng)iNKT1 亞群頻率受到明顯抑制時(shí)，在α-GalCer 的刺激下，iNKT2 增長(zhǎng)，維持機(jī)體的健康；小鼠肺臟中iNKT17 亞群頻率升高，文章表明β-連環(huán)蛋白調(diào)節(jié)iNKT 細(xì)胞分化為 iNKT2 和 iNKT17［18］。因此，可以在一定程度上說明兩種亞群有一定的相關(guān)性，對(duì)肺部炎癥可以產(chǎn)生一定的影響。

iNKT 細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用依賴于細(xì)胞因子的分泌，因此我們也做了相應(yīng)小鼠外周血細(xì)胞因子的變化統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)，腹腔注射α-GalCer 后，IFN-γ 濃度一直處于上升的趨勢(shì)，其中，第2 天升高最明顯（500.45±7.68）ng/L，IFN-γ 主要是由iNKT1細(xì)胞產(chǎn)生的Th1 型細(xì)胞因子，因此我們推測(cè)，腹腔注射α-Gal?cer 以升高小鼠體內(nèi)iNKT1 亞群為主，已有研究報(bào)道，IFN-γ 會(huì)抑制外周血IL-4 的釋放［16］，但本研究顯示，第2 天IFN-γ 與IL-2 均呈升高趨勢(shì)，推測(cè)原因可能與腹腔注射α-GalCer 可以導(dǎo)致小鼠外周血中IL-10 水平增高有關(guān)［19］。IL-17A 被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，研究表明小鼠注射α-GalCer 后會(huì)導(dǎo)致IL-17A 快速而穩(wěn)定地釋放到血液中［20］，而研究數(shù)據(jù)顯示IL-17A含量下降，其原因有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，腹腔注射α-GalCer 可以對(duì)肺部iNKT細(xì)胞及亞群的激活可以產(chǎn)生不同影響。iNKT 細(xì)胞不同亞群發(fā)揮的免疫調(diào)節(jié)與免疫治療作用是不同的，做此項(xiàng)研究可以為日后肺部相關(guān)疾病的細(xì)胞治療提供基礎(chǔ)性研究數(shù)據(jù)。同時(shí)外周血細(xì)胞因子的變化也進(jìn)一步提示了腹腔注射α-GalCer 會(huì)影響機(jī)體的免疫功能。