王孝謙,黃翔鵠,李長玲,張玉蕾,羅國玲,王新宇,張 寧

(1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,廣東 湛江 524088;2. 廣東省藻類養(yǎng)殖及應(yīng)用工程技術(shù)研究中心,廣東 湛江524088)

引 言

富營養(yǎng)化是當(dāng)今世界地表水面臨的主要生態(tài)問題[1]。近年來,富營養(yǎng)化和氣候變化導(dǎo)致的有害藻華(harmful algal blooms,HABs)引起了人們的高度關(guān)注[2-3]。有害藻華給全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)以及漁業(yè)帶來了巨大的損失[4]。銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)是常見的有害藍(lán)藻,其巨大的破壞力受全世界關(guān)注[5]。因此尋找一種安全,高效,經(jīng)濟(jì)的方法去防控有害水華是目前環(huán)境保護(hù)所迫切需要解決的問題[6]。

近年來化感作用對(duì)有害藻華的控制作用受到人們的關(guān)注[7]。植物所分泌的化感物質(zhì),不僅全部都是天然合成,而且能夠自我降解,非常環(huán)保[8]。在水生植物中,蘆葦(Phragmitescommunis),狐尾藻(Myriophyllumspicatum),卜內(nèi)藻(Bornetiasecundiflora),大漂(PistiastratiotesLinn)和大麥秸稈(barleystraw)均有報(bào)道可以抑制銅綠微囊藻的生長[4, 9-12]。波吉卵囊藻(Oocystisborgei)是一種常見于對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘的綠藻,它種群穩(wěn)定,適應(yīng)力強(qiáng)[13],可以有效吸收水體中的重金屬[14],氨氮和亞硝酸鹽[15],對(duì)弧菌和異養(yǎng)菌有一定抑制作用[16],卵囊藻能有效改善水體水質(zhì),保護(hù)養(yǎng)殖動(dòng)物健康。

應(yīng)用有益藻去防控有害藍(lán)藻是一種環(huán)保經(jīng)濟(jì)的手段。因此,本文通過對(duì)波吉卵囊藻和銅綠微囊藻之間的化感作用的研究,為實(shí)際應(yīng)用中利用波吉卵囊藻在穩(wěn)定水體,防控藍(lán)藻水華爆發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻類的培養(yǎng)

銅綠微囊藻(M.aeruginosa)由中國科學(xué)院水生生物研究所提供,波吉卵囊藻(O.borgei)由廣東海洋大學(xué)藻類實(shí)驗(yàn)室提供。將微藻接種于裝有BG11培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,溫度為(25±1)℃,光強(qiáng)70 μmol photons m-2s-1,光暗比12 h∶12 h。每天3次,定期搖勻藻種,以防止藻類壁生長和沉降。以指數(shù)生長期(接種7 d)的藻類為研究對(duì)象。

1.2 波吉卵囊藻與銅綠微囊藻混合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

為了探究銅綠微囊藻與波吉卵囊藻競爭關(guān)系,進(jìn)行混合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。由于預(yù)實(shí)驗(yàn)測量波吉卵囊藻體積約為銅綠微囊藻的4倍,在混合培養(yǎng)的過程中銅綠微囊藻與波吉卵囊藻初始濃度分別為1.5×106cells/mL和3.75×105cells/mL,生物量接種比例為1∶1。以相同初始密度單獨(dú)培養(yǎng)銅綠微囊藻與波吉卵囊藻作為混合培養(yǎng)中對(duì)應(yīng)微藻的對(duì)照。每組三個(gè)平行,每2 d計(jì)數(shù)一次,使用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)。通過比較兩種藻在混合培養(yǎng)與單獨(dú)培養(yǎng)下生長情況的差異,來研究競爭關(guān)系。

1.3 波吉卵囊藻濾液對(duì)銅綠微囊藻生長的影響

接種初始濃度3.75×105cells/mL的波吉卵囊藻,收集培養(yǎng)至指數(shù)生長期(7 d)的波吉卵囊藻濾液。培養(yǎng)液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,收集無藻細(xì)胞濾液。測定其總氮總磷,使用濃縮BG11培養(yǎng)基,將其補(bǔ)齊至標(biāo)準(zhǔn)BG11培養(yǎng)基水平。以波吉卵囊藻濾液培養(yǎng)的銅綠微囊藻為濾液組, BG11培養(yǎng)的銅綠微囊藻為對(duì)照組。

1.4 葉綠素a的測定

為研究波吉卵囊藻濾液對(duì)銅綠微囊藻化感作用的機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)單獨(dú)對(duì)暴露在波吉卵囊藻濾液下銅綠微囊藻的生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定。使用熱乙醇法測定銅綠微囊藻的葉綠素a含量(Chl-a)[17]。以波吉卵囊藻濾液培養(yǎng)的銅綠微囊藻為濾液組, BG11培養(yǎng)的銅綠微囊藻為對(duì)照組。

1.5 TEM(透射電鏡)

收集濾液處理下第6天,及第10天及未經(jīng)濾液處理的銅綠微囊藻細(xì)胞,參考李峰的實(shí)驗(yàn)制備電鏡樣品[18]。樣品切片干燥后,在透射電子顯微鏡(jem 1 400)下進(jìn)行觀察,選取代表性樣品進(jìn)行拍照。

1.6 丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的測定

每2 d收集濾液培養(yǎng)及BG11培養(yǎng)下的銅綠微囊藻細(xì)胞,使用南京建成生物工程研究所的超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒,丙二醛(MDA)測試盒進(jìn)行指標(biāo)測定。嚴(yán)格按照說明書操作。

1.7 數(shù)據(jù)分析

相對(duì)抑制率[19],計(jì)算公式如下:

IR (%) = (1-T/C) × 100%,

式中, IR: 相對(duì)抑制率; T: 實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞生長密度; C: 對(duì)照組的細(xì)胞生長密度。

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件。各組數(shù)據(jù)計(jì)算數(shù)值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,標(biāo)準(zhǔn)偏差采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析,各組間顯著性差異用one-way ANOVA分析,以P<0.05作為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。采用Excel軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 混合培養(yǎng)中波吉卵囊藻對(duì)銅綠微囊藻的影響

通過比較波吉卵囊藻與銅綠微囊藻在混合培養(yǎng)下和單獨(dú)培養(yǎng)下的生長差異,來探討兩者競爭情況。波吉卵囊藻在單獨(dú)培養(yǎng)與混合培養(yǎng)中,都正常生長,生長趨勢一致,在第12天時(shí),波吉卵囊藻在單獨(dú)培養(yǎng)與混合培養(yǎng)的密度分別為6.0±0.4×105cell/mL和5.8±0.2×105cell/mL,沒有顯著差異(圖1-B)。第2天,銅綠微囊藻單獨(dú)培養(yǎng)與混合培養(yǎng)的密度分別為19.6±0.4×105cell/mL和15.5±0.4×105cell/mL,差異顯著(p<0.05),受到一定抑制作用(相對(duì)抑制率為20.6±3.7%),相對(duì)抑制率持續(xù)增大,第12天,相對(duì)抑制率達(dá)49.6±5.6%(圖1-A)。可見,波吉卵囊藻能在保證自身正常生長的情況下,抑制銅綠微囊藻快速生長。

圖1 兩種微藻在單獨(dú)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)中生長的細(xì)胞密度隨時(shí)間變化情況: (A)銅綠微囊藻,(B)波吉卵囊藻

2.2 波吉卵囊藻濾液對(duì)銅綠微囊藻生長及葉綠素a含量的影響

在前6天,各組處理銅綠微囊藻均正常生長,第2—6天,濾液組生長情況顯著好于對(duì)照組(p<0.05),第6天濾液組藻密度到達(dá)峰值7.7±0.7×105cell/mL,第8天,濾液組藻密度下降為6.9±0.7×105cell/mL,對(duì)照組中銅綠微囊藻密度為9.9±0.3×105cell/mL,顯著超過濾液組(p<0.05),相對(duì)抑制率為30.2±1.3%。隨后抑制效果逐漸增強(qiáng),第12天,對(duì)照組和濾液組藻密度分別為25.2±2.0×105cell/mL和5.4±0.8×105cell/mL,相對(duì)抑制率為78.5±5.7%(圖2-A)。

圖2 在波吉卵囊藻濾液中生長的銅綠微囊藻的細(xì)胞密度及葉綠素a隨時(shí)間變化情況:(A)細(xì)胞密度,(B)葉綠素a

前4 d,與生長情況一致,處理組和對(duì)照組中銅綠微囊藻的葉綠素a含量均呈上升趨勢,第4天濾液組高于對(duì)照組,分別為0.55±0.14 μg/L和0.41±0.17 μg/L。第6天開始,對(duì)照組中葉綠素a含量持續(xù)上升,而濾液組中葉綠素a含量開始持續(xù)降低。第12天,對(duì)照組葉綠素a含量為2.2±0.18 μg/L,而濾液組葉綠素a僅為0.3837±0.2μg/L(圖2-B)。

2.3 波吉卵囊藻濾液對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

在透射電鏡的觀察下,正常銅綠微囊藻細(xì)胞,細(xì)胞膜與細(xì)胞壁緊密貼合,類囊體成周邊型排列,排列整齊結(jié)構(gòu)清晰(圖3-A)。而在濾液下生長了6 d的細(xì)胞,質(zhì)壁分離現(xiàn)象明顯,內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊。細(xì)胞表面褶皺,有細(xì)微破損(圖3-B)。處理10 d后的藻細(xì)胞,細(xì)胞結(jié)構(gòu)嚴(yán)重?fù)p壞,細(xì)胞死亡(圖3-C)。

圖3 銅綠微囊藻TEM照片 (A)細(xì)胞原樣,(B)濾液處理下第6天的藻細(xì)胞,(C)濾液處理下第10天的藻細(xì)胞.CW 細(xì)胞壁,Thy 類囊體

2.4 波吉卵囊藻濾液對(duì)銅綠微囊藻MDA含量及SOD活性的影響

如圖4-A所示,在濾液下培養(yǎng)的銅綠微囊藻,在前4天 SOD活力上升,高于對(duì)照組,第4天濾液組SOD酶活性達(dá)到峰值,為26.1±1.7 U/mgprot,顯著高于對(duì)照組(15.9±0.5 U/mgprot)。而第6天其SOD活力出現(xiàn)大幅度下滑,并之后一直穩(wěn)定在較低水平,對(duì)照組則是一直處于穩(wěn)定水平的波動(dòng),第12天,對(duì)照組和濾液組差異顯著,分別為13.7±0.2 U/mgprot和3.7±0.8 U/mgprot。

圖4 波吉卵囊藻濾液對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)SOD活性及MDA含量的影響:(A)SOD活力,(B)MDA含量

MDA是描述細(xì)胞膜脂過氧化程度的重要指標(biāo),如圖4-B所示,濾液組在前4天,與對(duì)照相比出現(xiàn)顯著差異(p<0.05),高于對(duì)照組。濾液組中MDA含量在第6天達(dá)到峰值,為4.3±0.3 μmol/mgprot,顯著高于對(duì)照組1.8±0.3 μmol/mgprot(p<0.05)。但在第8天以后開始下降,但仍高于對(duì)照組中含量,第12天,濾液組和對(duì)照組中MDA含量分別為2.1±0.4 μmol/mgprot和1.2±0.2 μmol/mgprot,差異顯著(p<0.05),濾液組MDA含量雖然不及峰值(第6天),仍顯著高于初始值1.6 μmol/mgprot。

3 討論

3.1 波吉卵囊藻與銅綠微囊藻的混合培養(yǎng)

銅綠微囊藻(M.aeruginosa)是一種常見的有害藍(lán)藻,它能分泌藻毒素和異味物質(zhì),由它引起的有害水華,不僅嚴(yán)重破壞水體環(huán)境,危害養(yǎng)殖動(dòng)物,對(duì)漁業(yè)水產(chǎn)業(yè)造成巨大損失,甚至嚴(yán)重威脅人類的健康安全[4, 20]。波吉卵囊藻(O.borgei)則是能維持池塘穩(wěn)定的有益藻。藻類的競爭關(guān)系,能夠影響水體的群落結(jié)構(gòu)及生態(tài)多樣性[21],因此,了解兩種藻之間的競爭關(guān)系是很有必要的。張晶晶等[22]通過混合培養(yǎng)試驗(yàn)指出,在一定營養(yǎng)條件下小球藻能在與銅綠微囊藻的競爭中取得優(yōu)勢。晁建穎等[23]研究指出,銅綠微囊藻和斜生柵藻在混合培養(yǎng)中相互抑制。

本實(shí)驗(yàn)混合培養(yǎng)中,銅綠微囊藻受到了一定程度的抑制(圖1-A),而波吉卵囊藻雖然生長速度輕微減慢,但并沒有受到顯著抑制(圖1-B)。綠藻本身就有應(yīng)對(duì)不良條件的應(yīng)激機(jī)制,應(yīng)對(duì)銅綠微囊藻脅迫,小球藻可以通過增加胞內(nèi)和胞外多糖,來保證正常生長[24]。波吉卵囊藻自身具有很強(qiáng)的抗逆性[14],它具有較厚的細(xì)胞壁與粘性被膜[18],可以適應(yīng)外部環(huán)境的脅迫。銅綠微囊藻的比表面積大,在營養(yǎng)競爭中存在更大優(yōu)勢[23]。波吉卵囊藻單體體積大,比表面積小,但可以通過化感作用來取得競爭優(yōu)勢[17]。結(jié)果表明,波吉卵囊藻能在保證自身正常生長的情況下,抑制銅綠微囊藻生長,具有防控銅綠微囊藻水華的作用。

3.2 波吉卵囊藻濾液對(duì)銅綠微囊藻的生長及葉綠素a含量的影響

1949年,Hasler首次發(fā)現(xiàn)了水生植物可以通過化感作用抑制藻類生長,此后,人們投入了大量研究,去探尋水生植物化感作用的機(jī)制及有效化感物質(zhì)[25-26]。光合作用是微藻最基本最重要的生命代謝活動(dòng),光合作用中關(guān)鍵的類囊體膜及其表面的光合色素,因含有不飽和多烯結(jié)構(gòu)極易受到ROS攻擊[27],葉綠素a是大部分微藻進(jìn)行光合作用所必須的光合色素,其含量的高低可以反映光合作用強(qiáng)度,也可以衡量其受脅迫的程度[28-30]。華權(quán)[31]研究指出,水稻秸稈的浸提液能夠有效抑制銅綠微囊藻生長,阻止葉綠素a的合成。朱傳雪等研究指出,荷花種植水能夠破壞藍(lán)藻光合系統(tǒng),有效抑制巢湖藍(lán)藻的生長。

本試驗(yàn)中,前4 d,實(shí)驗(yàn)組葉綠素a含量及藻密度均高于對(duì)照組,而之后迅速降低(圖2),這種短期的生長激發(fā)可能是微藻應(yīng)對(duì)脅迫的一種保護(hù)機(jī)制,孫春蕾[32]的研究中,在水華魚腥藻濾液下的銅綠微囊藻也出現(xiàn)相同情況。長期(>4 d)暴露在濾液中,銅綠微囊藻的葉綠素a含量和藻密度呈下降趨勢,且顯著低于對(duì)照組(p<0.05),這與大多數(shù)學(xué)者的濾液抑制研究結(jié)果一致[19, 31, 33]。這說明波吉卵囊藻濾液能夠抑制銅綠微囊藻的生長,影響葉綠素a的正常合成,破壞其光合系統(tǒng)。

3.3 波吉卵囊藻濾液對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡(TEM)具有極高的分辨力,被廣泛應(yīng)用生物學(xué)研究,可以很好觀察微生物超微結(jié)構(gòu)的變化[34]。鄭賓國[35]通過電鏡觀察指出,γ射線能夠使氧化物質(zhì)溶解銅綠微囊藻類囊體,從而抑制其生長。生物膜是生物抵御外界脅迫的第一屏障[36]。師玥等[37]通過電鏡研究指出,脅迫狀態(tài)下,生物膜極易受氧自由基攻擊而損傷。本實(shí)驗(yàn)中,未經(jīng)過處理的微囊藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,片層橫紋結(jié)構(gòu)的類囊體,排列整齊清晰(圖3-A),與鄭賓國[35]實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。經(jīng)過卵囊藻濾液脅迫處理6 d之后,銅綠微囊藻表面褶皺,出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象(圖3-B),與Kong等[38]實(shí)驗(yàn)中綠微囊藻的情況相似。第10 d,細(xì)胞完全破裂,細(xì)胞死亡(圖3-C)。結(jié)果說明,銅綠微囊藻在濾液脅迫下,細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)尤其是膜結(jié)構(gòu)受損,最終導(dǎo)致細(xì)胞的衰亡。

3.4 波吉卵囊藻濾液對(duì)銅綠微囊藻SOD活性及MDA含量的影響

SOD酶系統(tǒng)是微藻的主要酶防御系統(tǒng)之一,它可以清除多余的活性氧來保證細(xì)胞的健康[39]?？宗S等[40]研究指出,在脅迫狀態(tài)下,藻類的SOD酶活短期會(huì)上升。張欣[41]研究指出,當(dāng)藻體的抗氧化酶系統(tǒng)受到損害,SOD活性也會(huì)下降。MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物,細(xì)胞膜受到氧自由基攻擊會(huì)導(dǎo)致MDA積累,MDA含量可以反映細(xì)胞膜被破壞的程度[42]。李延等[43]的研究發(fā)現(xiàn),兒茶酚脅迫下的銅綠微囊藻,細(xì)胞凹陷并出現(xiàn)空洞,MDA含量持續(xù)增長。本實(shí)驗(yàn)中,SOD前4 d升高,至第6 d迅速下降(圖4-A),與張睿等[44]結(jié)果一致。說明卵囊藻濾液對(duì)銅綠微囊藻有脅迫性作用,使其產(chǎn)生過量的活性氧,脅迫長時(shí)間持續(xù)能導(dǎo)致其抗氧化酶系統(tǒng)受損。前6天 MDA含量持續(xù)增高(圖4-B),SOD活性下降的情況與張欣等[41]及Meng等[45]一致。第6天超微結(jié)構(gòu)的變化,協(xié)同證明了細(xì)胞膜受到損傷。第6天以后,MDA含量開始降低(圖4-B),可能是因?yàn)榧?xì)胞膜破損導(dǎo)致的MDA外流,這種情況與華權(quán)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[31]。這說明,波吉卵囊藻濾液能夠?qū)︺~綠微囊藻造成持續(xù)脅迫,從而迫使其產(chǎn)生超量的氧自由基,長時(shí)間脅迫下抗氧化酶系統(tǒng)損壞,使細(xì)胞膜受到氧化損傷。

3.5 波吉卵囊藻化感作用防控藍(lán)藻水華的應(yīng)用及展望

藍(lán)藻水華的形成,是一個(gè)長期的過程,當(dāng)藍(lán)藻種群密度達(dá)到一定臨界值才會(huì)爆發(fā)[46-47]。本實(shí)驗(yàn)中,單獨(dú)培養(yǎng)的銅綠微囊藻也是積累到一定濃度才快速爆發(fā)生長(圖1-A)。抑制藍(lán)藻的生長速度,可以有效阻止水華的形成。物理除藻法,雖然短期除藻效率高,但是成本高,規(guī)模小[48]?；瘜W(xué)法也有不錯(cuò)的除藻效果,但是對(duì)環(huán)境的危害大,有益的微生物群體也被清除,對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物的健康威脅大,而且也不能根除藍(lán)藻[49]。藍(lán)藻爆發(fā)的根本原因就是富營養(yǎng)化造成的水環(huán)境失衡,生物法雖然短期見效慢,但是其對(duì)環(huán)境的影響小,且培育的有益微生物能夠吸收多余的氮磷,對(duì)藍(lán)藻的控制持續(xù)時(shí)間長,不會(huì)破壞生態(tài)平衡,可以從根本上解決問題[44]。已有研究證明了利用小球藻、芽孢桿菌防控藍(lán)藻的可行性[44, 50]。小球藻雖然可以防控藍(lán)藻形成,但自身生長速度快,容易倒藻,對(duì)養(yǎng)殖池塘造成危害[17]。波吉卵囊藻相較于小球藻更加穩(wěn)定,且具有吸收氨氮及重金屬,抑制弧菌,促進(jìn)對(duì)蝦生長等優(yōu)點(diǎn)[14-15, 51-52]。本研究證明了波吉卵囊藻對(duì)銅綠微囊藻在等生物量的情況下具有顯著的抑制作用,單獨(dú)培養(yǎng)的波吉卵囊藻濾液對(duì)銅綠微囊藻也有顯著的化感抑制作用。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程前期,投入養(yǎng)殖生物前,利用物理和化學(xué)方法殺滅水中的有害生物,然后定向培育波吉卵囊藻,波吉卵囊藻作為池塘優(yōu)勢種時(shí),最高時(shí)占浮游植物總量99.85%,種群可持續(xù)40～45天[13],可以長時(shí)間防控藍(lán)藻。定向培育卵囊藻的技術(shù)也較為成熟,已有研究報(bào)道了卵囊藻養(yǎng)蝦的可行性及優(yōu)勢[52]。波吉卵囊藻易沉降的特點(diǎn),使其容易濃縮收集[53],在無法提前定向培養(yǎng)卵囊藻的情況下,也可以嘗試使用濃縮藻種。雖然目前對(duì)波吉卵囊藻化感作用的研究取得一定進(jìn)展,但具體成果仍局限于實(shí)驗(yàn)室,缺少大量生產(chǎn)應(yīng)用實(shí)驗(yàn)的支持。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,銅綠微囊藻被抑制的主要原因很可能是過量氧自由基導(dǎo)致的細(xì)胞膜氧化損傷,在細(xì)胞膜受損的情況下,微藻的衰亡是必然的。然而,其具體的誘發(fā)機(jī)制尚不明確,有效化感物質(zhì)也沒能成功分離鑒定,值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)證明,波吉卵囊藻與銅綠微囊藻之間存在競爭關(guān)系,培養(yǎng)12 d后,波吉卵囊藻可以有效抑制銅綠微囊藻生長,相對(duì)抑制率為49.6±5.6%,銅綠微囊藻對(duì)波吉卵囊藻抑制效果不顯著(p>0.05)。波吉卵囊藻對(duì)銅綠微囊藻有顯著的化感作用,能夠抑制銅綠微囊藻的生長,在波吉卵囊藻濾液脅迫狀態(tài)下,銅綠微囊藻產(chǎn)生過量的氧自由基,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞,抗氧化系統(tǒng)受損,葉綠素a停止積累,光合系統(tǒng)損壞。通過提前定向培育波吉卵囊藻,可以有效防控微囊藻水華爆發(fā),維持水體的穩(wěn)定。