韋秀穎　杜泓明　覃紹敏　劉金鳳　吳健敏

摘要：蝦肝腸孢子蟲?。℉epatopancreatic microsporidiaosis，HPM）是由蝦肝腸孢子蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，

EHP）感染引起的一種蝦類專性細胞內(nèi)寄生的寄生蟲病。近年來該病在全世界對蝦養(yǎng)殖區(qū)域內(nèi)廣泛流行，造成對蝦生長緩慢綜合癥（MSGS），損失堪比白斑綜合癥病毒?。╓SSV），嚴重影響對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康與持續(xù)發(fā)展，引起了廣泛關注。本文就HPM的病原、流行情況、傳播途徑、預防與檢測手段及相關藥物研究進展進行綜述，以期為HPM防控提供參考。

關鍵詞：對蝦；蝦肝腸孢子蟲；預防與檢測；藥物研究

中圖分類號：S851.34+7.34文獻標識號：A文章編號：1003-4374（2023）02-00-05

Research Progress on Hepatopancreatic Microsporidiaosis and Its Control Methods

Wei Xiu-ying Du Hong-ming Qin Shao-min Liu Jin-feng Wu Jian-min

（1. Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology， Guangxi Veterinary Research Institute， Nanning， Guangxi 530001， China； 2. College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004， China）

Abstract： Hepatopancreatic microsporidiaosis is an obligate intracellular parasitic disease of penaeid caused by Enterocytozoon hepatopenaei infection. In recent years， the disease has been widely prevalent in important penaeid farming areas around the world， causing Monodon Slow Growth Syndrome （MSGS）， and the loss has been comparable to with White Spot Syndrome Virus （WSSV）， seriously affecting the health and sustainable development of the penaeid farming industry， which has caused widespread concern. In this paper， the pathogen， epidemic situation， transmission route， prevention and detection methods， and related drug research progress of HPM are reviewed in order to provide a reference for the prevention and control of HPM.

Key words： penaeid， enterocytozoon hepatopenaei， prevention and detection， drug research

蝦肝腸孢子蟲（EHP）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種對對蝦養(yǎng)殖行業(yè)危害較大的寄生蟲病病原，最早于2003年在泰國生長緩慢的斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）中被發(fā)現(xiàn)，直至2009 年才被成功分離，并被定義為孢子蟲屬的一個新物種。［1］EHP隸屬于真菌界（Fungi kingdom）［2］微孢子蟲門（Microspora）單倍期綱（Haplophase）微孢子蟲目（Microsporida）微孢子蟲科（Enterocytozoonidae）腸孢蟲屬（Entero-cytozoon）［3］，是一種專性的細胞內(nèi)寄生蟲，具有高度的傳染性。EHP可感染真核細胞宿主，在宿主細胞質中生活，無需中間宿主。它既可通過受精卵或種苗垂直傳播［4］，又可通過攝食被污染的飼料、生物餌料、死蝦及生活在含有EHP孢子的水體中造成水平傳播，該病原主要侵染凡納濱對蝦、南美白對蝦、斑節(jié)對蝦、日本對蝦、羅氏沼蝦和南美藍對蝦（P.stylirostris）導致肝腸孢子蟲病，俗稱 “棉蝦病”。EHP主要寄生于蝦肝胰腺上皮細胞，使肝胰腺小管上皮細胞與小腸上皮細胞脫落，肌肉發(fā)白，導致蝦生長緩慢，增重停滯，雖不引起死亡，卻極大影響生產(chǎn)性能，造成嚴重經(jīng)濟損失。本文就HPM的病原、流行情況、傳播途徑、預防與檢測手段及相關藥物研究進展進行綜述，以期為HPM防控提供參考。

1 EHP形態(tài)特征

EHP成熟的孢子呈卵圓形或梨形，大小約0.7μm×1.1μm。孢子在包囊內(nèi)生長發(fā)育，由胞壁、錨定盤、孢原質、5～6圈極絲、細胞核、極膜層、多個核糖體、1個后液泡等組成。孢子具有折光性，革蘭氏染色為陽性［1］。胞壁由3層結構組成，從外到內(nèi)依次為高電子密度外壁，以及由蛋白質和幾丁質組成的低電子密度的內(nèi)壁和原生質膜。EHP外壁上有大量白色瘤狀物，疑似胞壁蛋白［5］。該蛋白在微孢子蟲侵染宿主細胞的過程中扮演著重要的角色［6-8］，與孢子壁的通透性相關，很可能是控制孢子與外界物質交換的通道。微孢子蟲的孢子內(nèi)具有獨特的侵染裝置—極管，與孢子頂端的錨定盤相連接。它能通過擠壓穿透宿主細胞膜，將具感染性孢子體轉移到宿主細胞中從而實現(xiàn)自身繁殖。［9］

2 流行情況與傳播途徑

自2003年泰國首次報道以來，多數(shù)對蝦養(yǎng)殖國家如印度、文萊、越南、委內(nèi)瑞拉、印度尼西亞、馬來西亞、泰國、澳大利亞等均陸續(xù)發(fā)現(xiàn)EHP的感染［10-12］。中國首次報道是在2013年，隨后在主要的對蝦養(yǎng)殖區(qū)域先后都發(fā)現(xiàn)EHP的流行。陳祿芝等［13］針對粵西地區(qū)凡納濱對蝦長不大的情況進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)EHP的陽性檢出率為41.38%，其中成蝦的檢出率最高達93.75%。許杰等［14］于2015—2017年在天津7個對蝦養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)采集對蝦及餌料生物等樣品進行分批檢測，結果三年EHP陽性率分別為56.96%、69.52%、29.28%。據(jù)2017年國家蝦蟹產(chǎn)業(yè)技術體系開展的被動監(jiān)測結果顯示，EHP已在我國蝦類主要養(yǎng)殖區(qū)廣泛分布，在山東、河北、江蘇、上海、浙江、福建、廣東、海南和新疆均有不同水平的檢出。［15］全國水產(chǎn)技術推廣總站于2017年將EHP列為新發(fā)的重大水生動物疫病，要求重點防控。許昊川等［16］在2020年對浙江省寧波市南美白對蝦蝦苗主要病原攜帶情況進行調查，發(fā)現(xiàn)EHP、蝦血細胞虹彩病毒（SHIV）、WSSV以及副溶血弧菌（VP）4種病原中感染率最高為EHP（8.96%）。謝艷輝等［17］在2021年對湛江地區(qū)養(yǎng)殖水體（高位池和低位池）EHP感染情況進行檢測，結果均為陽性。2021年國家水生動物疫病檢測計劃中也把EHP列為檢測對象［18］，由此說明目前為止EHP仍然是對蝦養(yǎng)殖中最主要的疫病之一。

蝦腸肝孢子蟲病一年四季都會發(fā)生，5～9月是高發(fā)季節(jié)。由于EHP生活史較為簡單，整個生命周期僅為5～11 d，因此，一旦有對蝦染病很快會引起暴發(fā)流行，通常在養(yǎng)殖40 d左右會出現(xiàn)1個暴發(fā)的高峰期。對蝦感染EHP時其死亡率與正常蝦沒有顯著差異，但會出現(xiàn)攝食減少或者攝食后生長緩慢甚至停止生長的情況。此外病蝦還表現(xiàn)出免疫功能下降，增加了細菌、病毒和其他微生物的繼發(fā)感染的概率。EHP 有兩種傳播途徑：一種是垂直傳播，即通過侵染親蝦的卵巢傳播給子代。另一種是水平傳播，即健康蝦經(jīng)口攝食攜帶EHP的介體，包括寄生EHP的鮮活餌料、病蝦、死蝦或環(huán)境中的孢子體而感染。［19］EHP先在蝦肝胰腺細胞內(nèi)形成孢原質，待孢子成熟，可通過糞便排出體外，在水環(huán)境中形成孢子體，分布于水體或附著于飼料表面、藻類、碎屑及養(yǎng)殖塘底泥環(huán)境中，孢子可在養(yǎng)殖環(huán)境中累積進行傳播。

3 檢測手段與防治方法

EHP感染隱蔽性強，無特定示病癥狀，當蝦出現(xiàn)采食減少、增重緩慢、生長遲緩時應該懷疑感染EHP。關于EHP檢測可用組織病理學方法、原位雜交技術（In situ hybridization，ISH）與分子生物學技術等。

組織病理學方法：可取蝦肝胰腺進行切片，用HE染色，但該染色法對孢子的染色效果較差、與背景顏色對比不明顯且單個視野檢出率較低；如用熒光染色劑（calcofluor white，CFW），能使孢子發(fā)出白色熒光，可明顯檢出［20］；用Masson染色可看到蝦肝腸孢子蟲被染成紅色，而蝦腸細胞則被染成藍色，鏡下對比明顯，更易檢出［21］，這類方法的缺點是麻煩、耗時長且難以區(qū)分EHP與其他微孢子蟲。

原位雜交技術：利用帶有地高辛標記的EHP-18S rRNA探針建立了地高辛標記核酸探針原位雜交法，可以特異性檢出EHP感染且可以定位［19］，該方法不足之處操作仍比較繁瑣。

分子生物學技術：主要有PCR、Nested PCR、熒光定量 PCR（qRT-PCR）、LAMP等，這些技術具有靈敏度高、特異性強的特點?？刹杉r的肝胰腺勻漿或糞便進行檢測。而近期建立的重組酶介導的核酸技術（Recombinase-aid-amplification，RAA）［22］，除了特異、敏感外還具有操作簡便、快捷、低成本的優(yōu)點，非常適用于基層及現(xiàn)場EHP的檢測。

對于蝦疫病原微生物采取早期檢測，從而盡快切斷重大和新發(fā)病原的傳播，被認為是當前水產(chǎn)養(yǎng)殖中降低病原流行風險，減少病害大面積流行造成嚴重經(jīng)濟損失的有效手段。由于目前還沒有特效藥物用于EHP治療，因此在養(yǎng)殖過程中預防與控制顯得尤為重要。首先從蝦種源控制。購買SPF蝦苗并用PCR等方法檢測蝦糞，陰性者方可引入生產(chǎn)（SPF級蝦還未將蝦肝腸孢子蟲檢測納入標準）。其次做好養(yǎng)殖環(huán)境控制。蝦塘有機質越多，患孢子蟲病的風險越高，因此在放蝦苗前要徹底清塘消毒。用2.5%的氫氧化鈉浸泡飼養(yǎng)池3小時后沖洗，干燥7 d，再用含有效氯200 ppm以上的氯溶液（pH<4.5）沖洗，方可開始養(yǎng)殖。亦可用生石灰以0.6 kg/m²的用量混入池底加水淋濕，使池塘底pH值升至12，靜置一周可有效殺滅大部分EHP。禁止用生餌料喂蝦苗（如必須使用，需在-20℃冷凍至少48小時）［23］。

養(yǎng)殖廢水不能直接排放，必須經(jīng)過嚴格處理。生物類產(chǎn)品應經(jīng)過75℃，1分鐘以上加熱能使EHP孢子滅活，使EHP失去感染能力［23］，用15 mg/L高錳酸鉀、65%有效氯或20%乙醇處理養(yǎng)殖池水15分鐘均可減少、抑制EHP極絲釋放。

4 EHP相關藥物的研究

盡管世界上科學家們對EHP治療藥物進行了大量研究，但是由于EHP具有幾丁質的孢子壁，有很強的抗逆性，一般藥物很難穿透孢子壁殺滅孢子，到目前為止尚未找到一種低廉、安全、高效可以治療蝦肝腸孢子蟲病的藥物，使EHP防治成為一個難題。

雖然Tang等［12］嘗試用對微孢子蟲有一定作用的煙曲霉素（Fumagillin-B）治療EHP，結果發(fā)現(xiàn)對EHP無效，但是相關藥物研究還是取得一定進展。Aldama-cano等［9］通過體外研究表明，低溫及用高錳酸鉀（15 mg/L）等化學物質處理，可以通過抑制極管的彈出而有效抑制EHP。Jaroenlak等發(fā)現(xiàn)［24］，EHP能夠利用肝素結合蛋白（EhSWP1）與對蝦肝胰腺細胞的肝素結合從而入侵細胞。這種入侵方式與克氏錐蟲、瘧原蟲和利什曼原蟲相似。因此構建針對肝素結合蛋白的抗體可以減少一部分孢子黏附［25，26］，更深入研究還待進一步實驗。趙若恒［27］

將明膠作為包裹材料對17種潛在控制EHP藥物進行篩選，結果篩選出4種能降低EHP載量的藥物。周志剛等［28］利用分子生物學技術克隆表達來源于氣單胞菌（Aeromonas sp）的ChiCD3幾丁質酶，該酶具有降解幾丁質的活性，并可以破壞粘孢子蟲孢子壁，可以用于防治粘孢子蟲病，特別是魚類的粘孢子蟲病。此外科學家們也利用中草藥防治EHP，進行了大量的試驗。高永剛等［29］以苦楝、貫眾、百部、雷丸、青葙子、鉤吻、檳榔為主要成分，預防與治療EHP取得一定效果。姜宗然等［30］用苦參、貫眾、雷丸配伍保肝健脾胃藥物，先通過納米低溫破壁技術粉碎藥物，再添加乳酸桿菌發(fā)酵，最后將得到的發(fā)酵產(chǎn)物用復合酶分解后，再添加天然蝦青素、葡萄糖醛酸內(nèi)酯以提高對EHP免疫力。江曉等［31］以阿苯達唑、青蒿粉和膽汁酸為主要成分合成飼料添加劑，各組分協(xié)同驅殺EHP，以期達到提高蝦成活率、體長和體重，并降低EHP陽性率的目的。

此外李宗全［32］報道一種綜合防治的方法：開足增氧設備，降低水位至30～40 cm，撈出死蝦。用銀花、五倍子、青蒿末煮沸20分鐘后全塘潑灑。4%甘草、3‰維生素C、維生素B10、鈣片、3‰鹽酸土霉素、左旋咪唑適量混合拌料投喂。6小時后注入20 cm高的新水，用低壓電網(wǎng)去除網(wǎng)衣全池拖動，來回2～3次，2小時后加水至原水位，12小時后重復2～3次，可有效控制EHP感染等。上述研究為EHP預防與治療打下了良好的基礎，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中具有很好的應用前景。

5 展望

近年來有關EHP診斷技術的研究已經(jīng)取得顯著的進展，但防治技術的研究進展相對緩慢。由于EHP抗原成分復雜且抗原性弱，較難制成高效疫苗，人們逐漸把眼光放到藥物防治，但藥物防治目前最大的難點是EHP有細胞壁，且細胞壁外有厚厚的幾丁質包裹并寄生于宿主細胞內(nèi)，對環(huán)境抵抗力強，外源藥物對其作用甚微；其次對蝦生活于水中，常規(guī)飼料混合給藥方式在水中會由于溶解擴散作用而導致療效大大減弱甚至消失；注射給藥在對蝦養(yǎng)殖中由于操作繁瑣且死亡率高，所以一般較少使用，體外用藥或飲水給藥對水環(huán)境副作用大，不利于水產(chǎn)養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展。鑒于上述原因，有關防治藥物的研究除了要篩選針對性藥物、設計合理的劑型之外，還需研發(fā)合適的藥物包裹技術以增加藥物攝入量，降低藥物在水中損耗。隨著科技技術的發(fā)展，近年來利用分子生物學、生物信息學及免疫學等技術進一步探索EHP侵染宿主的分子機制，篩選和鑒定其黏附、侵染宿主細胞、調節(jié)細胞周期和免疫反應等相關的關鍵蛋白的研究也在不斷深入，期待不久的將來針對EHP侵染宿主細胞關鍵蛋白的靶向抑制藥物開發(fā)出來，將有效控制蝦腸肝孢子蟲病的發(fā)生。

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（責任編輯：楊翠）