孫筱君，沈 琦，吳逸飛，姚曉紅，李園成，孫 宏，王 新，湯江武，葛向陽，*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

隨著人類社會的發(fā)展，肉類消費需求迅猛增長，養(yǎng)殖業(yè)也隨之發(fā)展壯大。養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展在給人們的生活帶來方便的同時，也帶來了很大的環(huán)境問題。養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生的廢棄物已經(jīng)成為主要的環(huán)境污染源，其中，惡臭氣體和氮、磷污染問題尤為突出[1]。惡臭氣體往往具有毒性，會對生物體的健康產(chǎn)生不利影響[2]。畜禽養(yǎng)殖場散發(fā)的氣味被許多人認為是最不愉快的氣體[3]。目前已知的惡臭氣體中濃度最高、對人類危害最大的是氨氣和硫化氫[4]。尿液中的尿素通過脲酶水解，在水性介質(zhì)中會形成銨，隨后在漿液坑或尿水坑中揮發(fā)從而釋放氨[5]。氨作為農(nóng)業(yè)中最重要的污染物，釋放到大氣中會導(dǎo)致酸化，流入地表水會導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化。

目前，畜禽糞污氨氮去除技術(shù)多樣，包括化學(xué)、物理、生物等多種手段。其中，物理、化學(xué)手段都需要較高的后續(xù)處理成本。相對而言，生物法不僅具有更低的運營成本和投資成本，而且降解效果較優(yōu)[6]，具備高效、簡單、環(huán)保等優(yōu)點，在畜禽養(yǎng)殖氨氮降解方面前景廣闊。采用微生物降解糞污氨氮是生物法除臭的重要途徑，其中，高效的氨氮降解菌株篩選是關(guān)鍵。為此，本試驗通過篩選高效的氨氮降解微生物并進行復(fù)配，形成高效的氨氮降解復(fù)合菌劑，以期為畜禽糞污的無害化處理提供技術(shù)依據(jù)與參考。

1 材料與方法

1.1 材料

豬糞樣本采集于浙江省安吉縣某豬場，均勻混合后自然風(fēng)干。供試菌株Z2、ZH14、AOZ、Y3、Y均為本實驗室保藏菌株。

1.2 培養(yǎng)基配方

氨氮降解菌富集培養(yǎng)基(簡稱為富集培養(yǎng)基)：硫酸銨 2.0 g、氯化鈉0.3 g、七水硫酸亞鐵0.03 g、磷酸氫二鉀1.0 g、七水硫酸鎂0.03 g、氯化鈣7.5 g、蒸餾水1 000 mL，pH值7.2。121 ℃滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化鈉5.0 g、蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。121 ℃滅菌30 min。

YPD培養(yǎng)基：酵母粉10.0 g、蛋白胨20.0 g、葡萄糖20.0 g、蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。115 ℃滅菌15 min。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母粉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸鈉5.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、七水硫酸鎂 0.58 g、一水硫酸錳0.25 g、蒸餾水1 000 mL、吐溫80 1 mL，pH值6.2～6.4。121 ℃滅菌30 min。

光合細菌培養(yǎng)基：氯化銨1.0 g、醋酸鈉3.5 g、氯化鎂0.1 g、磷酸二氫鉀0.6 g、磷酸氫二鉀0.4 g、酵母粉0.1 g、蒸餾水1 000 mL，pH值7.2。121 ℃滅菌30 min。

沙堡弱葡萄糖(SDA)培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，葡萄糖40.0 g、蒸餾水1 000 mL。115 ℃滅菌20 min。

孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g、葡萄糖10.0 g、磷酸二氫鉀1.0 g、七水硫酸鎂0.58 g、孟加拉紅0.033 g、氯霉素0.1 g、蒸餾水1 000 mL。121 ℃滅菌20 min。

以上培養(yǎng)基無特殊說明時，在使用時均系液體培養(yǎng)基。若為固體培養(yǎng)基時，均須額外添加瓊脂粉，瓊脂的質(zhì)量濃度統(tǒng)一設(shè)定為20 g·L-1。

1.3 試劑

氨氣吸收液[c(H2SO4)=0.005 mol·L-1]：量取2.8 mL濃硫酸加入水中，并稀釋至1 L，臨用時再稀釋10倍[7]。

酒石酸鉀鈉溶液(500 g·L-1)：稱取50 g酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·4H2O)溶于100 mL水中，煮沸，使約減少20 mL為止，冷卻后，再用水稀釋至100 mL。

納氏試劑：稱取17 g二氯化汞(HgCl2)溶于300 mL水中，另稱取35 g碘化鉀(KI)溶解在100 mL水中，然后將二氯化汞溶液緩慢加入到碘化鉀溶液中，直至形成紅色沉淀不溶為止。再加入600 mL氫氧化鈉溶液(200 g·L-1)和剩余的二氯化汞溶液。將此溶液靜置1～2 d，使紅色混濁物下沉，將上清液移入棕色瓶中用橡皮塞塞緊，保存?zhèn)溆谩?/p>

氨標準貯備液：稱取0.314 2 g經(jīng)105 ℃干燥1 h的氯化銨(NH4Cl)，用少量水溶解，移入100 mL容量瓶中，用氫氣吸收液稀釋至刻度。此溶液每1 mL含1.00 mg氨。

氨標準工作液：臨用時，將氨標準貯備液用氨氣吸收液稀釋至每1 mL含4.00 μg氨。

1.4 試驗方法

1.4.1 氨氮降解菌株的富集馴化

取5 g風(fēng)干豬糞接入到100 mL富集培養(yǎng)基，30 ℃、220 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)，檢測到銨根離子消耗完畢后，轉(zhuǎn)接5 mL至新鮮的富集培養(yǎng)基中，連續(xù)富集4次。

將豬糞缺氧自然發(fā)酵后，刮取5 g帶霉菌樣品接入100 mL SDA培養(yǎng)基，30 ℃、靜置培養(yǎng)3～7 d，觀測到培養(yǎng)液渾濁、內(nèi)含絲狀體后，轉(zhuǎn)接5 mL培養(yǎng)液至新鮮的SDA培養(yǎng)基中，連續(xù)轉(zhuǎn)接4次。

1.4.2 氨氮降解菌株的分離純化

將細菌富集液稀釋涂布富集培養(yǎng)基固體平板，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～5 d，挑取特征不同的菌落分離純化，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

取真菌富集液涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基固體平板上，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～5 d，挑取特征不同，且菌落為非紅色的絲狀菌落劃線分離，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 氨氮降解菌株的篩選

(1)初篩。取新鮮的豬糞200 g置于1 000 mL大燒杯中，按0.1 mL·g-1的接種量將重懸菌液接種于燒杯中，用玻璃棒將培養(yǎng)液與豬糞混合均勻，保鮮膜封口。對照組補加等量的無菌水。每組3個重復(fù)，30 ℃靜置培養(yǎng)7 d，通過感官法[8]初步判斷菌株的氨氮降解效果。

(2)復(fù)篩。取初篩得到的菌株進行復(fù)篩試驗。取新鮮的豬糞200 g置于1 000 mL大燒杯中，按0.1 mL·g-1的接種量將菌株接種于燒杯中，用玻璃棒將菌液與豬糞混合均勻，內(nèi)置裝有20 mL氨氣吸收液的小燒杯，保鮮膜封口。對照組補加等量的無菌水。每組3個重復(fù)，每隔3 d取走小燒杯，測量吸收液內(nèi)含有的氨氮，并更換新的吸收液。利用納氏試劑檢測法測定氨氮的釋放量，計算氨氮降解率，確定氨氮降解率較高的菌株。

1.4.4 氨氮降解菌株的鑒定

將篩選得到的菌株劃線到PDA培養(yǎng)基固體平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，進行形態(tài)學(xué)觀察和生理生化鑒定。對于細菌菌株，使用Hitachi H7650透射電子顯微鏡(日本日立)觀察其亞顯微結(jié)構(gòu)；對于真菌菌株，使用MicroPublisher 5.0 RTV光學(xué)顯微鏡(美國QImaging)觀察水浸片上的真菌細胞形態(tài)。挑取菌落加入裝有PCR體系的PCR管中，進行16S rRNA基因擴增。所用引物為原核生物16S rRNA PCR通用引物27F與1492R，正向引物序列為5′-agagtttgatcctggctcag-3′，反向引物序列為5′-acggctaccttgttacgactt-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR體系包括10×transtaq緩沖液5 μL(含有15 mmol·L-1的Mg2+)、dNTP(2.5 mmol·L-1)4 μL、上下游引物(10 μmmol·L-1)各0.8 μL、DNA模板2 μL(約30 ng)、Taq酶0.4 μL，用ddH2O補至50 μL。PCR程序：94 ℃預(yù)熱4 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，31個循環(huán)；72 ℃保持5 min，4 ℃保存。擴增結(jié)果送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將所得結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫上進行同源性比對分析，并用MEGA程序構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，確定菌種。

1.4.5 氨氮降解菌株的拮抗試驗

將優(yōu)勢菌株通過劃線交叉法，在YPD培養(yǎng)基固體平板上兩兩之間進行交叉劃線，觀察交叉點是否有菌生長，兩者均可以生長則不拮抗，1株或2株不能生長則為拮抗。

1.4.6 氨氮降解菌株的復(fù)配

取新鮮的豬糞200 g置于1 000 mL大燒杯中，按0.1 mL·g-1的接種量將重懸菌液接種于燒杯中，用玻璃棒將培養(yǎng)液與豬糞混合均勻，內(nèi)置裝有20 mL吸收液的小燒杯，保鮮膜封口，依前述試驗結(jié)果選定菌株后，除去相互拮抗關(guān)系，將其相互組合，對照組補加等量的無菌水，每組3個重復(fù)，每隔3 d取走小燒杯測量吸收液內(nèi)含有的氨氮，更換新的吸收液。

1.4.7 氨標準曲線與樣品測定

取7支10 mL具塞比色管，依次加入0、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL的氨標準工作液，使用無氨水定容至10 mL標線后，在各管中按順序加入0.2 mL酒石酸鉀鈉溶液和0.2 mL納氏試劑，混勻，靜置10 min。于波長420 nm處，使用酶標儀測定吸光度。以吸光度(扣除空白組數(shù)據(jù)后)對氨濃度(mg·L-1)繪制標準曲線。

樣品測定時，將10 mL樣品原溶液或稀釋至合適濃度的稀釋溶液加入具塞比色管中，使用制備標準曲線的操作步驟測定樣品的吸光度。用10 mL吸收液作試劑空白進行測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 18.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮降解菌株初篩

從安吉某豬場采集的糞污，經(jīng)過富集培養(yǎng)基的富集馴化后，通過劃線法分離菌株，經(jīng)多次純化，共分離得到13株可以降解氨氮的菌株，將其中的細菌菌株分別命名為N1～N6，真菌菌株分別命名為M1～M7。通過感官法初步測定各菌株對豬糞氨氮的降解效果，結(jié)果如表1所示。根據(jù)感官篩選法，具備一定氨氮降解能力的菌株為N2～N6和M1～M7。但是感官方法無法進一步明確菌株的氨氮去除效果，因此，選擇上述菌株進行復(fù)篩。

表1 供試菌株的感官臭氣評價Table 1 Sensory evaluation of malodorous gas of test strains

2.2 氨氮降解菌株復(fù)篩

以不添加菌劑的組別作對照，將初篩得到的菌株，與實驗室保藏的菌株Z2、ZH14、AOZ、Y3、Y進行復(fù)篩試驗，在實驗室培養(yǎng)條件下測定各菌株對氨氮的去除效果，計算不同時間各菌株對氨氮的降解率。細菌篩選結(jié)果見圖1，真菌篩選結(jié)果見圖2。

由圖1可以看出，在復(fù)篩試驗中，篩選菌株降解氨氮的能力普遍低于實驗室保藏菌株。整個試驗過程中，9 d時Z2菌株的氨氮降解率最高(47.43%)。此外，AOZ、Y菌株的氨氮降解效果亦較好，最高氨氮降解率分別為43.28%和44.91%。

圖1 不同細菌菌株在第3、6、9天的氨氮降解率Fig.1 Ammonia-nitrogen degradation rates of different bacteria strains on day 3， 6 and 9

真菌復(fù)篩的結(jié)果如圖2所示。M4菌株整體表現(xiàn)良好，9 d時氨氮降解率最高(46.31%)，其余真菌菌株的氨氮降解率表現(xiàn)一般。

圖2 不同真菌在第3， 6，9天的氨氮降解率Fig.2 Ammonia-nitrogen degradation rates of different fungi strains on day 3， 6 and 9

綜上，選取菌株Z2、AOZ、Y和M4作為復(fù)合氨氮降解菌劑的功能菌株，進行后續(xù)復(fù)配試驗。

2.3 功能菌株的鑒定

對菌株M4、Z2、AOZ、Y進行菌落PCR，擴增得到16S rDNA片段，測序結(jié)果提交到GenBank

數(shù)據(jù)庫，相應(yīng)的登錄號(accession number)分別為MT322238、MT322305、MT322306和MT322307。在NCBI數(shù)據(jù)庫上進行BLAST序列比對，通過MegaX構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進行同源性分析，結(jié)果如圖3所示。結(jié)合菌落形態(tài)觀察(圖4)、細菌菌株的生理生化分析，確定菌株Y為干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)，Z2為彎曲芽孢桿菌(Bacillusflexus)，AOZ為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)。真菌菌株M4具有尿素分解、尸胺分解和產(chǎn)脂的能力，可利用葡萄糖與氨，可基本確定M4為Dipodascusmacroporus。將Z2菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為M2018659。

圖3 基于16S rDNA的菌株Z2、AOZ、Y、M4系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain Z2， AOZ， Y and M4 based on 16S rDNA

2.4 糞污氨氮降解菌的復(fù)配

將得到的優(yōu)勢菌株Z2、AOZ、Y、M4進行拮抗試驗。結(jié)果顯示，菌株M4與其他3株菌均有拮抗關(guān)系，故其不參與復(fù)配。但要指出的是，本研究中，拮抗試驗通過對峙培養(yǎng)法進行，該法不能有效地控制菌株的生長量，故而無法判斷是營養(yǎng)競爭抑制還是其代謝物產(chǎn)生的拮抗作用。

a、b、c依次為菌株AOZ、Y、Z2的電鏡照片，d為M4的顯微照片。a， b and c showed the transmission electron microscope photos of strain AOZ， Y and Z2， respectively; and d showed the micrograph of strain M4.圖4 菌株Z2、AOZ、Y、M4的形態(tài)Fig.4 Morphology of strains Z2， AOZ， Y and M4

將Z2、AOZ、Y按1∶1的比例進行復(fù)配，形成4組(Z2+Y、Y+AOZ、Z2+AOZ、Z2+Y+AOZ)，進一步進行氨氮降解組合的篩選。以空白對照組的氨氮釋放量為參照，計算各個組合的氨氮降解率。如圖5所示，不同組合的氨氮降解率存在一定差異，多菌組合對氨氮的去除效果一般，組合Z2+Y對氨氮的去除效果最好，9 d時氨氮降解率達到48.07%。

圖5 不同菌株組合在第3、6、9天的氨氮降解率Fig.5 Ammonia-nitrogen degradation rate of different bacterial combinations on day 3， 6 and 9

表2 細菌菌株的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of bacterial strains

2.5 不同添加量對復(fù)合菌劑小試的影響

為檢驗復(fù)合菌劑Z2+Y對豬糞氨氮的降解效果，設(shè)置不同的菌劑添加量(濃度梯度依次為0.01、0.03、0.05、0.10、0.15 mL·g-1)進行氨氮降解試驗，結(jié)果如圖6所示。可以看出，各菌劑添加量下試驗前期氨氮降解率均隨著時間的延長而提高，至第6天時氨氮降解率最高，而后隨著時間的延長降解率顯著(P<0.05)降低。當(dāng)菌劑接種量為0.01～0.03 mL·g-1時，菌株對氨氮的降解率隨著添加量的增大而增大，當(dāng)接種量為0.03～0.10 mL·g-1時，接種量的提升，并未提高菌株對氨氮的降解率，部分時間段存在降低的現(xiàn)象，當(dāng)接種量從0.10 mL·g-1提升至0.15 mL·g-1時，菌株對氨氮的降解率顯著(P<0.05)降低。當(dāng)菌株投加量為0.10 mL·g-1時，有部分時間段(3、6 d)除臭效果最優(yōu)，但綜合全程除臭效果和成本考慮，選擇0.03 mL·g-1為菌劑最佳接種量。

同一時間點不同柱上無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。Bars marked without the same letters in the same time indicated significant difference within treatments at P<0.05.圖6 不同添加量的復(fù)合菌劑在第3、6、9天的氨氮降解率Fig.6 Ammonia-nitrogen degradation rate of different addition amount of bacterial combinations on day 3， 6 and 9

3 討論

本研究選取豬糞作為篩選來源，篩選氨氮降解功能菌株，結(jié)合實驗室現(xiàn)有保藏菌株，通過組合優(yōu)化進行豬糞的氨氮降解試驗，確定Z2+Y為最優(yōu)菌劑組合，氨氮降解率最高可達53.19%。經(jīng)鑒定，Y為干酪乳桿菌，Z2為彎曲芽孢桿菌。

許多微生物都參與了氨氮降解的過程，如歐洲亞硝化單胞菌(Nitrosomonaseuropaea)、硝化球菌(Nitrococcusmobiles)等菌株被發(fā)現(xiàn)可有效去除豬糞中的氨氮[9]。研究表明，微生物改良劑在降低糞便pH值的同時，大大降低了氨氮含量。其中，功能微生物如乳桿菌屬會產(chǎn)生有機酸，在降低豬糞pH值的同時，有機酸還可以抑制尿素(或尿酸)的水解和有機氮的脫氨，從而降低氨氮含量[10-11]。Li等[12]發(fā)現(xiàn)，促進氨氣生成的巴氏桿菌(具有脲酶活性的尿素分解菌)在酸性條件下無法生長；Lam等[13]將脲酶抑制劑應(yīng)用于澳大利亞的亞熱帶牧場，發(fā)現(xiàn)氨氨的揮發(fā)減少了44%。芽孢桿菌屬由于抗逆性強、繁殖速度較快[14]，在環(huán)境微生物領(lǐng)域應(yīng)用較廣。翟繼鵬等[15]的研究顯示，芽孢桿菌屬在惡臭氣體去除方面也有重要作用。Yumoto等[16]在篩選去除動物糞便相關(guān)異味的菌株時，分離出了新的物種，將其命名為Bacillusasahiisp. nov。本研究從豬糞中篩得的彎曲芽孢桿菌Z2的氨氮降解率為47.43%，低于李玥等[17]從雞糞中篩得的芽孢桿菌屬菌株MS03，推測菌株的降解能力可能與其來源有關(guān)。芽孢桿菌屬的代謝產(chǎn)物對一些物質(zhì)也有去除作用。如地衣芽孢桿菌菌株TAB7是用于堆肥除臭的商業(yè)菌株，Mpofu等[18]測試了其對部分酚類的生物轉(zhuǎn)化能力，結(jié)果顯示，其可以轉(zhuǎn)化阿魏酸鹽，并通過基因組分析證明其具有與酚類化合物分解代謝有關(guān)的基因序列，在具有除氨氮功能的同時，還可分解轉(zhuǎn)化其他惡臭氣味來源。

單一菌株的降解能力往往低于多種菌株共同作用的效果。Meinen等[19]利用篩選的除臭菌株混合培養(yǎng)后得到一種除臭劑，對畜禽糞便有較強的除臭能力，且其除臭效果優(yōu)于任一單個菌株。韓保安等[20]將篩選得到的4株菌株進行復(fù)配，利用復(fù)合微生物菌群提高了氨氮去除效率。本研究對3株功能菌株進行復(fù)配，結(jié)果顯示Z2+Y菌株組合的氨氮降解能力最強，降解率最高可達53.19%。其他復(fù)配組合的氨氮降解效果不明顯，甚至低于單一菌株的降解能力，這可能是因為復(fù)合微生物中的某一菌株占據(jù)了絕對優(yōu)勢，導(dǎo)致其對營養(yǎng)物質(zhì)快速消耗，影響了其他菌株的生長繁殖[21]。功能微生物的添加量也會影響其降解效果，本研究中過高的接種量反而導(dǎo)致菌劑對氨氮的降解率降低。推測其原因，可能是因為微生物添加量過大，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)因被迅速利用而匱乏，降低了功能微生物的生物活性和關(guān)鍵酶的活性[22]。Matusiak等[23]制作了微生物制劑與絲蘭提取物用于脫氨，微生物制劑中包含熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、糞腸球菌(Enterococcusfaecium)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)和魯?shù)劓溍咕?Streptomycesrutgersensis)，添加絲蘭提取物后，經(jīng)過96 h曝氣，糞便中的氨氮濃度降低了43.4%，空氣中的氨氮減少了64%，當(dāng)再添加微生物制劑聯(lián)合應(yīng)用時，氨氮降解率提高至68.4%，降解效率與本研究相當(dāng)，且與本研究均使用了芽孢桿菌。Borowski等[24]將熒光假單胞菌、糞腸球菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、腸膜明串珠菌和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)制成噴霧干燥微膠囊，吸附于珍珠巖膨潤土混合物上，當(dāng)混合物中噴霧干燥微膠囊添加量為10%時，對氨氮的平均去除率為86%，添加量為20%時，平均降解率為94%，說明合適的載體可以提升微生物制劑的脫氨效果。這給本研究之后的應(yīng)用提供了一定的啟發(fā)。

總的來看，本研究獲得的復(fù)合菌劑組合Z2+Y在豬糞的氨氮降解方面有很好的效果，可以實現(xiàn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的氨氮高效去除，有利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，為畜禽糞污的無害化處理提供了一種高效的復(fù)合微生物制劑。但是復(fù)合菌劑的作用機理和2株功能菌株之間的協(xié)同機理還需深入研究。