殷文健 何 俊 李佳佳 陳煥根 張憲中*

（1．無錫市水產(chǎn)畜牧技術(shù)推廣中心，江蘇 無錫 214125；2．江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017；3．江蘇省漁業(yè)技術(shù)推廣中心，江蘇 南京 210036）

腸道微生物是機體中復(fù)雜且多樣的生物系統(tǒng)，在宿主與腸道微生物長期共同進化的過程中，兩者形成了相互協(xié)作、互利共生的關(guān)系[1]。正常生理狀況下，腸道微生物處于動態(tài)平衡狀態(tài)，且這種平衡與宿主的吸收代謝和免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)[2-3]。腸道微生物失衡會引起腸道疾病，危害宿主健康，影響?zhàn)B殖的經(jīng)濟效益。水產(chǎn)動物的腸道微生態(tài)系統(tǒng)極易受養(yǎng)殖環(huán)境的影響。研究表明，水溫會影響水產(chǎn)動物腸道微生物的組成[4]，水體溫度為18 ℃時，羅非魚腸道微生物數(shù)量顯著高于26 ℃[5-6]。Yang 等[7]報道，在稻田養(yǎng)殖模式中，泥鰍腸道菌群的多樣性秋季比夏季高，并且鄰單胞菌屬只出現(xiàn)在夏季。夏季稻田養(yǎng)殖模式下的泥鰍腸道菌群中的厚壁細菌、乳酸菌屬和鏈球菌屬明顯高于池塘養(yǎng)殖模式[7]，表明養(yǎng)殖環(huán)境直接影響水產(chǎn)動物的腸道微生物組成。

池塘和稻田養(yǎng)殖是目前克氏原螯蝦主要的養(yǎng)殖模式，兩種養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦的腸道優(yōu)勢菌群相同，但是占比存在較大差異[8]。環(huán)境微生物會影響水產(chǎn)動物的腸道微生物的組成與微生態(tài)建立，養(yǎng)殖水體和底泥是水產(chǎn)動物養(yǎng)殖環(huán)境中重要部分。目前，不同養(yǎng)殖模式下動物腸道菌群的差異是否與養(yǎng)殖環(huán)境中微生物組成具有相關(guān)性仍需要進一步研究。因此，本研究在比較池塘和稻田養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦腸道菌群組成差異的基礎(chǔ)上，深入研究養(yǎng)殖環(huán)境（水體和底泥）微生物菌群對克氏原螯蝦腸道菌群的影響，為池塘與稻田養(yǎng)殖模式下小龍蝦的養(yǎng)殖管理和調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

在江蘇省無錫市選擇3 口（1～2 hm2/口，水深1～1.5 m）克氏原螯蝦養(yǎng)殖池塘，3塊（4～6 hm2/塊，水深1～1.5 m）水稻-克氏原螯蝦綜合種養(yǎng)田塊。2021 年3 月25 日至4 月10 日，在池塘和稻田中陸續(xù)放養(yǎng)4～5 g/只克氏原螯蝦（250～300 kg/hm2），于2021 年7 月8 日采集池塘和稻田內(nèi)克氏原螯蝦（25～32 g/只）、表層底泥和底層水樣品，用于微生物菌群組成分析。養(yǎng)殖所用飼料為小龍蝦配合顆粒餌料（蘇州海大飼料有限公司），主要原料為魚粉、豆粕、菜粕、蝦殼粉、面粉、肉粉、磷酸二氫鈣、氯化鈉、復(fù)合維生素、微量元素等，營養(yǎng)水平為粗蛋白37%、粗纖維8%、粗灰分9%、水分10%、鈣2%。

試驗期間每天早晚投喂2 次餌料，保證3 h 內(nèi)吃完。養(yǎng)殖期間，保證水源充足，根據(jù)水質(zhì)和天氣變化加注新水。試驗期 90 d。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 樣品采集

使用地籠從每個池塘和稻田中各捕撈克氏原螯蝦30 只，去除附肢，使用75%酒精浸泡15 min，無菌水漂洗4次（每次5 min），使用滅菌的濕棉球?qū)⑽r尾部擦拭干凈，拽拉尾部末端扯出整個腸道，使用鑷子將腸道內(nèi)容物擠至滅菌的5 mL離心管中，每個池塘和稻田中所有克氏原螯蝦腸道內(nèi)容物混合，于-80 °C 凍存[9]。利用采泥器采集池塘和稻田表層（15 cm）底泥樣品，每個池塘和稻田采集中間和4個角落共5個點，混合，放入滅菌離心管中，于-80 °C 凍存。利用無菌玻璃瓶采集池塘和稻田的水體樣品，每個池塘和稻田采集5 個點（100 mL/點），混合后低溫高速離心，收集沉淀，于-80 °C凍存。

1.2.2 生長性能

試驗開始和結(jié)束統(tǒng)計克氏原螯蝦初始體重和終末體重，計算增重率和餌料系數(shù)。

1.2.3 DNA提取與高通量測序

參照Zoetendal等[10]的方法提取樣品總DNA。樣品經(jīng)過渦旋處理后在低溫條件下10 000 g離心15 min，將獲得的沉淀轉(zhuǎn)移至鋯珠管中，加入十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）緩沖溶液對樣品進行研磨處理，利用DNA提取液（北京索萊寶科技有限公司）對總基因組DNA進行抽提。樣品經(jīng)過經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，以NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific）測定DNA 純度和含量。利用細菌16S rRNA 基因V4 區(qū)通用引物（515F：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA；806R：GGACT ACHVGGGTWTCTAAT）[11]進行PCR 擴增、產(chǎn)物純化、建庫。利用Illumina HiSeq 2500 平臺（Illumina）對檢測合格的文庫進行300×2 bp 測序。本研究中PCR 產(chǎn)物純化、建庫和測序在華大基因（BGI）完成，測序原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI（PRJNA757836）。

1.2.4 高通量測序結(jié)果分析

利用軟件Cutadapt（3.4）[12]截掉測序數(shù)據(jù)的引物和接頭，去除窗口平均質(zhì)量低于20的末端堿基、含N的序列、片段長度小于225 bp的序列以及低復(fù)雜度的序列[13]。上述質(zhì)量過濾后的序列導(dǎo)入Qiime2（2020.11）[14]進行嵌合體去除與雙端拼接，所用軟件為Dada2（1.20.0）[15]，前端序列保留長度230 bp，后端序列保留長度200 bp，其余參數(shù)為軟件默認值。使用Vsearch（2.16.0）[16]對上述序列進行97%聚類，聚類方法為Open-reference，以Silva（123）數(shù)據(jù)庫作為參考序列，其余參數(shù)設(shè)置為默認值。使用Mafft（7.4）[17]對代表性序列進行系統(tǒng)進化分析，并通過Qiime2 進行微生物菌群結(jié)構(gòu)的Alpha 和Beta多樣性分析和微生物物種注釋（Silva 123）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2020 進行初步整理，SPSS 20.0 進行相關(guān)性分析，利用非參數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢驗比較差異，使用R 軟件包進行微生物Spearman 相關(guān)性分析，使用GraphPad Prism 處理分析過的數(shù)據(jù)并作圖。置信區(qū)間為95%，結(jié)果以“平均值±標準誤”表示，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同養(yǎng)殖模式對克氏原螯蝦生長性能的影響（見表1）

表1 不同養(yǎng)殖模式對克氏原螯蝦生長性能的影響

由表1可知，不同養(yǎng)殖環(huán)境對克氏原螯蝦的初均重、末均重、增重率和餌料系數(shù)影響不顯著（P＞0.05）。

2.2 池塘與稻田養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦腸道、水和底泥微生物多樣性的影響

池塘和稻田養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦腸道、水和底泥微生物菌群Observed_features 稀釋曲線見圖1?？耸显r腸道、水體和底泥樣品的高通量測序數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后，分別有62 197、56 902、57 657 條/樣序列用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

圖1 池塘和稻田養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦腸道、水和底泥微生物菌群Observed_features稀釋曲線

由圖1 可知，蝦腸道、水和底泥微生物高通量測序深度足夠，研究數(shù)據(jù)具有代表性。

不同養(yǎng)殖模式對腸道、水和底泥微生物Alpha多樣性指數(shù)的影響見表2。由表2可知，與池塘養(yǎng)殖相比，稻田養(yǎng)殖蝦腸道菌群Faith_pd 和Oberserved_features 指數(shù)具有下降趨勢，水體微生物Pielou_evenness 和Shannon_entropy 指數(shù)均顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)aith_pd 指數(shù)具有下降趨勢；底泥多樣性指數(shù)無顯著變化（P＞0.05）。

表2 不同養(yǎng)殖模式對腸道、水和底泥微生物Alpha多樣性指數(shù)的影響

不同養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦腸道、水和底泥微生物Beta多樣性分析見圖2。由圖2可知，養(yǎng)殖模式能夠明顯影響蝦腸道與水體微生物菌群結(jié)構(gòu)，而對底泥微生物影響較小。

圖2 不同養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦腸道、水和底泥微生物Beta多樣性分析

2.3 不同養(yǎng)殖模式對克氏原螯蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響（見圖3）

圖3 不同養(yǎng)殖模式對克氏原螯蝦腸道菌群組成的影響

由圖3 可知，克氏原螯蝦腸道內(nèi)優(yōu)勢菌門（相對豐度＞1%）有Proteobacteria、Firmicutes、Verrucomicrobia、Actinobacteria 等13 種；池塘蝦腸道內(nèi)相對豐度最高的菌門為Proteobacteria（19.98%），稻田蝦腸道內(nèi)相對豐度最高的菌門為Firmicutes（16.10%）。蝦腸道內(nèi)優(yōu)勢菌屬（相對豐度＞0.5%） 有Candidatus Bacilloplasma、UnculturedChthoniobacterales、UnculturedRsaHF231等41 個；池塘蝦腸道內(nèi)相對豐度最高的屬為UnculturedChthoniobacterales（9.45%），稻田蝦腸道內(nèi)相對豐度最高的屬為Candidatus Bacilloplasma（9.44%）。

不同養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦腸道菌群差異分析見表3。由表3可知，與池塘養(yǎng)殖相比，門水平上，稻田蝦腸道內(nèi)Fusobacteria 的相對豐度顯著增加（P＜0.05），Actinobacteria和Cyanobacteria的相對豐度有增加的趨勢，Verrucomicrobia 的相對豐度顯著降低（P＜0.05）。Acidobacteria 和Proteobacteria 的相對豐度有降低的趨勢。與池塘養(yǎng)殖相比，在屬水平上，稻田蝦腸道內(nèi)Planktothrix、UnculturedActinobacteria、Methylocaldum、Luteolibacter、 Mycobacterium、UnculturedRhizobiales、Desulfocapsa、Synechococcus、Uncultured PeM15 的相對豐度顯著增加（P＜0.05）；UnculturedChthoniobacterales、UnculturedChthoniobacterales、UnculturedAnaerolineaceae、UnculturedMycoplasmataceae的相對豐度顯著降低（P＜0.05）。

表3 不同養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦腸道菌群差異分析

2.4 池塘與稻田水體微生物結(jié)構(gòu)分析（見圖4、表4）

圖4 池塘與稻田水體微生物組成

表4 池塘與稻田水體微生物差異分析

由圖4 可知，水體微生物優(yōu)勢菌門（相對豐度＞1%）有Proteobacteria、Cyanobacteria、Actinobacteria 等10 種，其中池塘水體Proteobacteria豐度最高（34.17%），而稻田水體中豐度最高的菌門為Cyanobacteria（41.69%）。水體微生物優(yōu)勢菌屬（相對豐度＞0.5%） 有UnculturedCyanobacteria、 UnculturedSporichthyaceae、 UnculturedComamonadaceae等38 個，其中池塘水體UnculturedSporichthyaceae豐度最高（12.01%），而稻田水體中豐度最高的菌屬為UnculturedCyanobacteria（21.34%）。

由表4 可知，在門水平上，與池塘相比，稻田水體Fusobacteria 門相對豐度顯著增加 （P＜0.05），Verrucomicrobia 相對豐度顯著降低 （P＜0.05），Actinobacteria 和Cyanobacteria 相對豐度有增加的趨勢，Acidobacteria、Proteobacteria相對豐度有降低的趨勢。在屬水平上， 與池塘相比， 稻田水體UnculturedCyanobacteria等13 個屬相對豐度顯著增加（P＜0.05），UnculturedSporichthyaceae等18 個屬相對豐度顯著降低（P＜0.05），UnculturedComamonadaceae屬相對豐度有降低的趨勢。

2.5 池塘與稻田底泥微生物結(jié)構(gòu)分析（見圖5、表5）

圖5 池塘與稻田底泥微生物組成

表5 池塘與稻田底泥微生物差異分析

由圖5 可知，底泥優(yōu)勢（相對豐度＞1%）菌門有Proteobacteria、Chloroflexi、Acidobacteria 等11 種；相對豐度最高的門均為Proteobacteria（36.79%、31.23%）。底泥優(yōu)勢 （ 相對豐度＞0.5%） 菌屬有UnculturedAnaerolineaceae、 UnculturedAcidobacteria、 UnculturedXanthomonadales等38 個；相對豐度最高的屬均為UnculturedAnaerolineaceae（9.41%、10.00%）。

由表5 可知，與池塘相比，稻田底泥Firmicutes 門和Marmoricola屬相對豐度顯著增加（P＜0.05），UnculturedNitrospinaceae和UnculturedDesulfobacteraceae屬相對豐度顯著降低（P＜0.05），Actinobacteria 相對豐度有增加的趨勢，Defluviicoccus屬相對豐度具有降低的趨勢。

2.6 養(yǎng)殖環(huán)境（水、底泥）對克氏原螯蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響（見圖6、表6）

圖6 池塘與稻田養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦腸道、水及底泥微生物相關(guān)性分析

表6 克氏原螯蝦腸道優(yōu)勢菌屬與底泥和水體微生物相關(guān)性分析

由圖6 可知，蝦腸道微生物菌群與底泥和水體微生物菌群均存在顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），且蝦腸道微生物與底泥微生物的相關(guān)性更高。

由表6 可知，蝦腸道、水體和底泥優(yōu)勢菌屬間的相關(guān)性分析（P＜0.05 且相關(guān)系數(shù)絕對值＞0.8）顯示，共有29 個腸道優(yōu)勢菌屬與底泥和水體微生物顯著相關(guān)，其中23 個與底泥微生物顯著相關(guān)，22 個與水體微生物顯著相關(guān)，16 個與底泥和水體微生物均顯著相關(guān)。Verrucomicrobiaceae兩個未知屬、Cyanobacteria未知屬及Luteolibacter主要受底泥微生物影響， 而Chthoniobacterales未知屬及Planktothrix主要受水體微生物影響。

3 討論

3.1 不同養(yǎng)殖模式對克氏原螯蝦生長性能、腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

克氏原螯蝦的生長受到諸多因素的影響。本試驗中，克氏原螯蝦的體生長性能在不同的養(yǎng)殖模式下無顯著差異?？赡苁且驗楸狙芯恐锌耸显r的放養(yǎng)密度和水草覆蓋度適中。

腸道微生物可以調(diào)節(jié)腸道環(huán)境，促進腸道菌群平衡，維護宿主健康[18]。在宿主與腸道菌群長期共同進化的過程中，某種或某些特殊的微生物會定植在腸道中，形成該宿主腸道內(nèi)的核心菌群[19]。核心菌群很少受到宿主馴養(yǎng)狀態(tài)和飼養(yǎng)環(huán)境的影響。Tzeng等[20]發(fā)現(xiàn)，不同棲息環(huán)境中日本沼蝦的腸道核心菌群主要為變形菌門，其次為厚壁菌門和放線菌門。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，兩種飼養(yǎng)模式下小龍蝦的核心菌群主要為變形菌門，其次是厚壁菌門和疣微菌門，與上述研究結(jié)果相類似。有研究表明，水生動物腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成受遺傳、飼養(yǎng)環(huán)境和飼料組成等因素影響[21]。嚴雪瑜等[22]報道，稻田養(yǎng)殖模式下的鯉魚腸道菌群多樣性高于池塘養(yǎng)殖模式。在本試驗中，稻田養(yǎng)殖模式下蝦腸道菌群多樣性低于池塘養(yǎng)殖模式，這可能是稻田水體環(huán)境中微生物多樣性偏低導(dǎo)致。本研究后續(xù)比較池塘和稻田水體微生物多樣性發(fā)現(xiàn)，稻田水體中微生物多樣性顯著低于池塘。從門的分類水平上可見，在稻田養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦腸道放線菌門的相對豐度顯著增加。放線菌是腸道的優(yōu)勢菌群，具有產(chǎn)生短鏈脂肪酸的能力，并且其代謝產(chǎn)物具有抑菌活性[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，在屬水平上，稻田養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦腸道囊裸藻屬（Trachelomonas）相對豐度降低，而浮絲藻屬 （Planktothrix） 相對豐度增加。 囊裸藻屬（Trachelomonas）分布較廣，為湖泊、沼澤等靜水水體中常見的浮游微生物，其大量繁殖時使水呈棕褐色。稻田養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦腸道放線菌和囊裸藻屬（Trachelomonas）相對豐度改變的原因可能與稻田水質(zhì)的改善有著緊密聯(lián)系。根據(jù)上述結(jié)果可以推測，稻田養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦腸道微生物結(jié)構(gòu)可能更健康。

3.2 稻田與池塘水體微生物組成對克氏原螯蝦腸道微生物的影響

水生動物的消化道短，腸道微生物極易受水環(huán)境的影響[24]。研究表明，微生物可以通過水環(huán)境引起水生動物腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[25]。本研究中，水體微生物的主要菌門為變形菌門、藍藻門、放線菌門和疣微菌門，這與克氏原螯蝦腸道的優(yōu)勢菌群基本一致。稻田水體微生物多樣性顯著低于池塘水體，造成這一結(jié)果的原因可能是水稻大量吸收水體中的營養(yǎng)素，水體清瘦，導(dǎo)致微生物數(shù)量較少[26]。本試驗中，在門水平，稻田水體微生物的變形菌門，放線菌門和疣微菌門相對豐度顯著低于池塘水體，而藍藻門相對豐度顯著高于池塘水體。所有的變形菌門細菌為革蘭氏陰性菌，其外膜主要由脂多糖組成，因此該門包括很多致病菌[27]；放線菌門會促使土壤中的動物和植物腐爛，同時放線菌具有一種土霉味。因此，推測稻田水體中變形菌門和放線菌門相對豐度較低表明稻田中水質(zhì)更好。本試驗中，在屬水平，稻田水體微生物魚孢菌科（Uncultured Sporichthyaceae）、藍藻細菌（Cyanobacteria）和聚球藻屬（Synechococcus）相對豐度顯著高于池塘水體。這可能是由于稻田充足的陽光照射刺激了藍藻菌屬生長，也可能是因為稻田水質(zhì)較好菌群多樣性低，藍藻菌屬對營養(yǎng)物質(zhì)的競爭壓力減小[28]。

3.3 稻田與池塘底泥微生物組成分析

池塘和稻田底泥中主要的微生物菌門為變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、放線菌門等[29]。本研究結(jié)果顯示，池塘與稻田底泥微生物多樣性沒有顯著差異，在門和屬水平上，微生物菌群結(jié)構(gòu)的差異也不大。研究表明，植物種植可以引起土壤中微生物群落組成和豐度的變化，植物能夠通過對土壤養(yǎng)分和水分的吸收以及根系分泌物的釋放來調(diào)控周圍的土壤，從而對微生物施加選擇性壓力[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，池塘和稻田底泥微生物菌群結(jié)構(gòu)差異不大，可能是養(yǎng)殖克氏原螯蝦池塘內(nèi)種植的水草也具有相似的土壤調(diào)控作用。

3.4 底泥與水體對克氏原螯蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

本研究中的相關(guān)性分析結(jié)果表明，克氏原螯蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)與底泥和水體微生物均具有顯著正相關(guān)關(guān)系，表明蝦腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)受底泥和水體微生物的正向調(diào)控。而蝦腸道微生物菌群與底泥微生物相關(guān)性更強，表明底泥微生物菌群對蝦腸道微生物的影響更大，與在南美對蝦和小龍蝦上的研究結(jié)果相一致[32-33]。因此，可推測這一結(jié)果可能與克氏原螯蝦的生活習(xí)性密切相關(guān)，小龍蝦具有穴居性，洞穴深度一般在30 cm左右，此外小龍蝦會采食底泥中的腐殖質(zhì)有機碎屑[34]。

4 結(jié)論

池塘和稻田兩種養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)差異顯著，受養(yǎng)殖環(huán)境水和底泥的正向調(diào)控，其中受底泥微生物的影響更大。