王 丁 徐 彬 席燕燕 王改利 付 趁 孫全友 李紹鈺*

（1．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 鄭州 450002；2．河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002）

在動(dòng)物生產(chǎn)中長(zhǎng)期使用抗生素類藥物容易產(chǎn)生負(fù)面影響，如產(chǎn)生耐藥性、藥物殘留、食品安全等問(wèn)題[1]，因此我國(guó)提出在飼料端禁止使用抗生素[2]。微生態(tài)制劑具有增強(qiáng)動(dòng)物自身免疫力、改善飼料轉(zhuǎn)化率、維持動(dòng)物健康快速生長(zhǎng)等生物學(xué)功能[3-4]。納豆芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌的一個(gè)亞種，屬于好氧菌中的非致病革蘭氏陽(yáng)性菌[5]。納豆芽孢桿菌具有耐酸耐堿的特性，可在酸性胃環(huán)境中保持良好的穩(wěn)定性，進(jìn)入腸道后產(chǎn)生的代謝物能夠抑制有害菌生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)腸道菌群微生態(tài)平衡，保障腸道正常功能運(yùn)轉(zhuǎn)[6]。肉仔雞日糧中添加納豆芽孢桿菌可以顯著提高免疫器官指數(shù)，增強(qiáng)肉雞免疫反應(yīng)[7]。發(fā)酵納豆芽孢桿菌能夠有效降低肉雞的料重比，提高腸道中乳酸桿菌的含量[8]。乳酸菌和芽孢桿菌聯(lián)用，可在不同程度上提高肉仔雞的飼料利用率，促進(jìn)肉仔雞生長(zhǎng)，提高法氏囊指數(shù)，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[9]。目前，有關(guān)納豆芽孢桿菌的研究多集中于對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能及免疫作用的影響，關(guān)于其對(duì)腸道菌群影響的研究甚少。因此，本試驗(yàn)在肉仔雞日糧中添加納豆芽孢桿菌，觀察其對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能、免疫功能及腸道菌群的影響，以期為納豆芽孢桿菌在肉仔雞的生產(chǎn)應(yīng)用中提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取180 只1 日齡科寶肉仔雞隨機(jī)分為2 組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15只雞，對(duì)照組肉雞飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧＋300 mg/kg 納豆芽孢桿菌。試驗(yàn)期42 d。試驗(yàn)地點(diǎn)在河南大用實(shí)業(yè)有限公司，試驗(yàn)雞由公司提供。試驗(yàn)所用納豆芽孢桿菌購(gòu)自日本株式會(huì)社目黑研究所，為灰棕色至黃棕色粉末。納豆芽孢桿菌含量≥1.0×1011CFU/g，推薦量為300 mg/kg?；A(chǔ)日糧參照《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 33—2004）進(jìn)行配制，基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 飼養(yǎng)管理

采用三層籠養(yǎng)，肉仔雞自由采食與飲水，環(huán)境溫度隨著日齡增加逐漸降低，每周下降2～3 ℃，從1日齡的32 ℃降到23 ℃并保持不變。按照雞場(chǎng)免疫程序進(jìn)行接種。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 生長(zhǎng)性能

試驗(yàn)期間每周對(duì)試驗(yàn)雞進(jìn)行空腹稱重并詳細(xì)記錄耗料量，計(jì)算試驗(yàn)肉雞的平均日采食量、平均日增重和料重比。

1.3.2 血清免疫指標(biāo)

在肉仔雞21、42 日齡，從每個(gè)重復(fù)選取1 只雞翅靜脈采血，無(wú)抗凝血3 500 r/min 離心10 min，收集血清分裝于2 mL 離心管中，-20 ℃冷凍保存。血清用于測(cè)定免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）的含量，采用南京建成生物工程研究所試劑盒采用方法為酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定。

1.3.3 空腸炎癥因子

試驗(yàn)肉仔雞采血后屠宰，取出腸道，縱向剪開(kāi)空腸，用生理鹽水沖洗掉腸道內(nèi)容物，收集黏膜于凍存管中-80 ℃保存待測(cè)。稱取空腸黏膜，按重量體積比1 g∶9 mL的比例加入9倍體積的PBS（pH值7.4），使用勻漿器充分勻漿。2 000～3 000 r/min離心20 min，收集上清，-20 ℃冷凍，白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）采用南京建成生物工程研究所試劑盒使用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定。

1.3.4 腸道菌群

收集盲腸內(nèi)容物于無(wú)菌凍存管中，置于液氮中保存，用于微生物測(cè)定。根據(jù)DNeasy? PowerSoil? Pro Kit（QIAGEN）說(shuō)明書對(duì)盲腸內(nèi)容物微生物群落進(jìn)行總DNA抽提，使用NanoDrop 2000 檢測(cè)DNA 濃度并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，對(duì)回收純化后的產(chǎn)物構(gòu)建文庫(kù)并測(cè)序[10]。

PCR 擴(kuò)增體系（20 μL）：5×TransStart FastPfu 緩沖液4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、上游引物（5 μmol/L）0.8 μL、下游引物（5 μmol/L）0.8 μL、TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL、模板DNA 10 ng。

德國(guó)ETAS（易特馳）集團(tuán)為客戶提供用于汽車電控單元（ECU）開(kāi)發(fā)和維護(hù)的各種集成工具和解決方案。作為一流的工具供應(yīng)商，易特馳始終提供創(chuàng)新、高質(zhì)量的產(chǎn)品，并針對(duì)ECU生命周期的各個(gè)階段提供解決方案。該公司2005年進(jìn)入中國(guó)，為中國(guó)本土客戶提供全方位的服務(wù)以及個(gè)性化的解決方案。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行T 檢驗(yàn)，Duncan's法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。采用FASTP（version 0.20.0）軟件用于盲腸微生物原始測(cè)序序列的質(zhì)控，F(xiàn)lash（version 1.2.7）軟件拼接。根據(jù)97%的相似度對(duì)優(yōu)化序列進(jìn)行OTU聚類，消除嵌合體，并統(tǒng)計(jì)不同水平下各樣品菌群結(jié)構(gòu)的組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響（見(jiàn)表3）

由表3 可知，1～21 日齡，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組肉仔雞平均采食量、平均日增重、料重比差異均不顯著（P＞0.05）。22～42日齡，試驗(yàn)組肉雞的平均日增重顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。1～42日齡，試驗(yàn)組肉雞的平均日增重顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），肉雞42日齡體重顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.2 納豆芽孢桿菌對(duì)肉仔雞血清免疫的影響（見(jiàn)表4）

由表4 可知，與對(duì)照組相比，21 日齡和42 日齡試驗(yàn)組肉仔雞血清IgA和IgG含量差異不顯著（P＞0.05），IgM含量分別升高了37.63%、38.85%（P＜0.01）。

2.3 納豆芽孢桿菌對(duì)肉仔空腸炎癥因子的影響（見(jiàn)表5）

表5 納豆芽孢桿菌對(duì)肉仔雞空腸炎癥因子的影響 單位：g/L

由表5 可知，與對(duì)照組相比，21 日齡試驗(yàn)組肉雞空腸黏膜IL-1β的含量下降21.97%（P＞0.05），42日齡肉雞空腸IL-1β 的含量極顯著下降47.02%（P＜0.01）。21、42日齡試驗(yàn)組肉雞空腸黏膜IL-6、TNF-α的含量均有不同程度降低（P＞0.05），IL-10 的含量具有一定程度的提高（P＞0.05）。

2.4 納豆芽孢桿菌對(duì)肉仔雞盲腸微生物區(qū)系的影響

2.4.1 盲腸微生物α多樣性分析

通過(guò)高通量測(cè)序分析最終獲得3 514 657 條有效序列，平均長(zhǎng)度416 bp。按照97%相似性對(duì)非重復(fù)效序列進(jìn)行OTU聚類分析，得到所有樣本平均聚類的OTU數(shù)目為648 個(gè)。對(duì)序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣并獲得對(duì)應(yīng)的數(shù)量構(gòu)建稀釋曲線，見(jiàn)圖1。

圖1 稀釋曲線

由圖1 可知，該曲線趨于平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大并且樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。

納豆芽孢桿菌對(duì)肉仔雞盲腸菌群多樣性的影響見(jiàn)表6。由表6 可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組肉雞腸道微生物多樣性有所提高。對(duì)照組和試驗(yàn)組盲腸菌群測(cè)序覆蓋率達(dá)到99.87%，說(shuō)明樣本中未檢測(cè)序列的概率很低。各組間42 日齡肉雞盲腸生物群落α 多樣性指數(shù)差異均不顯著（P＞0.05）。

表6 納豆芽孢桿菌對(duì)肉仔雞盲腸菌群多樣性的影響

2.4.2 盲腸微生物Beta多樣性分析（見(jiàn)圖2）

圖2 盲腸微生物Beta多樣性分析

由圖2 可知，根據(jù)樣品間距離，微生物群落有部分相似性，群落結(jié)構(gòu)相似度較高，分析表明對(duì)照組和處理組差異顯著（P＜0.05），同組微生物具有明顯聚類。

2.4.3 盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu)分析（見(jiàn)圖3～圖5）

圖3 42日齡盲腸菌群門水平相對(duì)豐度

圖4 42日齡盲腸菌群屬水平相對(duì)豐度

圖5 腸道微生物菌群屬水平組間差異

由圖3 可知，對(duì)照組和試驗(yàn)組肉仔雞盲腸菌群由厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobaceteriota）和變形菌門（Proteobacteria）等菌門組成，是不同組別中菌群的主要組成成分，其中前4種微生物大約占群落總數(shù)的98%。

由圖4 可知，對(duì)照組和試驗(yàn)組肉仔雞盲腸菌群由另枝菌屬（Alistipes）、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、未分類f_norank_o_梭菌目_UCG-014（norank_f_norank_o_Clostridia-UCG-014）、 未分類_f_毛螺菌屬（unclassified_f_Lachnospiraceae）、梭菌目vadin BB60 菌科的 norank_f_ 菌屬 （noramk_f__Clostridiales_vadin BB60_group） 、 瘤 胃 菌 屬（Ruminococcus_torques_group）、Barnesiella、巨單胞菌屬（Megamonas）、羅姆布茨菌（Romboutsia）、布勞特氏菌屬 （Blautia）、 雙歧桿菌屬 （Bifidobacterium）、Shuttleworthia、 Colidextribacter、 考 拉 桿 菌 屬（Phascolarctobacterium）等其他菌門組成，是不同組別中菌群的主要組成成分，其中前10種微生物大約占群落總數(shù)的74%。

由圖5 可知，試驗(yàn)組Enorma、未分類_f_黃桿菌屬（norank_f_Flavobacteriaceae）、Paludicola顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 納豆芽孢桿菌對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，納豆芽孢桿菌能夠降低肉仔雞腹部脂肪的堆積，顯著提高肉雞日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率[11]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加納豆芽孢桿菌可顯著提高肉仔雞平均日增重、降低料重比，與上述試驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明納豆芽孢桿菌能夠顯著提高肉仔雞的生長(zhǎng)性能。

3.2 納豆芽孢桿菌對(duì)肉仔雞血清免疫的影響

IgM 是抗原刺激后產(chǎn)生的第一種抗體，可以通過(guò)殺菌、激活補(bǔ)體等作用提高機(jī)體免疫功能[12-13]。據(jù)報(bào)道，肉仔雞日糧中添加不同劑量復(fù)合益生菌后可顯著提高血清IgG和IgM含量[14]。張俊瑜等[15]研究發(fā)現(xiàn)，肉雞日糧中加入不同水平的納豆芽孢桿菌均能夠提高血清IgG、IgM、IgA含量，與胥振國(guó)等[16]的研究結(jié)論一致。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，日糧中添加納豆芽孢桿菌提高肉仔雞血清IgA、IgG、IgM 含量，表明納豆芽孢桿菌對(duì)肉仔雞的機(jī)體免疫有一定的促進(jìn)作用，可減輕肉仔雞炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

3.3 納豆芽孢桿菌對(duì)肉仔雞腸道炎癥的影響

當(dāng)病原菌進(jìn)入腸道后，腸相關(guān)淋巴樣組織（gutassociated lymphoid tissue，GALT）釋放多種細(xì)胞因子（如白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、干擾素等物質(zhì)），可有效避免有害病菌入侵，維持腸道健康[17]。細(xì)胞因子參與和介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)[18]，根據(jù)細(xì)胞因子的作用可分為參與促進(jìn)炎癥反應(yīng)的促炎因子（IL-6、IL-1β、TNF-α 等）以及具有緩解炎癥反應(yīng)的抗炎因子（IL-10、IL-4等）[19]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥時(shí)，機(jī)體內(nèi)促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-1β含量升高，導(dǎo)致炎癥加劇[20]。趙會(huì)利等[21]發(fā)現(xiàn)，將納豆芽孢桿菌與牛奶混合飼喂?fàn)倥？山档蛿嗄虪倥L-6和IL-1β 的含量，緩解犢牛的斷奶應(yīng)激，從而影響犢牛的生長(zhǎng)發(fā)育。在本試驗(yàn)中，納豆芽孢桿菌能夠降低肉仔雞腸道黏膜促炎因子IL-1β 的含量，從而調(diào)節(jié)肉仔雞腸道免疫系統(tǒng)保持穩(wěn)定。

3.4 納豆芽孢桿菌對(duì)肉仔雞腸道菌群的影響

腸道是動(dòng)物機(jī)體的重要消化器官，包含大量的微生物。腸道微生物對(duì)機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)代謝、生長(zhǎng)起重要作用，也是導(dǎo)致動(dòng)物腸道免疫系統(tǒng)成熟的重要因素。因此，腸道微生物菌群的數(shù)量與結(jié)構(gòu)影響著動(dòng)物機(jī)體的消化和健康。動(dòng)物機(jī)體受到品種、日糧、所處環(huán)境尤其是胃腸道環(huán)境的變化時(shí)，能夠引起腸道微生物的變化，進(jìn)而對(duì)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生影響，因此，動(dòng)物機(jī)體與其腸道菌群之間存在共生關(guān)系[22-23]。

腸道菌群α多樣性中，Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)反映了菌群的豐富程度，其值越大，菌群豐富度越大；Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)反映了腸道菌群的多樣性，Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，物種多樣性越大[24]。隨著腸道菌群的多樣性增加，腸道微生物群對(duì)入侵細(xì)菌的抵抗力也進(jìn)一步增強(qiáng)，兩者呈正相關(guān)[25]。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組肉仔雞盲腸中Shannon 指數(shù)、Simpson指數(shù)均有不同程度的上升和下降趨勢(shì)，說(shuō)明添加納豆芽孢桿菌能豐富腸道菌群多樣性。本試驗(yàn)基于PCoA分析發(fā)現(xiàn)，納豆芽孢桿菌改變了菌群結(jié)構(gòu)。腸道菌群結(jié)構(gòu)與動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育和健康存在密切聯(lián)系，對(duì)動(dòng)物機(jī)體物質(zhì)代謝、營(yíng)養(yǎng)吸收、免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)屏障等方面具有重要作用[26]。有研究顯示，添加芽孢桿菌可調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群組成及維持腸道健康[27]。黃俊文等[28]研究發(fā)現(xiàn)，添加納豆芽孢桿菌仔豬腸道內(nèi)容物中乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量上升，腸黏膜中乳酸桿菌數(shù)量上升且大腸桿菌數(shù)量下降。吳高峰等[29]對(duì)小鼠灌胃納豆芽孢桿菌溶液，結(jié)果顯示，腸道益生菌群（包括乳酸桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌等）顯著增多，腸道致病菌群（包括腸球菌、腸桿菌、變形桿菌等）均明顯減少。吳德華等[30]研究在仔犬日糧中添加納豆芽孢桿菌也得到了類似結(jié)果。鐘青萍等[31]研究發(fā)現(xiàn)，納豆芽孢桿菌對(duì)一些常見(jiàn)的腸道致病菌也具有明顯的抑制作用，如沙門氏菌、大腸桿菌等。陳冬金等[32]研究表明，納豆菌復(fù)合組unclassified_o__Clostridiales的相對(duì)豐度顯著降低。楊利娜等[33]研究發(fā)現(xiàn)，單胃動(dòng)物盲腸中的微生物多樣性最高，其優(yōu)勢(shì)菌群主要有擬桿菌門與厚壁菌門。原因可能是納豆芽孢桿菌分泌抗菌物質(zhì)，如吡啶二羧酸和多黏菌素抑制致病菌（如痢疾桿菌、原發(fā)性大腸桿菌、傷寒菌、沙門氏菌等）的生長(zhǎng)，拮抗腸內(nèi)病原細(xì)胞，緩解腸道疾病[5,34-35]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在肉仔雞的腸道微生物中，厚壁菌門相對(duì)豐度最高，其次為擬桿菌門、放線菌門、變形菌門、厚壁菌門，上述均為優(yōu)勢(shì)菌群；在屬水平以另枝菌屬、糞桿菌屬、擬桿菌屬、未分類f_norank_o_梭菌目_UCG-014 為主，對(duì)照組Ruminococcaceae_UCG-010 顯著高于納豆菌處理組，提高了另枝桿菌的相對(duì)豐度，糞桿菌屬、擬桿菌屬的相對(duì)豐度有所降低，改變了肉仔雞盲腸優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)的占比，說(shuō)明飼喂納豆芽孢桿菌能夠有效調(diào)節(jié)腸道菌群比例，改變?nèi)庾须u腸道菌群組成，進(jìn)而提高了肉仔雞的生長(zhǎng)性能。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，納豆芽孢桿菌可改善肉仔雞腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高腸道菌群豐富度和多樣性，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，進(jìn)而提高肉仔雞生長(zhǎng)性能。