汪張偉　徐婉清　查小明

摘 要：針對(duì)傳統(tǒng)骨科用粘合材料粘合性能和生物相容性能較低的問題，提出一種新型骨科用粘合材料的制備，通過豬皮搭載拉伸實(shí)驗(yàn)和生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)對(duì)粘合材料的性能進(jìn)行研究。結(jié)果表明：在溫度37 ℃條件下養(yǎng)護(hù)12 h的樣品（SFDG12），豬皮搭載拉伸強(qiáng)度為181.5 kPa，細(xì)胞存活率高于90%，對(duì)細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)、遷移都有一定的促進(jìn)作用，具有較好的粘合性能和生物相容性能，可在骨科中傷口愈合緩慢區(qū)域使用。

關(guān)鍵詞：膠合材料；骨科；生物相容性；細(xì)胞繁殖

中圖分類號(hào)：TQ931;TQ431.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1001-5922（2023）06-0030-04

Preparation and performance study of orthopedic medical adhesive materials

WANG Zhangwei 1，XU Wanqing 2，ZHA Xiaoming 1

（1.The First Clinical Medical College of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China;2.Medical College of Nantong University，Nantong 226001，Jiangsu China）

Abstract：In view of the low adhesion and biocompatibility of traditional orthopaedic medical adhesive materials，a new orthopaedic medical adhesive material was prepared.The properties of the adhesive material were studied by piggy skin loading tensile test and biological evaluation test.The results show that the tensile strength of pig skin is 181.5 kPa and the cell survival rate is higher than 90% after 12 hours of curing at 37?? ℃，which can promote cell adhesion，growth and migration.It has good adhesion and biocompatibility，which can be used in orthopedic areas where wound healing is slow.

Key words：gluing materials;orthopedics;biocompatibility;cell reproduction

醫(yī)用膠合劑是目前較為常用的一種醫(yī)學(xué)材料，在軟組織和骨骼損傷這種恢復(fù)較慢的傷口中，發(fā)揮著重要的作用。但受現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的影響，目前臨床所用的膠合劑存在膠合強(qiáng)度低和生物相容性較差的問題，使得醫(yī)用膠合劑的應(yīng)用受到了很大的限制。為了尋找性能更優(yōu)的醫(yī)用膠合劑，部分學(xué)者也進(jìn)行了很多研究，如從材料出發(fā)，研究了絲素蛋白材料的生物相容性。結(jié)果表明，絲素蛋白制作的絲素凝膠和絲素支架溶血率均低于5%，對(duì)細(xì)胞形態(tài)不產(chǎn)生影響，具備較好的生物相容性[1]。通過對(duì)絲素蛋白的組成結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)進(jìn)行研究，探討了其在骨科損傷治療中的應(yīng)用[2]?；诖?，本研究在以絲素蛋白為基底，設(shè)計(jì)并制備了骨科絲素蛋白－多巴胺－京尼平粘合劑，并對(duì)其性能進(jìn)行研究，為骨科醫(yī)用膠合劑的發(fā)展提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

主要材料：羥基琥珀酰亞胺（ NHS）（AR），新素新材料；1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）（AR），源葉生物科技；碳酸鈉（AR），海之源化工；蠶繭（標(biāo)準(zhǔn)品），先蠶絲綢生物科技；體積分?jǐn)?shù)75%乙醇，君雁藥業(yè)；鹽酸多巴胺（AR），昊毅新材料科技；京尼平（AR），華翔科潔生物技術(shù)；PBS緩沖液（標(biāo)準(zhǔn)品），卡諾斯科技；SBF模擬體液（pH=7.4），源葉生物科技。

主要設(shè)備：DHG101A-4電熱鼓風(fēng)干燥箱，蘇珀儀器；SHZ-D磁力攪拌器，凌科實(shí)業(yè)發(fā)展；M16RS高速低溫離心機(jī)，邁皋科學(xué)儀器；ZY-9000M電子材料試驗(yàn)機(jī)，卓亞儀器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 絲素蛋白溶液的制備

（1）將4.24 g碳酸鈉溶入2 L去離子水，煮沸放入5 g去除了污染部分的蠶繭，繼續(xù)煮沸并不斷攪拌，時(shí)間為30 min；

（2）取出絲素后，放入裝有2 L水的燒杯中，慢慢攪拌洗去絲素中的雜質(zhì)，攪拌時(shí)間為20 min。倒去燒杯中溶液，取出絲素，完成清洗過程[3]；

（3）重復(fù)“步驟（2）”清洗過程3次，撈出洗凈的絲素平鋪在錫紙上，然后置于DHG101A-4型電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干，烘干溫度為60 ℃。隔固定時(shí)間稱重，絲素質(zhì)量不發(fā)生改變即可認(rèn)為絲素已經(jīng)完全烘干；

（4）將2 g烘干后絲素填充在60 mL樣品瓶底部，然后放入8 mL濃度為9.3 mol/L的溴化鋰溶液，在DHG101A-4型電熱鼓風(fēng)干燥箱中進(jìn)行溶解反應(yīng)，反應(yīng)溫度和時(shí)間分別為60 ℃和4 h；

（5）將溶解后溶液放入透析袋中，放入SHZ-D型磁力攪拌器上，用去離子水慢慢攪拌透析2 d，在第1、4 h換一次水，然后間隔12 h換一次水。在攪拌時(shí)要注意不要讓透析袋受到破壞；

（6）將透析完成后絲素置于M16RS型高速低溫離心機(jī)內(nèi)進(jìn)行離心處理，除去不溶物質(zhì)，離心轉(zhuǎn)速、溫度和時(shí)間分別為7 800 r/min、4 ℃和20 min。根據(jù)溶液澄清情況選擇離心次數(shù)，待溶液完全澄清后，再次放入透析袋中；

（7）在聚乙二醇溶液中透析濃縮，得到絲素蛋白溶液（SF）。

1.2.2 粘合劑的制備

（1）將NHS和EDC放入制備的絲素蛋白溶液中，在冰浴條件中進(jìn)行攪拌，攪拌時(shí)間為30 min。攪拌結(jié)束后按照絲素蛋白羧基∶多巴胺=6∶1的摩爾比放入鹽酸多巴胺，繼續(xù)攪拌1 h；

（2）將混合溶液繼續(xù)放入透析袋中，放入冰箱中進(jìn)行透析，透析溫度和時(shí)間分別為4 ℃和1 d，得到絲素蛋白-多巴胺粘合劑；

（3）按照絲素蛋白羧基∶京尼平=1∶2的摩爾比加入京尼平溶液，避光攪拌30 min，得到絲素蛋白－多巴胺－京尼平粘合劑（SFDG）。

1.2.3 豬皮樣品的制備

提前將豬皮樣品制備成1 cm2大小，然后用10 μL粘合劑均勻覆涂在豬皮表面，然后將2片豬皮合在一起，用5 g砝碼壓制，使豬皮結(jié)合的更為緊密，壓制時(shí)間為10 s，得到豬皮粘合樣品[5]。將樣品用紗布包裹后置于模擬體液溶液中，然后放入DHG101A-4型電熱鼓風(fēng)干燥箱中，在溫度37 ℃條件下進(jìn)行養(yǎng)護(hù)。將養(yǎng)護(hù)0 h的樣品編號(hào)為SFDG0，養(yǎng)護(hù)12 h的樣品編號(hào)SFDG12。

1.3 性能測(cè)試

1.3.1 粘合性能

用電子材料試驗(yàn)機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行拉伸強(qiáng)度測(cè)試，表征粘合劑的粘合性能[6]。

1.3.2 體外降解性能

將待測(cè)樣品冷凍干燥后，制備成5 mm3大小的正方體，并對(duì)制作的樣品進(jìn)行稱重，按照浴比1∶100將樣品放入模擬體液中進(jìn)行降解（SBF模擬體液pH=7.4，Pronase E模擬體液質(zhì)量濃度為10 mg/mL），每天更換降解液，隔天將樣品撈出烘干稱重[7-8]。

殘留率表達(dá)式為[9]：

Rm=（Mdt/Mi）×100%（1）式中：Rm為降解率；Mdt為相應(yīng)天數(shù)后烘干后質(zhì)量；Mi為初始質(zhì)量。

1.3.3 細(xì)胞存活率試驗(yàn)

將不同質(zhì)量冷凍干燥后的樣品粉末放入EP管，然后置于超凈臺(tái)上用紫外光照射，在照射時(shí)要注意每隔4 h搖晃一次樣品，保證樣品光照均勻，照射時(shí)間為24 h。在試驗(yàn)開始前，將樣品在體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液中浸泡10 min，然后在M16RS型高速低溫離心機(jī)的作用下進(jìn)行離心處理，離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間分別為800 r/min和5 min。去掉上清液后用PBS溶液清洗3次，然后配制成不同含量的加藥細(xì)胞培養(yǎng)基。將溶解后3T3小鼠成纖維細(xì)胞放入9 mL正常細(xì)胞培養(yǎng)基中，并用槍頭輕輕吹打，使之混合均勻。將混合液置于高速低溫離心機(jī)中進(jìn)行離心處理，去除離心液后放入1 mL含待測(cè)樣品的細(xì)胞培養(yǎng)液，混合均勻。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法計(jì)算細(xì)胞含量。

1.3.4 細(xì)胞遷移試驗(yàn)

提前將6孔板上布滿細(xì)胞，劃痕并用PBS溶液清洗，去除刮下的細(xì)胞，放在相應(yīng)濃度的加藥培養(yǎng)基內(nèi)，置于溫度為37 ℃，5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時(shí)拍照取樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 粘合性能評(píng)價(jià)

本研究制備的粘膠劑主要用于骨科，人體正常溫度為37 ℃，通過豬皮搭載拉伸強(qiáng)度探究在該溫度下粘膠劑的粘合性能，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，在該溫度條件下，養(yǎng)護(hù)時(shí)間在1 h內(nèi)，SF的豬皮搭載拉伸強(qiáng)度約為1 kPa左右，隨時(shí)間的延伸，豬皮搭載拉伸強(qiáng)度逐漸增加。當(dāng)養(yǎng)護(hù)時(shí)間增加到9 h時(shí)，豬皮搭載拉伸強(qiáng)度隨之增加到58.5 kPa，繼續(xù)增加時(shí)間，豬皮搭載拉伸強(qiáng)度慢慢趨于平衡；當(dāng)時(shí)間達(dá)到12 h時(shí)，豬皮搭載拉伸強(qiáng)度可以達(dá)到66.5 kPa。研究發(fā)現(xiàn)，SF豬皮搭載拉伸強(qiáng)度是由SF的固化程度決定的[10-11]。當(dāng)養(yǎng)護(hù)時(shí)間小于等于3 h時(shí)，SF在豬皮間以溶液的形式存在;養(yǎng)護(hù)時(shí)間達(dá)到5 h時(shí)，SF才開始慢慢的成膜，豬皮搭載拉伸強(qiáng)度隨之提升。經(jīng)過多巴胺和京尼平處理后，養(yǎng)護(hù)時(shí)間為12 h時(shí)，豬皮搭載拉伸強(qiáng)度達(dá)到181.5 kPa。結(jié)果表明，多巴胺、京尼平對(duì)提升SF的粘合強(qiáng)度產(chǎn)生了積極的作用。這是因?yàn)樵赟F體系內(nèi)引入多巴胺后，二者產(chǎn)生反應(yīng)，產(chǎn)物不溶于水，在兒茶酚基的作用下，粘合劑與粘合界面的連接性更強(qiáng)，因此豬皮搭載拉伸強(qiáng)度有所上升。而京尼平的加入使得SF分子作用力有所增加，進(jìn)而對(duì)粘合劑的粘合強(qiáng)度有所增加[12]。養(yǎng)護(hù)時(shí)間為12 h時(shí)，豬皮搭載拉伸強(qiáng)度更好，因此后續(xù)試驗(yàn)主要對(duì)SFDG0（對(duì)照組）和SFDG12（試驗(yàn)組）進(jìn)行研究。

2.2 體外降解性能評(píng)價(jià)

體外降解性能的是粘合劑生物學(xué)安全性的重要指標(biāo)，為了探究本研究制備的粘合劑體外降解性，選擇SFDG0樣品和SFDG12樣品，分別浸泡在SFB模擬體液和Pronase E模擬體液中，觀察樣品在模擬體液中的降解情況，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，SFDG0樣品在SFB模擬體液中浸泡2 d后，殘留率約為93%，繼續(xù)增加浸泡時(shí)間，樣品幾乎不再發(fā)生降解，樣品殘留率一直維持在90%左右。而在Pronase E模擬體液中，SFDG0樣品2 d殘留率約為87%，且降解率隨浸泡時(shí)間的增加而下降；30 d時(shí)，殘留率約為51%。而SFDG12樣品在SFB模擬體液中降解速率較慢，2 d時(shí)，樣品殘留率約為98%，繼續(xù)增加浸泡時(shí)間，樣品殘留率慢慢下降；當(dāng)達(dá)到20 d后，樣品降解達(dá)到平衡，繼續(xù)增加浸泡時(shí)間，樣品殘留率幾乎不再發(fā)生變化；30 d樣品殘留率約為92%。SFDG12樣品在Pronase E模擬體液中降解速率較快，2 d殘留率約為89%，繼續(xù)增加浸泡時(shí)間，樣品緩慢降解；浸泡時(shí)間達(dá)到30 d時(shí)，樣品殘留率約為70%。通過對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，在同等條件下，SFDG12樣品的殘留率明顯高于SFDG0樣品，出現(xiàn)這個(gè)變化的主要原因在于，SFDG0樣品養(yǎng)護(hù)時(shí)間較短，京尼平的交聯(lián)作用還沒有發(fā)揮出來，因此主要是SF降解在主導(dǎo)。而SFDG12樣品中，受京尼平交聯(lián)作用影響，可降解程度降低；但整個(gè)粘合劑是以SF溶液為基底，因此粘合劑仍具備一定的可降解性能[13-14]。

通過以上分析可以發(fā)現(xiàn)，雖然粘合劑整體降解能力較低，但粘合劑的基底為多種必須氨基酸組成的SF溶液，這些氨基酸對(duì)細(xì)胞粘附產(chǎn)生了積極的作用。同時(shí)，受SF特殊結(jié)構(gòu)的影響，粘合劑可幫助細(xì)胞與外界的物質(zhì)交換，提供空間結(jié)構(gòu)供細(xì)胞的增長(zhǎng)，進(jìn)而增加了細(xì)胞粘附性[15]。這些都說明本研究制備的粘合劑對(duì)細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)都產(chǎn)生了積極的作用，可在骨科中傷口愈合緩慢區(qū)域使用。

2.3 細(xì)胞存活率評(píng)價(jià)

圖3為粘合劑細(xì)胞存活率結(jié)果。

從圖3可以看出，所有樣品的細(xì)胞存活率均隨樣品使用濃度的減小而增加，當(dāng)SF樣品質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率約為98%。從這個(gè)變化看，SF自身的生物相容性較好。制作成SFDG粘合劑后，隨樣品質(zhì)量濃度的降低，細(xì)胞存活率雖然有所降低，但還是保持了一個(gè)相對(duì)較高的值。且SFDG0樣品的最高細(xì)胞存活率為95%，比SFDG12樣品最高細(xì)胞存活率的93%高約2個(gè)百分點(diǎn)。這個(gè)變化說明樣品在37 ℃環(huán)境下處理的時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞存活率反而產(chǎn)生一些不利影響。出現(xiàn)這個(gè)變化的主要原因：在溫度處理的過程中，粘合劑內(nèi)部元素結(jié)構(gòu)發(fā)生了一些改變，生成了多巴醌和梔子藍(lán)色素，降低了細(xì)胞存活率[16]。這也說明粘合劑樣品生物相容性較好。

圖4為DiO染色細(xì)胞狀態(tài)結(jié)果。

從圖4可以看出，加入京尼平后，細(xì)胞增殖較為明顯，細(xì)胞膜包被完整，正常貼壁生長(zhǎng)。但細(xì)胞增殖速度隨溫度養(yǎng)護(hù)時(shí)間的增加而降低，且分布比空白樣品更為不均[17-18]。同時(shí)，觀察細(xì)胞狀形狀可以發(fā)現(xiàn)，所有樣品細(xì)胞整體皆表現(xiàn)出星形的扁平狀。這些都說明本研究制備的膠合劑具備優(yōu)良的生物相容性，可以應(yīng)用于骨科治療中。

2.4 細(xì)胞遷移評(píng)價(jià)

為了探究粘合劑是否對(duì)細(xì)胞的遷移性產(chǎn)生影響，選擇細(xì)胞劃痕試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，具體結(jié)果如圖5所示。

從圖5可以看出，2組試驗(yàn)在0 h時(shí)，均可以看見較為明顯的、沒有細(xì)胞殘留的劃痕。當(dāng)養(yǎng)護(hù)時(shí)間增加到6 h時(shí)，2組試驗(yàn)的劃痕邊緣皆出現(xiàn)了模糊的情況；當(dāng)養(yǎng)護(hù)時(shí)間達(dá)到24 h時(shí)，2組樣品的細(xì)胞已經(jīng)完全鋪在劃痕上，基本看不到劃痕的存在，且2組樣品并未出現(xiàn)明顯的區(qū)別[19]。這些變化都說明了本研究制備的SFDG12膠合劑對(duì)細(xì)胞的遷移不產(chǎn)生影響[20]。這也說明當(dāng)本研究制備的骨科膠合劑在實(shí)際應(yīng)用的過程中，不阻礙傷口附近細(xì)胞遷移和繁殖，對(duì)促進(jìn)傷口愈合產(chǎn)生積極的影響。

3 結(jié)語(yǔ)

本試驗(yàn)制備的醫(yī)用骨科粘合劑綜合性能良好，不會(huì)對(duì)細(xì)胞的存活和遷移產(chǎn)生不利影響，可以在骨科創(chuàng)傷治療中使用。

（1）在體內(nèi)應(yīng)用溫度條件下（37 ℃），SFDG表現(xiàn)出較好的粘合性能，粘合性能高于臨床纖維蛋白膠，證實(shí)了該膠合劑可以在人體溫度條件下使用；

（2）SFGD膠合劑具備一定的可降解性能，SFDG12樣品在Pronase E模擬體液中浸泡30 d后，殘留率約為70%。通過分析可以發(fā)現(xiàn)，本研究制備的SFDG12粘合劑能促進(jìn)細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)，可在骨科中傷口愈合緩慢區(qū)域使用；

（3）質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL的SFDG12樣品細(xì)胞存活率高于90%，細(xì)胞增殖較為明顯，細(xì)胞膜包被完整，正常貼壁生長(zhǎng)，形狀為星形的扁平狀；

（4）SFDG12膠合劑對(duì)細(xì)胞的遷移不產(chǎn)生影響，在骨科傷口愈合的過程中，不阻礙傷口附近細(xì)胞遷移和繁殖，對(duì)促進(jìn)傷口愈合產(chǎn)生積極的影響。

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收稿日期：2023-01-16；修回日期：2023-05-10

作者簡(jiǎn)介：汪張偉（1995-），男，碩士在讀，住院醫(yī)師，研究方向：外科學(xué);E-mail：wangzhangwei1108@163.com。

通訊作者：查小明（1968-），男，醫(yī)學(xué)博士，副教授，主任醫(yī)師，研究方向：外科學(xué);E-mail：zhaxm_nj@163.com。

引文格式：汪張偉，徐婉清，查小明.骨科用絲素蛋白粘合劑的制備及性能研究[J].粘接，2023，50（6）：30-33.