祖 玲, 李萬(wàn)里, 劉天奇

原發(fā)性肝癌是全球常見的腫瘤之一,在所有癌癥中其發(fā)病率和病死率分別排在第6位和第3位[1]。原發(fā)性肝癌主要包括肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)和肝內(nèi)膽管癌兩種類型,其中HCC占75%～85%[2],是肝癌患者的主要死亡原因[3]。由于HCC的瘤內(nèi)異質(zhì)性和耐藥性[4],患者可用的治療方法有限,預(yù)后往往不理想,5年生存率約為18.4%[5-6]。因此,迫切需要探索更有效的治療靶點(diǎn)來(lái)改善HCC患者的生存預(yù)后。有研究表明,用真核翻譯起始因子4E家族成員3(eukaryotic translation initiation factor 4E family member 3,eIF4E3)、GEMIN5和NCBP2基因構(gòu)建的N7-甲基腺苷風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(m7G Risk Score,MRS)可用于評(píng)估大腸癌患者的預(yù)后情況,低MRS組表現(xiàn)出更好的免疫活性,對(duì)免疫治療的反應(yīng)更好[7]。eIF4E3是真核翻譯起始因子,位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中,支持mRNA的輸出和翻譯。既往研究表明,eIF4E3在急性髓系白血病、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中起抑癌作用[8]。也有研究發(fā)現(xiàn)eIF4E3可以阻礙致癌轉(zhuǎn)化,并在某些癌癥中表達(dá)缺失,這一機(jī)制可能具有重要的生物學(xué)和臨床意義[9]。但是,目前關(guān)于eIF4E3與HCC發(fā)生、發(fā)展關(guān)聯(lián)性的研究較少。鑒此,本研究旨在探討eIF4E3在HCC中的表達(dá)水平,分析其與預(yù)后、腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)聯(lián)性,并通過(guò)不同數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行交叉驗(yàn)證,為eIF4E3作為HCC的治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)采集 以公共數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)和生信分析的網(wǎng)頁(yè)工具為基礎(chǔ)開展研究。以“HCC”“transcriptome profiling”“gene expression quantification”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,得到TCGA-HCC數(shù)據(jù)集,其中包含正常肝臟組織和HCC組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù),以及標(biāo)本來(lái)源患者的臨床資料。生存數(shù)據(jù)缺失的樣本不納入生存分析。

1.2eIF4E3的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)聯(lián)分析 應(yīng)用腫瘤免疫評(píng)估資源(Tumor Immune Estimate Resource,TIMER)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)探索eIF4E3在不同腫瘤與正常組織的表達(dá)差異[10]。應(yīng)用癌癥基因集分析(Gene Set Cancer Analysis,GSCA)數(shù)據(jù)庫(kù)[11](http://bioinfo.life.hust.edu.cn/GSCA)、肝細(xì)胞癌整合分子數(shù)據(jù)庫(kù)(Hepatocellular Carcinoma Database,HCCDB)[12](http://lifeome.net/database/hccdb/search.html)和UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)[13](http://ualcan.path.uab.edu)分析eIF4E3在HCC組織和正常肝組織中轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異。應(yīng)用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析eIF4E3表達(dá)情況與HCC臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性。應(yīng)用GSCA的生存分析模塊和Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)[14](http://kmplot.com/analysis/)進(jìn)行生存分析。

1.3共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及功能富集分析 應(yīng)用Linked Omics數(shù)據(jù)庫(kù)[15](http://www.linkedomics.org/login.php)鑒定eIF4E3共表達(dá)基因。以P<0.01、R>|0.4|作為篩選標(biāo)準(zhǔn),將所得到的共表達(dá)基因通過(guò)Linked Omics數(shù)據(jù)庫(kù)的基因富集分析模塊和Sanger Box生物信息分析平臺(tái)(http://sangerbox.com/Tool)進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析,探索eIF4E3共表達(dá)基因的主要功能。

1.4免疫滲透分析 通過(guò)腫瘤免疫相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)(Tumor-Immune System Interactions Database,TISIDB)(http://cis.hku.hk/TISIDB/index.php)探討eIF4E3表達(dá)與HCC免疫亞型及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度的關(guān)聯(lián)性[16]。應(yīng)用Sanger Box生物信息分析平臺(tái)的CIBERSORT算法探索HCC中eIF4E3表達(dá)情況與22種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性[17-18]。通過(guò)Estimate算法進(jìn)一步預(yù)測(cè)腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)中的腫瘤純度,包括間質(zhì)評(píng)分(捕獲腫瘤組織中間質(zhì)的存在)、免疫評(píng)分(代表免疫細(xì)胞在腫瘤組織中的滲透程度)和估計(jì)評(píng)分(推斷腫瘤純度)[19]。通過(guò)免疫表觀評(píng)分(immune phenotype score,IPS)模塊探索HCC中eIF4E3表達(dá)與IPS的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1eIF4E3在HCC組織中的表達(dá)情況 基于TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)資料的分析結(jié)果顯示,eIF4E3 mRNA在HCC、膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤(rùn)癌、結(jié)腸癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、肺鱗癌、前列腺腺癌、直腸腺癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)下調(diào),在膽管癌中呈高表達(dá),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1?。進(jìn)一步通過(guò)GSCA、UALCAN和HCCDB數(shù)據(jù)庫(kù)資料進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果證實(shí)eIF4E3在HCC中呈低表達(dá),與正常肝組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1?～?。

?針對(duì)TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)分析eIF4E3在不同腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)差異情況;?GSCA分析顯示eIF4E3在腫瘤組織中低表達(dá)(P<0.001);?應(yīng)用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)資料分析eIF4E3在HCC組織和正常肝組織中的表達(dá)差異(P=0.002);?應(yīng)用HCCDB數(shù)據(jù)庫(kù)資料分析eIF4E3在HCC組織和正常肝組織中的表達(dá)差異(紅色代表腫瘤組織,灰色代表正常組織)。*P<0.05

2.2eIF4E3表達(dá)水平與患者性別、腫瘤分期的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 基于UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)資料分析結(jié)果顯示,正常肝組織eIF4E3表達(dá)水平顯著高于Stage 1和Stage 2期的HCC組織(P<0.05),且腫瘤分期為Stage 3的HCC組織eIF4E3表達(dá)水平顯著高于Stage 1(P=0.047)。見圖2?。女性HCC患者eIF4E3表達(dá)水平顯著高于男性(P=0.002)。見圖2?。

圖2 eIF4E3表達(dá)水平與患者性別、HCC病理分期的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果圖(*P<0.05)

2.3eIF4E3表達(dá)水平與HCC患者生存預(yù)后的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 基于GSCA數(shù)據(jù)庫(kù)資料的分析結(jié)果顯示,以eIF4E3表達(dá)量的中位數(shù)為界值將HCC患者分為eIF4E3低表達(dá)組(185例)和eIF4E3高表達(dá)組(185例),eIF4E3低表達(dá)組的總生存期(overall survival,OS)、無(wú)病生存期(disease-free survival,DFS)、無(wú)病進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)和無(wú)疾病間隔(disease-free interval,DFI)均較eIF4E3高表達(dá)組顯著縮短(P<0.05)。見圖3?～?。進(jìn)一步通過(guò)Kaplan-Meier Plotter驗(yàn)證eIF4E3表達(dá)與患者生存預(yù)后的關(guān)聯(lián)性,結(jié)果顯示eIF4E3低表達(dá)HCC患者的OS較eIF4E3高表達(dá)者更差,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3?。

?兩組OS比較的生存曲線圖,P=0.029;?兩組PFS比較的生存曲線圖,P=0.024;?兩組DFS比較的生存曲線圖,P=0.018;?兩組DFI比較的生存曲線圖,P=0.032;?基于Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)資料的兩組OS比較的生存曲線圖,P=0.014

2.4eIF4E3功能富集分析結(jié)果 應(yīng)用Linked Omics數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定eIF4E3的共表達(dá)基因(見圖4?),排位前50的eIF4E3正、負(fù)相關(guān)基因的熱圖見圖4??。按其相關(guān)程度排前3位的正相關(guān)基因分別是C14orf37、STK17B和TLR2(r=0.601,P<0.001;r=0.596,P<0.001;r=0.575,P<0.001)。GO分析結(jié)果顯示,eIF4E3互作基因的生物過(guò)程(biological process,BP)主要集中在細(xì)胞黏附正向調(diào)節(jié)、T細(xì)胞活化過(guò)程、白細(xì)胞活化調(diào)節(jié)、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、線粒體基因表達(dá)、線粒體呼吸鏈復(fù)合物組裝和細(xì)胞質(zhì)翻譯等。見圖4?。KEGG分析結(jié)果顯示,eIF4E3的共表達(dá)基因富集在血小板活化、破骨細(xì)胞分化和細(xì)胞黏附等途徑。見圖4?。另外,通過(guò)Sanger Box網(wǎng)站篩選出529個(gè)共表達(dá)基因,并對(duì)其進(jìn)行GO分析和KEGG分析,結(jié)果顯示eIF4E3的表達(dá)可能通過(guò)調(diào)節(jié)TME的免疫反應(yīng)在HCC發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。見圖5。

2.5eIF4E3與TME中免疫浸潤(rùn)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果

TISIDB分析結(jié)果顯示,eIF4E3在HCC的不同免疫亞型中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖6?。eIF4E3在創(chuàng)面愈合亞型(C1型)和淋巴細(xì)胞耗盡亞型(C4型)中低表達(dá),在干擾素γ優(yōu)勢(shì)亞型(C2型)和炎性亞型(C3型)中高表達(dá)。eIF4E3表達(dá)水平與自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞(r=0.456,P<0.001)、Th1細(xì)胞(r=0.417,P<0.001)和CD8+效應(yīng)記憶T細(xì)胞(r=0.414,P<0.001)的浸潤(rùn)豐度呈正相關(guān)。見圖6?～?。Sanger Box數(shù)據(jù)庫(kù)的CIBERSORT模塊分析結(jié)果顯示,在22種免疫細(xì)胞中,eIF4E3表達(dá)水平與初始CD4 T細(xì)胞、靜息NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),與靜息CD4記憶T細(xì)胞、活化CD4記憶T細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞、活化樹突狀細(xì)胞、靜息樹突狀細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)豐度呈正相關(guān)(P<0.05)。見圖7?。Estimate模塊分析結(jié)果顯示,HCC中eIF4E3的表達(dá)水平與間質(zhì)評(píng)分、免疫評(píng)分以及估計(jì)評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.05)。見圖7?～?。Sanger Box生物信息分析平臺(tái)IPS模塊的分析結(jié)果顯示,eIF4E3表達(dá)水平與IPS呈正相關(guān)(P<0.05),提示eIF4E3表達(dá)量越低,患者的免疫治療反應(yīng)越差。見圖7?。

圖4 基于Linked Omics數(shù)據(jù)庫(kù)資料進(jìn)行的eIF4E3功能富集分析結(jié)果圖

?GO分析結(jié)果;?KEGG分析結(jié)果

?eIF4E3在HCC的不同免疫亞型中的表達(dá)水平比較結(jié)果;?～?eIF4E3表達(dá)水平與NK細(xì)胞、Th1細(xì)胞和CD8+效應(yīng)記憶T細(xì)胞浸潤(rùn)豐度的相關(guān)性分析結(jié)果

?應(yīng)用CIBERSORT算法得到eIF4E3表達(dá)水平與22種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度的關(guān)系(*P<0.05)。?～?應(yīng)用Estimate算法得到eIF4E3表達(dá)水平與HCC的間質(zhì)評(píng)分、免疫評(píng)分和估計(jì)評(píng)分的相關(guān)性;?LIHC中eIF4E3表達(dá)水平與IPS相關(guān)性

3 討論

3.1N7-甲基鳥苷(N7-methyladenosine,m7G)修飾與各種癌癥的發(fā)生、進(jìn)展及治療效果的關(guān)系已成為目前研究的熱點(diǎn)。eIF4E1在細(xì)胞質(zhì)中以m7G帽結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)發(fā)揮作用,運(yùn)輸一系列與細(xì)胞增殖、存活和轉(zhuǎn)移相關(guān)的mRNA,這可能是其致癌的主要機(jī)制[9]。eIF4E3是m7G相關(guān)基因,是eIF4E蛋白的第3亞家族[20],作為mRNA代謝調(diào)節(jié)因子,它可與m7G帽結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合,并在細(xì)胞內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)性抑制eIF4E1,是依賴于m7G非典型帽結(jié)合活性的腫瘤抑制因子[9]。研究發(fā)現(xiàn),eIF4E3在結(jié)腸癌組織、急性髓系白血病標(biāo)本以及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)下調(diào)[7,21]。也有研究表明,eIF4E3過(guò)表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞存活率提高有關(guān)[22],miR-501可通過(guò)靶向下調(diào)eIF4E3表達(dá)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[23]。

3.2HCC嚴(yán)重威脅人類生命健康,其危險(xiǎn)因素主要有肝炎病毒感染、飲酒、肥胖和黃曲霉毒素等[24]。雖然近年來(lái)HCC的治療已取得顯著進(jìn)展,但HCC的早期癥狀并不典型,缺乏特異度較高的生物標(biāo)志物輔助臨床診斷,大多數(shù)患者在確診時(shí)已至晚期,5年生存率僅為18.4%左右[6,25]。本文通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)探討eIF4E3作為診斷HCC及預(yù)測(cè)患者預(yù)后生物標(biāo)志物的應(yīng)用潛力。結(jié)果表明,eIF4E3在HCC組織中呈低表達(dá),這與Osborne等[8]的研究結(jié)果一致,且腫瘤分期為Stage 3的HCC組織eIF4E3表達(dá)水平顯著高于Stage 1;女性HCC患者eIF4E3表達(dá)水平顯著高于男性。進(jìn)一步的生存分析結(jié)果提示,eIF4E3低表達(dá)與患者較差的預(yù)后有關(guān),這與Wang等[22]的研究結(jié)論相符。GO分析和KEGG分析結(jié)果表明,eIF4E3的生物學(xué)功能主要與細(xì)胞黏附和免疫反應(yīng)有關(guān),且主要富集于PI3K/Akt信號(hào)通路以及癌癥途徑,提示eIF4E3對(duì)HCC的作用機(jī)制可能與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。

3.3腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞(tumor infiltrating immune cells,TIICs)可以調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[26],TME中的免疫細(xì)胞豐度以及腫瘤純度會(huì)影響HCC患者的預(yù)后及免疫治療效果[27]。本研究通過(guò)多個(gè)工具網(wǎng)站進(jìn)行交叉驗(yàn)證表明,eIF4E3表達(dá)水平影響免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度,與NK細(xì)胞、Th1細(xì)胞和CD8+效應(yīng)記憶T細(xì)胞的浸潤(rùn)豐度呈正相關(guān)。NK細(xì)胞和T細(xì)胞是典型的免疫促進(jìn)細(xì)胞,是HCC中主要負(fù)責(zé)殺傷癌細(xì)胞的淋巴細(xì)胞亞群[28]。Th1細(xì)胞具有抗原提呈的作用,使誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD8+T細(xì)胞具備更強(qiáng)的效應(yīng)功能,發(fā)揮免疫應(yīng)答作用[29]。本結(jié)果提示,在eIF4E3高表達(dá)的HCC中,免疫微環(huán)境具有較高的免疫原性,有利于抗腫瘤免疫功能執(zhí)行,遏制腫瘤的進(jìn)展。免疫檢查點(diǎn)(immune check point,ICP)基因?qū)γ庖呒?xì)胞功能及免疫治療效果有很大的影響[30],ICP抑制劑作為新興的腫瘤治療方法在癌癥治療方面取得了重大突破[31]。研究表明,HCC的程序性細(xì)胞死亡1(programmed cell death 1,PD-1)、程序性死亡受體-1配體(programmed death receptor-1 ligand,PD-L1)等ICP基因表達(dá)水平上升會(huì)導(dǎo)致免疫抑制,促進(jìn)肝癌的進(jìn)展[32]。筆者認(rèn)為eIF4E3在HCC中具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)能力,可影響ICP基因的表達(dá)水平,有作為免疫治療標(biāo)志物的應(yīng)用前景,未來(lái)可聯(lián)合臨床試驗(yàn)和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)對(duì)eIF4E3在HCC微環(huán)境中的免疫調(diào)節(jié)作用及分子機(jī)制進(jìn)行更深入的探索。

綜上所述,eIF4E3在HCC中呈低表達(dá),且與疾病的惡性進(jìn)展具有關(guān)聯(lián)性,可為HCC患者的免疫治療及分層管理提供參考,其機(jī)制可能與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度調(diào)控有關(guān),但仍需通過(guò)臨床和基礎(chǔ)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。