歐津瑞，高可欣，鄒明明，孫平

1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江 157011；2.牡丹江市第二人民醫(yī)院磁共振室，黑龍江牡丹江 157013；3.牡丹江醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江牡丹江 157011

乳腺癌是一種發(fā)生于乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，據(jù)相關(guān)統(tǒng)計資料顯示，2020年全球新發(fā)乳腺癌226.1 萬，約占總體癌癥發(fā)病的11.7%，新增死亡病例68.5 萬，約占總體癌癥死亡的6.9%[1]。由此可見，早期診斷乳腺癌并采取針對性治療措施對改善患者預(yù)后、延長生存時間尤為重要。目前，臨床尚缺乏早期診斷乳腺癌的腫瘤分子標(biāo)志物，而隨著分子靶向治療乳腺癌成為新的突破方向和熱點(diǎn)，多項研究表明，微小核糖核酸（miRNA）通過參與基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯等多種生理過程，在乳腺癌腫瘤細(xì)胞分化程度、局部浸潤等過程中扮演著重要角色[2-3]。miR29a 作為一種小分子非編碼RNA，被證實(shí)參與了宮頸癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制[4]。鑒于此，本研究選取2020年1 月—2022年12 月牡丹江市第二人民醫(yī)院收治的30 例乳腺癌患者、30例乳腺良性增生患者及同期50 名健康志愿者，旨在探討乳腺癌患者外周血miR29a 表達(dá)及與臨床病理特征的相關(guān)性。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院收治的30 例乳腺癌患者（乳腺癌組）、30 例乳腺良性增生患者（乳腺良性病變組）、同期50 名健康志愿者為研究對象。乳腺癌組年齡38～76歲，平均（54.30±4.25）歲；體質(zhì)指數(shù)（body mass index, BMI）18～29 kg∕m2，平均（25.08±1.22）kg∕m2。乳腺良性病變組年齡32～75 歲，平均（53.08±4.09）歲；BMI 18～28 kg∕m2，平均（24.86±1.19）kg∕m2。對照組年齡29～73 歲，平均（54.12±4.18）歲；BMI 17～28 kg∕m2，平均（25.02±1.17）kg∕m2。3 組研究對象一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診[5]，乳腺良性增生患者經(jīng)乳腺彩超等檢查確診；無合并其他原位腫瘤。

排除標(biāo)準(zhǔn)：哺乳期或妊娠期婦女；合并嚴(yán)重自身免疫系統(tǒng)疾病者；肝、腎功能損害者；臨床資料不完整者；組織標(biāo)本污染或缺失者；合并嚴(yán)重認(rèn)知障礙、精神系統(tǒng)疾病者；不能配合研究者。

1.3 方法

采用實(shí)時熒光定量PCR 法（qRT-PCR）測定外周血miR29a 表達(dá)，抽取3 組受試者空腹?fàn)顟B(tài)下外周靜脈血5 mL，置于抗凝試管中，以15 cm 離心半徑，3 000 r∕min，離心10 min 分離提取血清；采用TRIzol試劑（美國Invitrogen 公司提供）提取血清總RNA，按照miScript Reverse Transcription Kit（美國Biomiga公司）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以U6 作為內(nèi)參基因，使用Agilent Stratagene qRT-PCR 儀Mx3000P 進(jìn)行qRT-PCR 實(shí)驗，總反應(yīng)體系：miScriptHispct（5×）4 μl，miScriptNucleics（10×）2 μl，miScript Reverse Transcriptase 2 μl，混勻，置于實(shí)時熒光定量PCR 儀擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃15 min, 94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 35 s，40 個循環(huán)，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔。采用2-△△CT法計算miR29a相對表達(dá)量。引物序列(5'→3'):5'-CTCAACTGGT GTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTAACCCAT-3'，U6：5'-TTCGTGAAGCGTTCCATATTTT-3'。

1.4 觀察指標(biāo)

①外周血miR29a 表達(dá)量比較。

②乳腺癌不同病理特征外周血miR29a 表達(dá)量比較。

③外周血miR29a 表達(dá)量與乳腺癌病理特征的相關(guān)性。

④外周血miR29a 表達(dá)量診斷乳腺癌的敏感度、特異度。

1.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料采用（±s）表示，比較采用t∕F檢驗；計數(shù)資料采用[n(%)]表示，比較采用χ2檢驗；采用Spearman 分析外周血miR29a 表達(dá)量與乳腺癌病理特征的相關(guān)性；采用受試者工作特征（ROC）曲線分析外周血miR29a 表達(dá)對乳腺癌的診斷效能。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組受試者外周血miR29a 表達(dá)量比較

乳腺癌組患者外周血miR29a 表達(dá)量高于乳腺良性病變組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表 1 3 組受試者外周血miR29a 表達(dá)量比較(±s)

注：與對照組比較，#P＜0.05；與乳腺良性病變組比較，*P＜0.05

組別對照組（n=50）乳腺良性病變組（n=30）乳腺癌組（n=30）F 值P 值miR29a 表達(dá)量0.28±0.06（0.41±0.11）#（0.75±0.25）#*95.772＜0.001

表 2 不同病理特征患者外周血miR29a 表達(dá)量比較(±s)

表 2 不同病理特征患者外周血miR29a 表達(dá)量比較(±s)

病理特征年齡（歲）≥60＜60病理類型浸潤性導(dǎo)管癌浸潤性小葉癌髓樣癌TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期分化程度低分化中、高分化腫瘤直徑（cm）≥3＜3淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是否例數(shù)13 17 18 931 8 12 11 19 13 17 10 20 miR29a 表達(dá)量0.85±0.30 0.66±0.22 0.78±0.29 0.71±0.24 0.70±0.19 0.65±0.21 0.87±0.33 0.90±0.34 0.62±0.20 0.85±0.30 0.61±0.18 0.92±0.35 0.60±0.20 t∕F 值2.004 0.262 2.238 2.855 2.726 3.204 P 值0.055 0.772 0.033 0.008 0.011 0.003

圖 1 外周血miR29a 表達(dá)量診斷乳腺癌的ROC 曲線分析

2.2 不同病理特征患者外周血miR29a 表達(dá)量比較

乳腺癌TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期患者miR29a 表達(dá)量高于Ⅰ～Ⅱ期患者，低分化患者miR29a 表達(dá)量高于中、高分化患者，腫瘤直徑≥3 cm 患者miR29a 表達(dá)量高于直徑＜3 cm 患者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者miR29a表達(dá)量高于無轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不同年齡、病理類型乳腺癌患者外周血miR29a 表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 外周血miR29a 表達(dá)量與乳腺癌病理特征的相關(guān)性

Spearman 相關(guān)性分析顯示，外周血miR29a 表達(dá)量與乳腺癌患者TNM 分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（r=0.294、0.335、0.402，P＜0.05），與分化程度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.318，P＜0.05）。

2.4 外周血miR29a 表達(dá)量診斷乳腺癌的效能分析

ROC 曲線分析顯示，外周血miR29a 表達(dá)量診斷乳腺癌的曲線下面積（AUC）為0.960（95%CI：0.917～1.000），最佳截斷值為0.55，預(yù)測敏感度、特異度分別為83.3%、96.3%。見圖1。

3 討論

目前，臨床關(guān)于乳腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，多數(shù)學(xué)者考慮主要與遺傳易感性、免疫功能紊亂、環(huán)境污染等多種因素共同作用有關(guān)[6-7]。由于該病臨床表現(xiàn)、組織學(xué)形態(tài)、分子分型均具有強(qiáng)異質(zhì)性，故早期診斷較為困難，隨病情進(jìn)展極易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者整體5年生存率較低。miRNA 是一種主要存在于線粒體內(nèi)的非編碼小RNA，具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，在多種疾病的表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮了顯著作用[8-9]。相關(guān)基礎(chǔ)研究也發(fā)現(xiàn)，不同種類的miRNA 在乳腺癌外周血中呈高表達(dá)或低表達(dá)現(xiàn)象，而miRNA 又對乳腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為具有調(diào)控作用[10]。

miR29a 屬于miR29 家族中一員，可調(diào)控機(jī)體細(xì)胞中參與細(xì)胞代謝、分化等過程中相關(guān)基因表達(dá)，在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，并與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[11-12]。研究指出，miR29a 可負(fù)向調(diào)控第10 號染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白（PTEN）基因，即miR29a 表達(dá)水平升高時，PTEN表達(dá)水平呈下降趨勢[13]。張利超等[14]研究表明，miR29a 過表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移及侵襲，其作用機(jī)制主要是通過下調(diào)Spl 的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。另外，王緒娟等[15]研究表明，晚期乳腺癌化療后預(yù)后不良患者血清miR29a 相對表達(dá)量為（0.95±0.27），顯著高于預(yù)后良好患者的（0.65±0.14），進(jìn)一步經(jīng)回歸分析顯示，miR29a 相對表達(dá)量上調(diào)與患者化療預(yù)后不良發(fā)生密切相關(guān)，有望成為乳腺癌靶向治療的潛在靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組患者外周血miR29a表達(dá)量高于乳腺良性病變組和對照組，且不同乳腺癌TNM 分期、分化程度、腫瘤直徑及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者miR29a 表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步經(jīng)Spearman 相關(guān)性分析顯示，外周血miR29a 表達(dá)量與乳腺癌患者TNM 分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與分化程度呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。說明乳腺癌患者外周血miR29a 表達(dá)水平顯著升高，且在乳腺癌細(xì)胞生長調(diào)控、增殖惡變等過程中發(fā)揮了一定作用。本研究還顯示，外周血miR29a 表達(dá)量診斷乳腺癌的敏感度、特異度分別為83.3%、96.3%。說明外周血miR29a 表達(dá)量對乳腺癌具有顯著的診斷效能。

綜上所述，乳腺癌患者外周血miR29a 表達(dá)水平顯著升高，且與臨床病理特征密切相關(guān)，可作為臨床診斷乳腺癌的生物學(xué)指標(biāo)之一。但本研究存在樣本量不足等缺陷，今后需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步探討外周血miR29a 表達(dá)水平與乳腺癌的相關(guān)性。