韓麗紅，陳婧茹，林麗蓉，閆斌

1.莆田學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，福建莆田 351100；2.莆田學(xué)院腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建莆田 351100

結(jié)直腸癌的發(fā)生與飲食、遺傳、腸道炎癥、生活方式及生活環(huán)境等因素有關(guān)，但其發(fā)生機(jī)制尚未完全清楚[1]。岳芙蓉等[2]、衛(wèi)星等[3]指出哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）信號(hào)通路激活后，可操控人類體內(nèi)癌細(xì)胞增長(zhǎng)與消失，由于癌細(xì)胞病變時(shí)，mTOR 信號(hào)通路常處于過度激活狀態(tài)，對(duì)癌細(xì)胞吸收養(yǎng)分、分裂增長(zhǎng)、生存等一系列正?；顒?dòng)造成影響。顧超等[4]指出磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase, PI3K）、絲氨酸∕蘇氨酸蛋白激酶（proteinserinethreonine kinase, AKT）與mTOR 蛋白分子在腫瘤病發(fā)過程中可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增長(zhǎng)、繁殖、存活等方式抑制或增強(qiáng)腫瘤生長(zhǎng)速度。這與腫瘤細(xì)胞的主要生物學(xué)特性，即生長(zhǎng)增殖失控相符。本文分析2013年5 月—2021年5 月TCGA 公共數(shù)據(jù)庫的COAD &READ 患者數(shù)據(jù)698 份，研究mTOR 在結(jié)直腸癌發(fā)病進(jìn)程中的影響和發(fā)揮的作用，為該病的診療工作提供幫助。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 TCGA 數(shù)據(jù)采集

結(jié)直腸癌的原始mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)從癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas, TCGA）數(shù)據(jù)庫（https:∕∕portal.gdc.cancer.gov∕）下載。共收集標(biāo)本698份，其中正常組51 份，腫瘤組647 份。下載基因型-組織表達(dá)（genotype-tissue expression, GTEX）數(shù)據(jù)庫，比較正常組（n=51）、GTEX（n=308）和GSE73360的結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)表達(dá)差異。

1.2 共表達(dá)分析

為研究mTOR 基因的共表達(dá)并分析受mTOR 調(diào)控的信號(hào)通路，本研究分析了TCGA 結(jié)直腸癌患者的表達(dá)譜。以r=0.4，P=0.05 為條件篩選mTOR 表達(dá)最顯著的基因后，使用“Corrplot”和“Circlize”軟件包繪制mTOR 相關(guān)性分析的圓圖，并可視化mTOR 相關(guān)性的調(diào)控機(jī)制。

1.3 基因組變異分析

本研究從分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫（7.0 版）下載了基因組，并使用基因組變異分析（gene set variation analysis, GSVA）算法對(duì)每個(gè)基因組進(jìn)行綜合評(píng)分，以評(píng)估不同樣本中潛在的生物功能變化。

1.4 基因組富集分析

本研究使用基因組富集（gene set enrichment analysis, GSEA）分析比較高表達(dá)組和低表達(dá)組之間信號(hào)傳導(dǎo)途徑的差異。篩選出腫瘤患者，按照其中位值（8.040 58）將腫瘤患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，高表達(dá)組409 份，低表達(dá)組289 份，以探索兩組之間結(jié)果差異的可能分子機(jī)制，排列數(shù)量設(shè)定為1 000，排列類型設(shè)定為表型[5-6]。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用R 語言包4.0.3 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（n）表示，計(jì)量資料經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，采用（±s）表示。采用秩和檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)集中的正常組織與腫瘤組織樣本mTOR 表達(dá)量之間的差異。采用ggcorrplot 和ggstatsplot 進(jìn)行Spearman 相關(guān)性分析及可視化。基于Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Log-Rank 檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mTOR 在結(jié)直腸癌的mRNA 表達(dá)及KM-plot生存分析

mTOR 在結(jié)直腸癌中的具體機(jī)制未明。本研究從TCGA 數(shù)據(jù)庫下載已處理的結(jié)直腸癌原始mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)共698 份，正常組51 份，腫瘤組647 份。結(jié)果表明，mTOR 在正常組織中表達(dá)（6.202 742±1.369 486 872），mTOR 在腫瘤組織中表達(dá)（5.401 705±2.087 202 686），mTOR 在腫瘤組織和正常組織中表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1A。此外，基于GSE73360 數(shù)據(jù)集分析mTOR 在組織中的表達(dá)差異，結(jié)果顯示，mTOR 在正常組織中表達(dá)（7.008 4±0.429 089 872），mTOR 在腫瘤組織中表達(dá)（8.040 58±0.784 400 233），mTOR 在腫瘤組織中表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1B。本研究基于mTOR 基因的表達(dá)量進(jìn)行KM-plot 生存分析（納入患者生存時(shí)間需＞30 d），通過遍歷mTOR 基因的所有截點(diǎn)選取具有最優(yōu)生存意義的截點(diǎn)值，結(jié)果表明，當(dāng)mTOR 截點(diǎn)值為3.633 6 時(shí)，高風(fēng)險(xiǎn)組患者預(yù)后顯著較低風(fēng)險(xiǎn)組預(yù)后較好，見圖2。

圖1 mTOR 在結(jié)直腸癌的mRNA 表達(dá)

圖2 KM-plot 生存分析

2.2 mTOR 的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

本研究進(jìn)一步通過相關(guān)性分析探討mTOR 的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，過濾條件為r=0.4，P＜0.05。共篩選出541個(gè)與mTOR 表達(dá)顯著相關(guān)的基因，見圖3。

圖3 與mTOR 表達(dá)顯著相關(guān)的基因

2.3 mTOR 與信號(hào)通路

GSVA 結(jié)果表明，高低表達(dá)兩組患者的差異通路主要富集到了MITOTIC_SPINDLE、G2M_CHECKPOINT 以及OXIDATIVE_PHOSPHORYLATI ON 信號(hào)通路，見圖4。

圖4 mTOR 基因涉及的信號(hào)通路

2.4 mTOR 與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、腫瘤突變負(fù)荷的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)mTOR 組微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability, MSI）為（0.346 5±0.228 324 831），低表達(dá)mTOR 組為（0.340 8±0.200 818 483）。高表達(dá)mTOR 組腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden,TMB）為（3.881 578 948±47.556 343 52），低表達(dá)mTOR 組為（3.5789 473 68±23.947 834 78）。核心基因高低表達(dá)在MSI 和TMB 方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 mTOR 基因高低表達(dá)間與MSI 和TMB 的關(guān)系

3 討論

mTOR 信號(hào)傳導(dǎo)通路與惡性腫瘤的關(guān)系越來越多地受到人們的關(guān)注。未見有相關(guān)報(bào)道關(guān)于mTOR與結(jié)直腸癌生物信息學(xué)分析研究。TCGA 數(shù)據(jù)庫下載已處理的結(jié)直腸癌的原始mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)共698份，mTOR 在正常組織中表達(dá)（6.202 742±1.369 486 872），mTOR 在腫瘤組織中表達(dá)（5.401 705±2.087 202 686），mTOR 在腫瘤組織和正常組織中表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?；贕SE73360 數(shù)據(jù)集分析mTOR 在組織中的表達(dá)差異，mTOR 在正常組織中（7.008 4±0.429 089 872），mTOR 在腫瘤組織中表達(dá)（8.040 58±0.784 400 233），mTOR 在腫瘤組織中表達(dá)升高（P＜0.05）。共篩選出541 個(gè)與mTOR 表達(dá)顯著相關(guān)的基因。GSVA 結(jié)果高低表達(dá)兩組患者的差異通路主要富集到了MITOTIC_SPINDLE、G2M_CHECKPOINT 以及OXIDATIVE_PHOSPHORYLATION 信號(hào)通路。高表達(dá)mTOR 組MSI 為（0.346 5±0.228 324 831），低表達(dá)mTOR 組為（0.340 8±0.200 818 483）。高表達(dá)mTOR 組TMB 為（3.881 578 948±47.556 343 52），低表達(dá)mTOR 組為（3.578 947 368±23.947 834 78）。核心基因高低表達(dá)在MSI 和TMB 方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

關(guān)于mTOR 與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的研究比較多。Wang XW 等[7]研究顯示結(jié)直腸癌細(xì)胞主要通過細(xì)胞內(nèi)分裂增殖基因進(jìn)行細(xì)胞復(fù)制，通過mTOR信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞增殖基因過度刺激獲得mRNA，而后mRNA 進(jìn)行大量轉(zhuǎn)錄，合成病變細(xì)胞分裂所需的蛋白質(zhì)，進(jìn)而提高細(xì)胞增殖速度。CyclinDI 是一種原癌基因，再加之其分裂行為不受控制，造成病變細(xì)胞內(nèi)激酶活化并與受體結(jié)合進(jìn)行繁殖，從而導(dǎo)致病變細(xì)胞激增。mTOR 信息通道合并激活后，與酸化后兩個(gè)蛋白因子進(jìn)行反應(yīng)，達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用[7-18]。周釗等[8]指出哺乳動(dòng)物mTOR 是一種可直接吸收營(yíng)養(yǎng)的激酶，并且受成長(zhǎng)基因與外在環(huán)境影響，存在于機(jī)體內(nèi)各種細(xì)胞的分裂、生長(zhǎng)、死亡循環(huán)調(diào)節(jié)，是一種極強(qiáng)的黏結(jié)性因子。鐘南英等[9]指出腫瘤的并發(fā)與mTOR 激活有著密不可分的聯(lián)系，并且該通道激活與病變細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)、血管生成、轉(zhuǎn)移等相關(guān)。同時(shí)，PI3K 既有蛋白激酶活性，同時(shí)又有磷脂激酶活性，為病變細(xì)胞大量增殖形成腫瘤打下了基礎(chǔ)。AKT 為mTOR 的上游信號(hào)分子，在結(jié)直腸癌形成過程中，參與調(diào)節(jié)VEGF 介導(dǎo)的血管生成過程中的多個(gè)階段。胡樹堅(jiān)[10]在其研究中表示由于mTORC1 主要負(fù)責(zé)細(xì)胞的增殖等活動(dòng)，使得腫瘤惡化或瘤轉(zhuǎn)移與mTORC1 的異常運(yùn)作密切相關(guān)，由于mTORC1 具有促進(jìn)新陳代謝功能，并且兼?zhèn)渲|(zhì)代謝、抑制細(xì)胞吞噬等作用，為病發(fā)細(xì)胞提供了“立足”基礎(chǔ)；而mTORC2 則是通過提高激酶數(shù)量進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，以調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞。

綜上所述，本研究?jī)H針對(duì)mTOR 在結(jié)直腸癌中的生物信息分析，局限于mTOR 信息通路，也可圍繞mTOR 信息通路對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞影響與擴(kuò)散進(jìn)行研究。mTOR 信號(hào)通路與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。了解mTOR 在癌細(xì)胞形成過程中的作用，可對(duì)我國(guó)后續(xù)抗癌醫(yī)療發(fā)展添磚加瓦。