叢建軍，付冬冬

1.吉林省通化市人民醫(yī)院麻醉科，吉林通化 134001；2.河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，河南新鄉(xiāng) 453000

臨床上出現(xiàn)腎臟缺血再灌注損傷的現(xiàn)象不斷增多，嚴(yán)重影響患者的生命和生活質(zhì)量[1]。因此，在手術(shù)麻醉或者鎮(zhèn)靜過程中選擇對腎臟缺血再灌注損傷具有一定保護(hù)作用的藥物顯得尤為重要。丙泊酚是麻醉及ICU 常用的鎮(zhèn)靜藥物，已有研究報(bào)道該麻醉藥物具有減輕多種臟器的缺血再灌注損傷作用[2]。瑞芬太尼作為μ 阿片類受體激動劑，劑量可控，安全可靠，對肝腎功能無損害，成為肝腎功能不全需要進(jìn)行腎移植的理想麻醉藥物[3]。七氟醚是目前臨床常用的吸入麻醉藥，具有誘導(dǎo)快、刺激性低的優(yōu)點(diǎn)，且有利于術(shù)后麻醉的恢復(fù)，減輕心、腦、肝、肺等器官缺血再灌注損傷的作用已得到廣泛認(rèn)可[4]。目前對于上述3 種麻醉藥物對腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用之間的比較以及作用機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究于2019年1—6 月吉林省通化市人民醫(yī)院，以60 只SD 大鼠為研究對象，建立腎臟缺血再灌注損傷模型，分析研究丙泊酚、瑞芬太尼、七氟醚對腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)及其分子作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 研究選擇60 只雄性健康SD 大鼠，均為SPF 級，體質(zhì)量（245.4±2.5）g；周齡（13.2±0.6）周；適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周（室溫25℃、相對濕度40%～60%）。該實(shí)驗(yàn)所涉及的動物管理、使用以及相關(guān)操作均已通過動物倫理委員會（Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC）批準(zhǔn)并嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動物使用的3R 原則給予人道主義關(guān)懷。

1.1.2 主要試劑與儀器 丙泊酚注射液（國藥準(zhǔn)字J20080023；規(guī)格：20 mL∶0.2 g×5 支）、鹽酸瑞芬太尼注射劑（國藥準(zhǔn)字H20143314；規(guī)格：2 mg∕支）、吸入用七氟烷（國藥準(zhǔn)字A000030209；規(guī)格：10 mL 溶液劑 支）、ELISA 試劑盒（貨號:M1000B）、免疫組化試劑盒（貨號:98-9943）、TUNEL 試劑盒（貨號:ab66110）、兔抗大鼠多克隆p-ULK1 及兔抗大鼠單克隆p-AMPK、p-mTOR、Caspase-3（貨號: sc-56053）。

1.2 方法

1.2.1 分組處理及模型建立 采用隨機(jī)數(shù)字表方法將60 只SPF 級大鼠分為6 組:正常組（NC 組），假手術(shù)組（Sham 組）、缺血∕再灌注組（I∕R 組）、丙泊酚組（Pro 組）、瑞芬太尼組（Rem 組）和七氟醚組（Sev組），10 只∕組。I∕R 組、Pro 組、Rem 組及Sev 組根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)建立腎臟缺血再灌注損傷模型。分組處理:術(shù)前所有大鼠需要禁食12 h，自由飲水。NC組、Sham 組及I∕R 組在模型建立前均給予生理鹽水。Pro 組、Rem 組及Sev 組在手術(shù)前給予相應(yīng)藥物麻醉處理，其中Pro 組采用微量泵給予尾靜脈輸注丙泊酚[按照1.0 mg∕（kg·min）]，時(shí)間30 min；Rem 組以微量泵給予尾靜脈輸注瑞芬太尼[按照2.0 μg∕（kg·min）]，時(shí)間30 min。Pro 組、Rem 組模型制備前30 min 至再灌注后30 min 持續(xù)泵注給藥。Sev 組在模型制備前30 min 吸入2.8%七氟醚和氧氣的混合氣體至再灌注30 min，氣體監(jiān)測儀測定大鼠呼出的七氟醚濃度。

模型建立:Sham 組經(jīng)2.0%戊巴比妥鈉（按照40 mg∕kg 給藥）麻醉后開腹，游離出左右腎蒂，45 min關(guān)腹。I∕R 組、Pro 組、Rem 組及Sev 組經(jīng)2.0%戊巴比妥鈉（按照40 mg∕kg 給藥）麻醉后，將兩側(cè)腎蒂游離，無創(chuàng)夾閉45 min 使得腎臟血流被阻斷，模型復(fù)制成功標(biāo)準(zhǔn):腎臟自暗紫色變?yōu)榧t色。

1.2.2 生化指標(biāo)檢測 大鼠處死前腹主動脈穿刺采血，冰上靜置1.5 h 后，1 500 rpm×10 min 分離獲取血清并置于-40℃冰箱中保存?zhèn)溆?。大鼠腎功能指標(biāo)包括尿素氮（BUN）、肌酐（Cr），應(yīng)用TC6030全自動生化分析儀檢測；炎癥因子指標(biāo)包括白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-8（IL-8），應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測。采用亞硝酸法測定超氧化物氣化酶（SOD）含量、硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）水平。

1.2.3 腎組織病理學(xué)及相關(guān)指標(biāo)檢測 再灌注24 h，采用2.0%戊巴比妥鈉（按照40 mg∕kg 給藥）麻醉后處死大鼠，分離取得腎實(shí)質(zhì)，分別行免疫組化（SP法）檢測自噬標(biāo)志性蛋白（Beclin-1、LC3-Ⅱ），采用Quantity One 圖像處理系統(tǒng)分析細(xì)胞凋亡情況，透射電鏡檢測自噬小體，蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測腎組織自噬標(biāo)志物。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察比較各組尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Cr）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-8（Interleukin-8，IL-8）、超氧化物氣化酶（superoxide gasification，SOD），丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平、細(xì)胞凋亡情況，腎組織自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，組間差異比較以t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組別生化指標(biāo)檢測結(jié)果對比

研究顯示，I∕R 組BUN、Cr、IL-1β、IL-8、SOD、MDA 與NC 組、Sham 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Pro 組、Rem 組及Sev 組BUN、Cr、IL-1β、SOD與I∕R 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Sev 組BUN、Cr、MDA，與Pro 組、Rem 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同組別生化指標(biāo)檢測結(jié)果比較(±s)

表1 不同組別生化指標(biāo)檢測結(jié)果比較(±s)

注：與NC 組比較，*P＜0.05；與Sham 組比較，#P＜0.05；與I∕R 組比較，▲P＜0.05；與Pro 組比較，△P＜0.05；與Rem 組比較，★P＜0.05

組別NC 組（n=10）Sham 組（n=10）I∕R 組（n=10）Pro 組（n=10）Rem 組（n=10）Sev 組（n=10）BUN（mmol∕L）6.23±0.69 6.85±0.81（24.18±2.91）*#（12.63±1.42）▲（16.25±1.85）▲△（8.60±1.54）▲△★Cr（μmol∕L）45.89±5.44 46.21±6.02（97.55±9.80）*#（78.93±7.89）▲（82.26±7.15）▲（68.22±7.08）▲△★IL-1β（mmol∕L）12.57±2.08 12.91±1.97（26.14±2.84）*#（17.76±2.33）▲（17.28±2.41）▲（16.92±2.28）▲IL-8（mmol∕L）8.65±1.43 8.76±1.50（10.59±1.83）*#9.97±1.96 10.11±1.82 9.88±1.79 SOD（U∕mg）14.26±2.05 13.21±1.88（6.24±1.64）*#（10.63±1.73）▲（10.22±1.80）▲（11.06±1.92）▲MDA（μmol∕g）1.39±0.45 1.42±0.50（4.73±0.79）*#4.16±0.72（3.70±0.64）▲（2.61±0.63）▲△★

2.2 免疫組化檢測Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)對比

I∕R 組Beclin-1、LC3-Ⅱ水平，高于NC 組、Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Pro 組Beclin-1、LC3-Ⅱ水平，與I∕R 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Rem 組、Sev 組Beclin-1 水平，高于I∕R 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Sev 組Beclin-1、LC3-Ⅱ水平，高于Pro 組、Rem 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同組別Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)水平結(jié)果比較(±s)

表2 不同組別Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)水平結(jié)果比較(±s)

注：與NC 組比較，*P＜0.05；與Sham 組比較，#P＜0.05；與I∕R 組比較，▲P＜0.05；與Pro 組比較，△P＜0.05；與Rem 組比較，★P＜0.05

蛋白名稱Beclin-1 LC3-ⅡNC 組（n=10）0.198±0.067 0.232±0.072 Sham 組（n=10）0.214±0.058 0.258±0.061 I∕R 組（n=10）（0.392±0.078）*#（0.417±0.086）*#Pro 組（n=10）0.401±0.084 0.433±0.092 Rem 組（n=10）（0.609±0.102）▲0.442±0.101 Sev 組（n=10）（0.779±0.093）▲△★（0.859±0.090）▲△★

2.3 TUNEL 腎小管上皮細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果對比

TUNEL 檢測試劑盒分析結(jié)果顯示，I∕R 組AI（0.714±0.063），高于NC 組（0.209±0.072）、Sham 組（0.226±0.065），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Sev組AI（0.311±0.078）、Pro 組AI（0.496±0.081）、Rem 組AI（0.445±0.072），低于I∕R 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Sev 組AI 水平，低于Pro 組、Rem 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 自噬小體檢測結(jié)果對比

顯微投射電鏡觀察顯示，I∕R 組自噬小體數(shù)量（12.40±2.07），高于NC組（6.00±1.41）、Sham 組（6.20±1.30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Sev 組自噬小體數(shù)量（24.60±5.73）高于I∕R 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而Pro 組自噬小體數(shù)量（15.00±3.39）、Rem 組自噬小體數(shù)量（14.60±4.16），與I∕R 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Sev 組自噬小體數(shù)量，高于Pro組、Rem組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 pULK1、pAMPK、pmTOR 及Caspase-3 蛋白表達(dá)情況對比

研究顯示，I∕R 組pAMPK、pULK1、pmTOR 及Caspase-3 均高于NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Pro 組、Rem 組及Sev 組pmTOR 及Caspase-3低于I∕R 組，而pULK1 高于I∕R 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Sev 組pAMPK、pULK1 高于Pro 組、Rem 組，而pmTOR 低于Pro 組、Rem 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同組別pULK1、pAMPK、pmTOR 及Caspase-3 蛋白表達(dá)結(jié)果比較(±s)

表3 不同組別pULK1、pAMPK、pmTOR 及Caspase-3 蛋白表達(dá)結(jié)果比較(±s)

注：與NC 組比較，*P＜0.05；與Sham 組比較，#P＜0.05；與I∕R 組比較，▲P＜0.05；與Pro 組比較，△P＜0.05；與Rem 組比較，★P＜0.05

蛋白名稱pAMPK pULK1 pmTOR Caspase-3 NC 組（n=10）0.132±0.041 0.254±0.062 0.292±0.059 0.304±0.048 Sham 組（n=10）0.146±0.049 0.369±0.070 0.301±0.067 0.325±0.052 I∕R 組（n=10）（0.294±0.062）*#（0.375±0.076）*（0.781±0.094）*#（0.849±0.086）*#Pro 組（n=10）0.301±0.064（0.632±0.089）▲（0.594±0.083）▲（0.421±0.040）▲Rem 組（n=10）0.311±0.060（0.802±0.090）▲△（0.476±0.070）▲△（0.300±0.047）▲△Sev 組（n=10）（0.621±0.098）▲△★（1.042±0.116）▲△★（0.351±0.049）▲△★（0.285±0.031）▲△

3 討論

自噬與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-9]。研究顯示，自噬參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如腫瘤、腦缺血等，目前也有研究發(fā)現(xiàn)自噬可能對腎臟缺血再灌注損傷存在保護(hù)作用[10]。本研究顯示，I∕R組BUN、Cr、IL-1β、IL-8、SOD、MDA 與NC 組、Sham組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Pro 組、Rem組及Sev 組BUN、Cr、IL-1β、SOD 與I∕R 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Sev 組BUN、Cr、MDA，與Pro 組、Rem 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明七氟醚降低腎功能指標(biāo)（BUN、Cr）優(yōu)于丙泊酚組、瑞芬太尼組，此外通過HE 染色結(jié)果顯示，七氟醚組腎臟組織細(xì)胞排列較為整齊，空泡化少見，腎小管形態(tài)較完整，提示七氟醚對腎功能保護(hù)作用優(yōu)于丙泊酚、瑞芬太尼。鄒海波等[6]研究發(fā)現(xiàn)，與缺血組及再灌注組比較，異丙酚組的BUN（7.35±1.18）、Cr（45.15±3.35）、MDA（4.14±0.66）水平明顯降低，SOD（479.12±81.35）水平明顯增高（P＜0.05）。異丙酚可對大鼠腎臟缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。瑞芬太尼具有減輕氧自由基損傷，抑制細(xì)胞凋亡的作用，其作用機(jī)制與抑制Fas 表達(dá)以及降低Caspase-3 水平有關(guān)；金小雪等[7]發(fā)現(xiàn)瑞芬太尼通過對腎臟IR 后Fas 凋亡信號相關(guān)通路信號分子的抑制，阻斷該通路的激活。七氟醚也具有減輕氧自由基水平，抑制細(xì)胞凋亡等作用，其可能機(jī)制與促進(jìn)血紅素（HO-1）基因表達(dá)有關(guān)[8]。以上提示，丙泊酚、瑞芬太尼以及七氟醚對于麻醉后大鼠具有一定的抗氧化應(yīng)激作用，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

本研究顯示，I∕R 組細(xì)胞凋亡明顯，Rem 組凋亡指數(shù)（AI）（0.445±0.072）低于I∕R 組（0.714±0.063）（P＜0.05）。Sev 組AI 水平（0.311±0.078）低于Pro 組（0.496±0.081）、Rem 組（0.445±0.072）（P＜0.05）。I∕R組及Sev 組自噬小體數(shù)量[（12.40±2.07），（24.60±5.73）]升高。I∕R 組pAMPK、pmTOR 及Caspase-3 分別為（0.294±0.062），（0.781±0.094），（0.849±0.086），均高于NC 組、Sham 組、Pro 組、Rem 組、Sev 組（P＜0.05）。以上提示，七氟醚對腎臟缺血再灌注損傷自噬作用優(yōu)于丙泊酚、瑞芬太尼[9-11]。其中內(nèi)源性途徑的重要蛋白是半胱氨酸蛋白酶家族，如Capase-3 及Caspase-9 等[12]。研究顯示，腎臟缺血再灌注時(shí)導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞壞死性凋亡，導(dǎo)致Bax蛋白升高及Bcl-2 的下降，Capase-3 與凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2 存在相關(guān)性[13]。七氟醚、瑞芬太尼、丙泊酚等均具有降低Caspase-3 表達(dá)的作用。劉風(fēng)藏等[14]的數(shù)據(jù)表明，腸道I∕R 誘導(dǎo)了明顯的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為腸黏膜丙二醛增加，腸黏膜SOD 減少，細(xì)胞凋亡指數(shù)和mRNA增加。

綜上所述，丙泊酚、瑞芬太尼及七氟醚均具有減輕腎臟缺血再灌注損傷的作用,其作用機(jī)制與抗氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。