曹秀蘭　葉雨婷　馬天浩　胡安娜　曹宇　陳鵬澤　伍壯生　李鵬

關(guān)鍵詞：貝萊斯芽孢桿菌；番茄青枯??；全基因組；次級代謝產(chǎn)物

中圖分類號：S435.73 文獻標(biāo)識碼：A

生物防治由于靶向明確且安全無污染，近年來已經(jīng)成為發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研究熱點。芽孢桿菌屬的菌株是主要的生防細(xì)菌篩選目標(biāo)之一，其中絕大部分是有益微生物，具有強大的生防潛力，同時根圍或根際促生細(xì)菌也常來源于此屬[1-2]。屬內(nèi)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis）、蠟樣芽胞桿菌（B. cereus）、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）等已經(jīng)被制成各類微生態(tài)制劑，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖、水產(chǎn)等領(lǐng)域，且成效顯著[3-4]。

貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）于1999 年被發(fā)現(xiàn)，2005 年被首次報道和命名，但不同來源菌株的形態(tài)和理化性質(zhì)不盡相同[5]。已有研究結(jié)果表明貝萊斯芽孢桿菌分布廣泛、生長迅速、能夠產(chǎn)生大量次生代謝物質(zhì)如抗菌蛋白、脂肽類抗生素等特性，是優(yōu)良的生防菌株資源[6]。如貝萊斯芽孢桿菌對禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）、葡萄座腔菌（ Botryosphaeria dothidea ）、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）等多種植物病原菌有明顯的拮抗活性[7-10]，同時楊成等[11]的研究表明，貝萊斯芽孢桿菌Y6 可通過侵入釘螺體內(nèi)干擾糖原利用而達到殺滅的目的。其強大的抑菌譜得益于多種次生代謝產(chǎn)物介導(dǎo)下的多種抗菌機制，例如競爭作用、溶菌作用、拮抗作用等[6]。王淋敏[12]、張榮勝等[13]的研究表明，使用貝萊斯芽孢桿菌制成的菌劑能夠刺激植物生長，表明其也具有一定的促生長和誘導(dǎo)抗性的功能。FZB42 是貝萊斯芽孢桿菌的模式菌株之一，其全基因組測序與功能預(yù)測結(jié)果表明，約有10%的基因資源用于產(chǎn)生各類次級代謝產(chǎn)物，途徑廣泛、類型多樣，且這些次級代謝產(chǎn)物均具備不同程度的抑菌和促進植物生長的能力，實驗也證明該菌株對數(shù)十種植物病原細(xì)菌和病原真菌具有強大的抑制能力[14]。

菌株HNU24 是以強致病力茄雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）菌株EP1[15]為指示菌，從番茄砧木根系分離得到的一株生防菌，前期實驗表明該菌株對EP1 具有較強的拮抗活性。為進一步解析HNU24 的功能機制和基因組特征，本研究采用BGISEQ-500 和ONT PromethION 平臺相結(jié)合的測序技術(shù)，組裝得到HNU24 的完整基因組序列，并進行基因預(yù)測、同源蛋白簇（clusterof orthologous groups of proteins， COG）、基因本體論（gene ontology， GO）、京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG ）、碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫（carbohydrate-active enzymes， CAZy）、次級代謝產(chǎn)物分析，經(jīng)基因組聚類分析表明HNU24 為貝萊斯芽孢桿菌，且溫室實驗表明其對番茄具有顯著的促生長活性。相關(guān)結(jié)果對于進一步開展HNU24 在生物防治方面的研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株HNU24 保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，菌株保藏編號為GDMCC61231。取HNU24單菌落接種于50 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/min 培養(yǎng)至OD600=1.0，然后在4 ℃，12 000 r/min離心10 min 收集菌體，用于基因DNA 提取，具體提取方法參照黃鶴等[16]的方法。

1.2 方法

1.2.1 基因組測序、組裝和序列分析 基因組測序?；贐GISEQ-500 和ONT PromethION 測序技術(shù)平臺分別對HNU24 菌株進行高通量全基因組測序，委托武漢希望生物科技有限公司進行。

基因組組裝：使用Unicycler 0.4.8 軟件對HUN24 菌株基因組測序產(chǎn)生的二代短讀長和三代長讀長測序數(shù)據(jù)進行混合組裝，得到一條完整的環(huán)狀基因組序列。

基因注釋：使用prokka v1.14.5 軟件對HNU24基因組中的蛋白質(zhì)編碼基因和tRNA、rRNA 等非編碼基因進行注釋。對蛋白編碼基因，進一步使用eggNog-mapper v2.1.5 軟件進行GO、KEGG、COG 和CAZy 等功能注釋。

1.2.2 分類地位和遺傳進化分析 使用GTDB-tkv1.6.0 軟件分析HNU24 的基因組序列，以確定其分類學(xué)地位。該軟件利用細(xì)菌基因組中廣泛存在的120 個保守基因，對HNU24 菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析，尋找Genome Taxonomy Database 數(shù)據(jù)庫（RS202）中與其關(guān)系最為接近的細(xì)菌物種。進一步分別使用pyani v0.2.11 軟件和在線工具GGDC3.0（http：//ggdc.dsmz.de/ggdc.php）計算HNU24 和其近緣細(xì)菌基因組間的平均核苷酸一致性（averagenucleotide identity， ANI）和數(shù)字DNA-DNA 雜交值，以進一步判斷HNU24 的分類學(xué)地位。

1.2.3 CAZy 酶類數(shù)據(jù)庫分析 碳水化合物活性酶（CAZy）按其功能分類主要包括糖苷水解酶（ glycoside hydrolases， GHs ）、糖基轉(zhuǎn)移酶（ glycosyl transferases， GTs ）、多糖裂解酶（polysaccharide lyases， PLs）、碳水化合物酯酶（carbohydrate esterase， CEs）、輔助氧化還原酶（auxiliary activities， AAs）以及沒有催化活性的碳水化合物結(jié)合模塊（carbohydrate-binding modules，CBMs）。基于碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫，利用 hmmer[17]軟件進行碳水化合物酶類基因的功能注釋與分析。

1.2.4 次級代謝產(chǎn)物合成基因簇分析 使用antiSMASH（version 5.1.2）軟件在線分析預(yù)測菌株HNU24 基因組中的拮抗物質(zhì)合成相關(guān)基因簇。

1.2.5 纖維素降解酶活性檢測 分別將HNU24和FZB42 在5 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中28 ℃，180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)24 h，制備纖維素培養(yǎng)基平板（羧甲基乙基纖維素1.0 g，磷酸鈉3.8 g，瓊脂糖8 g，溶解于1 L 蒸餾水中，其中羧甲基乙基纖維素需要在熱水浴條件下溶解，121 ℃滅菌20 min），每皿25 mL，待培養(yǎng)基冷卻凝固后打孔，每孔加入40 μL 的HNU24 或FZB42 菌液，培養(yǎng)24 h，加入適量1 g/L 的剛果紅染液，以染液沒過培養(yǎng)基為準(zhǔn)，室溫靜置10 min，倒掉染液，往培養(yǎng)基里加入1 mol/L NaCl 溶液脫色，室溫靜置10 min，倒掉NaCl 溶液，重復(fù)脫色2 次后，白色背景下對培養(yǎng)基中形成的透明圈進行拍照記錄和直徑測量。

1.2.6 溫室促生長實驗 將1 mL（OD600=1.0）的HNU24 菌懸液在100 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48 h（28 ℃， 180 r/min），6000 r/min 離心5 min，去除培養(yǎng)基后用無菌水100 mL 重懸制成懸液，制備相應(yīng)菌體懸液500 mL。選出健康、長勢良好且一致的番茄幼苗，分為葉面噴施清水組（A 組）、葉面噴施處理組（B 組，含HNU24）、灌根清水組（C 組）、灌根處理組（D 組，含HNU24）4 個組，每組3 個重復(fù)，每個重復(fù)10 株幼苗；葉面噴施清水組用清水進行葉面噴施處理，至葉面濕潤不滴水為止；灌根清水組用清水進行灌根處理，每盆每次灌根100 mL 無菌水；葉面噴施處理組用去培養(yǎng)基的HNU24 無菌水重懸液進行葉面噴施，至葉面濕潤不滴水為止；灌根處理組用去培養(yǎng)基的HNU24 無菌水重懸液進行灌根處理，每盆灌根100 mL 菌懸液。將上述處理的番茄幼苗在室溫30 ℃的溫室內(nèi)培養(yǎng)，為保證植株不受水分脅迫，所有苗每隔3 d 用100 mL 的清水灌根，30 d 后記錄植株株高。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序與組裝

通過對測序結(jié)果進行組裝，獲得了HNU24的完整基因組序列，長度為3 932 768 bp，GC 含量為46.48%，共編碼3822 個基因，鑒定出99 個tRNA 基因，33 個rRNA 基因，1 個tmRNA 基因，2 個ncRNA 基因，58 個假基因，1 個SPR-RNA基因，3747 個蛋白質(zhì)編碼區(qū)，26 個生物核糖開關(guān)以及12 個轉(zhuǎn)座酶基因（sequence read archive 授權(quán)號：SRR16216500）（圖1）。

2.2 分類地位與遺傳進化分析

為了進一步確定菌株HNU24 的分類地位，從數(shù)據(jù)庫中下載了45 個芽孢桿菌的全基因組，通過ANI 和聚類分析，所有的菌株同HNU24 被分為A和B（B1 和B2）兩個大支（圖2），B. sonorensisNBRC 101234、B. paralicheniformis KJ-16、B.licheniformis ATCC 14580、B. licheniformis DSM13 等聚類為A 支，與HNU24 的ANI 值低于80%。HNU24 與B. velezensis FZB42、B. velezensis KACC18228、B. velezensis KTCT 13012 等聚類為B1 支，其ANI 值介于97%～100%之間，高于種的分類閾值95%，B. atropharus NBRC15539、B. mojavensisRO-H-1、B. halotolerans ATCC25096 等29 株菌聚類為B2 支，與HNU24 的ANI 值在93%～95%之間，低于分類閾值。綜上，菌株HNU24 可歸屬為貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis），且與FZB42具有最高的基因組相似性。

2.3 基因功能注釋及蛋白同源性分析

本研究對HNU24 進行了基因功能注釋、COG功能分類分析。COG 功能分類統(tǒng)計結(jié)果表明（圖3），共有3646 個蛋白具有明確的COG 分類，約占總蛋白數(shù)的95.37%。在22 個COG 類別當(dāng)中，其中最多的分類是功能未知的類群（876 個），占COG 分類蛋白總數(shù)的24.03%，分類為氨基酸運轉(zhuǎn)與代謝的蛋白數(shù)量次之，占8.83%，然后依次是轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白（8.42%），碳水化合物運輸和代謝相關(guān)蛋白（6.77%），無機離子轉(zhuǎn)運和代謝相關(guān)蛋白（6.39%），能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換（5.57%），細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/細(xì)胞外膜的合成（5.49%），翻譯、核糖體、結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生（5.02%），信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制（4.28%），復(fù)制、重組和修復(fù)（3.68%），輔酶轉(zhuǎn)運與代謝（3.59%），脂質(zhì)轉(zhuǎn)運與代謝（3.57%），次級代謝產(chǎn)物合成、運輸和分解（3.29%），翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、分子伴侶（2.69%），核苷酸轉(zhuǎn)運與代謝（2.66%），細(xì)胞運動（1.59%），防御機制（1.56%），胞內(nèi)運輸、分泌和濾泡轉(zhuǎn)運（1.29%），細(xì)胞周期控制、控制細(xì)胞分裂、染色體分離（1.23%），染色體結(jié)構(gòu)及動力學(xué)（0.03%），DNA 加工與修飾（0.03%）。

2.4 CAZy 酶類數(shù)據(jù)庫對比分析

CAZy 酶類數(shù)據(jù)庫對比結(jié)果表明菌株HNU24編碼的碳水化合物活性酶基因家族43 個（表1），分別為GTs（22 個）、GHs（13 個）、CBMs（2個）、CEs（1 個）基因家族，另外還發(fā)現(xiàn)有復(fù)合酶類，復(fù)合類型為GH13/GH31（2 個）、AA10/CBM73（1 個）、CBM6/GH43（1 個）、GH5/GH9（1 個）。其中GT 家族最多，約占整個基因家族的50%，GH 家族次之，約占29.5%，復(fù)合酶類占整個基因家族的13.6%。其中GH9 家族對纖維素和木聚糖的降解能夠發(fā)揮很大的作用，GH43、GH26、GH5、GH51 等家族也與纖維素和半纖維素的水解相關(guān)，說明HNU24 具有降解纖維素、半纖維素、木聚糖的潛力。為了進一步確定碳水化合物水解酶是否表達，利用纖維素培養(yǎng)基結(jié)合剛果紅染色法，將其與貝萊斯芽孢桿菌模式菌株FZB42 進行纖維素降解酶活性比較，結(jié)果顯示HNU24 透明圈直徑和FZB42 相當(dāng)，均值為18 mm（圖4），說明其具備與FZB42 相當(dāng)?shù)睦w維素酶降解活性。CBM50 家族的酶類夠裂解幾丁質(zhì)和纖維素，通過連接部分糖苷水解酶，以分解幾丁質(zhì)和肽聚糖。推測菌株HNU24 也具備分解幾丁質(zhì)和肽聚糖的潛力。

2.5 次級代謝產(chǎn)物預(yù)測

通過使用antiSMASH 軟件預(yù)測，在HNU24基因組中預(yù)測到13 個次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，其中8 個能夠找到完全相似或者相似度極高的已鑒定基因簇（ 表2 ）， 分別是表面活性素（surfactin）、植物唑霉素（plantazolicin）、大環(huán)內(nèi)酰亞胺（macrolactin）、桿菌烯（bacillaene）、泛革素（fengycin）、地非西?。╠ifficidin）、桿菌毒素（bacillibactin）、桿溶菌素（bacilysin），其相似度除表面活性素為91%外，其余均為100%，另有1種聚酮合酶類似物與丁胺菌素A/丁胺菌素B（butirosinA/butirosinB）相似度僅為7%、2 種烯萜類化合物、1 種三型酮聚合酶化合物以及1 種非核糖體多肽類化合物的基因簇尚未在數(shù)據(jù)庫中比對出相似化合物基因簇，極有可能是未知的化合物。

2.6 生防菌HNU24 溫室促生長實驗

為了檢測HNU24 的促生長活性，本研究以番茄（東綠明星番茄）為研究對象開展了溫室促生長實驗（圖5），結(jié)果顯示通過在葉面噴施處理和灌根處理HNU24 菌懸液，與對照相比，均對番茄株高有顯著促進作用，且灌根的促進作用更加明顯。采用灌根方式和葉面噴施方式施加HNU24時，HNU24 促進番茄株高增長率分別為26.2%和18.6%。

3 討論

通過采用BGISEQ-500 和ONT PromethION平臺相結(jié)合的測序技術(shù)得到了一株對茄雷爾氏菌具有拮抗活性的菌株HNU24 的全基因組序列。通過與枯草芽孢桿菌、解淀粉酶芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌等主要芽孢菌屬的菌株基因組的ANI值和聚類分析，結(jié)果顯示HNU24 歸屬為貝萊斯芽孢桿菌，并與菌株FZB42 的親緣關(guān)系最近。

CAZy 數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果表明，HNU24 可以產(chǎn)生纖維素合酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、幾丁質(zhì)合成酶等酶類，具有降解纖維素、半纖維素、木聚糖、幾丁質(zhì)等物質(zhì)的潛力。本研究中纖維素降解實驗也進一步證明其纖維素降解活性。相對于其他芽孢桿菌，HNU24 預(yù)測出了較高比例的復(fù)合酶類，涉及糖苷水解酶家族內(nèi)的復(fù)合、碳水化合物結(jié)合模塊與糖苷水解酶和輔助氧化還原酶與碳水化合物結(jié)合模塊的跨家族復(fù)合，表明此類酶在功能發(fā)揮方面可能存在一定的復(fù)合性，或是能夠與其他酶類發(fā)生互作。另外，通過對比CAZy 數(shù)據(jù)庫中貝萊斯芽孢桿菌與HNU24 的各酶類分布情況，結(jié)合已經(jīng)報道的其他芽孢桿菌碳水化合物酶類數(shù)量及分布情況[18-21]，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫中注釋的116 個貝萊斯芽孢桿菌的碳水化合物酶的平均數(shù)量約110～130 個，且各酶類數(shù)量分布比例相對穩(wěn)定，但是HNU24 預(yù)測出的碳水化合物酶總量遠低于其他貝萊斯芽孢桿菌平均數(shù)量，僅為平均水平的三分之一，且并未預(yù)測出多糖裂解酶（PLs），AAs 也只以復(fù)合酶類的形式存在，但其仍舊具備極大的抗菌活性和促生能力。這也使得HNU24 區(qū)別于其他菌株?？赡苁窃摼攴蛛x自海南熱帶地區(qū)，其在適應(yīng)海南特殊的地理及氣候條件的過程中發(fā)生進化，加大了復(fù)合酶類的比例，丟失了部分功能冗余的酶類，保留了對其自身特性貢獻度最大的酶類以減小自身的代謝成本[22]。

根據(jù)次級代謝產(chǎn)物預(yù)測結(jié)果，HNU24 能夠通過多種途徑產(chǎn)生不同類型的13 種次級代謝產(chǎn)物，涵蓋了同類代表菌株FZB42 中所有已被證實的具有抗菌活性的所有活性代謝產(chǎn)物。在已鑒定出相似度極高的8 個次生代謝產(chǎn)物中，在FZB42 或芽孢桿菌屬內(nèi)其他菌株上均有相關(guān)功能報道，表面活性素（surfactin）已被證實與介導(dǎo)生物膜的形成有關(guān)[23]；泛革素（fengycin）能夠抑制真菌菌絲生長，如黃曲霉ABA-31[24]；桿溶菌素（bacilysin）對細(xì)菌和真菌具有廣譜抗菌活性，研究報道其為貝萊斯芽孢桿菌拮抗革蘭氏陰性食源性致病菌的主要參與者[25]；桿菌烯（bacillaene）是一類通過抑制蛋白合成來拮抗細(xì)菌和真菌的多烯類抗生素，NANNAN 等[25]和EREGA 等[26]的研究表明，其能夠?qū)漳c彎曲菌的生物膜形成起抑制作用[27]；大環(huán)內(nèi)酰亞胺（macrolactin）、地非西?。╠ifficidin）是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，常見于各類芽孢桿菌中，有研究顯示地非西丁有助于解淀粉芽孢桿菌擴寬抗菌范圍[28-29]，菌毒素（bacillibactin）的直接抗菌活性能夠擴大B. amyloliquefaciens MBI600抗菌范圍[30]。與屬內(nèi)其他芽孢桿菌相比，如B.subtilis 168T、B. amyloliquefaciens DSM7T 等[28-29]，HNU24 產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的種類更多，途徑更廣。值得關(guān)注的是，有1 個基因簇并未找到高相似度的同源蛋白，僅與Streptomyces sp. A2991 中saccharide 途徑合成的butirosin A 或butirosin B有7%的相似度，另有4 個基因簇在數(shù)據(jù)庫中并未尋找到同源蛋白，這表明在HNU24 中可能存在新的抗菌物質(zhì)有待開發(fā)。

通過對貝萊斯芽孢桿菌HNU24 基因序列信息的解析，從基因組層面展示其在生物防治方面和促進植物生長方面具有巨大潛力，對今后該菌株的開發(fā)應(yīng)用方向提供一定的理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)。