孫智，楊寧，婁春波，湯超，楊曉靜

（1 北京大學(xué)定量生物學(xué)中心，北京大學(xué)-清華大學(xué)生命科學(xué)聯(lián)合中心，北京大學(xué)前沿學(xué)科交叉研究院，北京大學(xué)，北京100871； 2 中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院，細(xì)胞與基因線路設(shè)計中心，廣東 深圳 518000）

生物網(wǎng)絡(luò)可以精確、魯棒地執(zhí)行各種各樣的復(fù)雜功能，理解其背后調(diào)控機制是生物學(xué)研究的核心。由于生物系統(tǒng)的高復(fù)雜度，從還原論的角度厘清調(diào)控涉及的所有分子間的作用細(xì)節(jié)是繁瑣且不現(xiàn)實的，而從系統(tǒng)論出發(fā)，可以將我們關(guān)心的調(diào)控關(guān)系抽象為由節(jié)點和邊組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將復(fù)雜問題簡單化。對生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究不僅可以幫助我們宏觀地理解生物系統(tǒng)的工作機制，同時也使得設(shè)計和合成特定的生物學(xué)功能變?yōu)榭赡?。事實上，在以再造、重?gòu)生命系統(tǒng)為核心的合成生物學(xué)中，功能拓?fù)洌ɑ蚧芈罚┑臉?gòu)建已經(jīng)成為其至關(guān)重要的一環(huán)。本文中，我們結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)，對網(wǎng)絡(luò)功能拓?fù)涞睦硇栽O(shè)計及其在合成生物學(xué)中應(yīng)用進行了綜述。本文分為三個部分：生物網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，功能拓?fù)涞睦硇栽O(shè)計，以及功能拓?fù)湓诤铣缮飳W(xué)的應(yīng)用。

1 生物網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系

1.1 自然界生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)模塊化

自然界生物系統(tǒng)中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)無疑是復(fù)雜的，即使是簡化后的生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)依舊是十分巨大且復(fù)雜的，縱然是低等的原核生物大腸桿菌（E.coli）也包含了約4500個基因，編碼了上千種執(zhí)行不同功能的蛋白質(zhì)。直接理解上千個基因的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)無疑是困難的，一種樸素的想法是能否把復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)先拆分成若干簡單的網(wǎng)絡(luò)“模塊”（motif），即網(wǎng)絡(luò)的連接模式，通過先研究清楚簡單模塊的結(jié)構(gòu)和功能，再通過組裝模塊來獲得能實現(xiàn)復(fù)雜功能的網(wǎng)絡(luò)［1］。事實上，2000年Barabasi等［2］就發(fā)現(xiàn)生物網(wǎng)絡(luò)在統(tǒng)計性質(zhì)上不同于隨機網(wǎng)絡(luò)，其結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)高度模塊化，有些生物網(wǎng)絡(luò)具有尺度不變性（scale free）。隨后Alon等［3］的研究進一步表明，相比于隨機網(wǎng)絡(luò)，大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中存在一些頻繁出現(xiàn)的模塊，這些高頻模塊是在一定物理（如擴散常數(shù)）和生化（如酶催化反應(yīng)速率）等約束條件下，生物朝著提高適應(yīng)度（fitness）的方向進化的結(jié)果［4］。

在這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控模塊中，最簡單和常見的一類是自調(diào)控（autoregulation）［5-6］，指的是該基因可以直接或間接地調(diào)控自身的轉(zhuǎn)錄速率。其中，直接調(diào)控表明該基因表達的轉(zhuǎn)錄因子可以直接結(jié)合到自身的啟動子上，而間接調(diào)控則是通過其他基因建立反饋通路（feedback loop）間接地影響自身的轉(zhuǎn)錄速率。這些自調(diào)控又可以按照調(diào)控作用是激活還是抑制進一步分為正反饋（positive feedback）和負(fù)反饋（negative feedback）。在大腸桿菌基因組中鑒定出的198個操縱子單元中，有118個具有轉(zhuǎn)錄因子的自調(diào)控結(jié)構(gòu)，這其中又以負(fù)反饋占多數(shù)（76%，90/118）［7］。人們推測自調(diào)控結(jié)構(gòu)之所以廣泛存在是因為它可以為基因表達帶來一定的功能優(yōu)勢，比如正反饋作用通常會導(dǎo)致系統(tǒng)更加敏感，會放大系統(tǒng)受到的擾動，極端情況下會產(chǎn)生雙穩(wěn)態(tài)（bistability，即系統(tǒng)僅存在兩個能夠穩(wěn)定存在的狀態(tài)：在低于某個濃度閾值下，系統(tǒng)會收斂到低態(tài)，而高于該閾值時，系統(tǒng)會跳轉(zhuǎn)到高態(tài)［8］）。雙穩(wěn)態(tài)對于表觀記憶（即相同基因型的細(xì)胞能夠分化并維持為不同表型的能力）的形成至關(guān)重要［9］，比如在λ噬菌體的裂解態(tài)-溶原態(tài)命運決定（lysis-lysogeny decision）中，其核心調(diào)控即為兩個轉(zhuǎn)錄因子（CI和Cro）相互抑制形成的正反饋通路［10］。相反，負(fù)反饋網(wǎng)絡(luò)則會增加系統(tǒng)抗擾動的能力［8，11-13］，加速系統(tǒng)達到穩(wěn)態(tài)的過程［5］，這對于維持系統(tǒng)的長期穩(wěn)定十分重要，因此負(fù)反饋網(wǎng)絡(luò)經(jīng)常出現(xiàn)在壓力應(yīng)激系統(tǒng)中，例如大腸桿菌的熱刺激響應(yīng)的核心網(wǎng)絡(luò)即為負(fù)反饋網(wǎng)絡(luò)［14］。另外，具有延遲的負(fù)反饋網(wǎng)絡(luò)還能夠使得系統(tǒng)產(chǎn)生振蕩行為（oscillation），例如NF-κB通路中的振蕩行為即通過該機制實現(xiàn)［15］。

除自調(diào)控外，另一類在真實網(wǎng)絡(luò)中頻繁出現(xiàn)的模塊是前饋通路（feedforward loop），即一個上游節(jié)點通過兩條長度不同的路徑連接到下游節(jié)點。根據(jù)這兩條路徑的調(diào)控作用是相同還是相反，可以將前饋通路分為兩大類：若兩條路徑均為激活或抑制作用，稱為一致前饋通路（coherent feedforward loop）；若其中一條路徑為激活作用，另一條路徑為抑制作用，稱為不一致前饋通路（incoherent feedforward loop）。前饋通路對于生物系統(tǒng)的動力學(xué)響應(yīng)具有重要意義，例如一致前饋通路可以作為持續(xù)性檢測器（persistence detector），即只有當(dāng)輸入持續(xù)超過一定刺激時間系統(tǒng)才會開啟。其原理是下游節(jié)點作為最終的信號整合節(jié)點，只有當(dāng)兩個通路的信號同時到達時才會被啟動。這種持續(xù)性檢測模塊可以過濾高頻的噪聲信號，避免不必要的動力學(xué)響應(yīng)［8］。不一致前饋通路則可以實現(xiàn)生物的適應(yīng)性（adaptation），即當(dāng)外界環(huán)境信號發(fā)生改變時，系統(tǒng)首先響應(yīng)信號的變化，在一段時間后又回到接近初始狀態(tài)的過程。適應(yīng)性功能一方面可以使系統(tǒng)在一定的響應(yīng)時間內(nèi)，以一定的響應(yīng)強度來將外界信號的改變有效地傳遞至下游，從而使生物體能夠響應(yīng)環(huán)境的改變，另一方面又通過重置系統(tǒng)使其回歸到信號改變之前的穩(wěn)態(tài)，從而使系統(tǒng)做好響應(yīng)下一次外界刺激變化的準(zhǔn)備，適應(yīng)性使生物可以響應(yīng)外界刺激的變化而不是刺激的絕對值，從而實現(xiàn)了大范圍內(nèi)對刺激的高敏感性［16］。

1.2 生物功能對網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)存在明顯的限制

生物系統(tǒng)為了在變化的環(huán)境中生存而不斷進化。人們推測在如此繁雜的生物世界里一定存在著一些可以適用于多種組織水平的普適性規(guī)律。即使生物演化從頭再來，雖然其中一些細(xì)節(jié)可能會有所不同，這些規(guī)律依然還會出現(xiàn)。如上文所述，生物系統(tǒng)中存在反復(fù)出現(xiàn)的具有特定功能的網(wǎng)絡(luò)模塊，比如控制時序表達、執(zhí)行可靠的細(xì)胞決定以及執(zhí)行魯棒且可調(diào)諧的生物振蕩等等。這些現(xiàn)象和研究結(jié)果暗示著盡管生物網(wǎng)絡(luò)表面上看上去非常復(fù)雜，但對于特定的功能，也許僅存在有限個可以魯棒地執(zhí)行該功能的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。這些拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可能因為存在較少的參數(shù)約束而更有優(yōu)勢。盡管在不同的生物系統(tǒng)中，由于生化參數(shù)和演化歷史不同，具體的一些細(xì)節(jié)可能非常不同（如參與該功能的分子類型、數(shù)目、作用方式等），但實現(xiàn)該功能核心網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)則可能完全相同。

2006年，馬文喆等［17］通過建立網(wǎng)絡(luò)的粗粒化模型并窮舉網(wǎng)絡(luò)空間的行為，發(fā)現(xiàn)功能確實對網(wǎng)絡(luò)核心拓?fù)浯嬖谙拗啤?009年馬文喆等［18］又進一步通過建立粗?；Ｐ汀⒏F舉網(wǎng)絡(luò)空間及理論分析，發(fā)現(xiàn)如果要實現(xiàn)適應(yīng)性，有兩類網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)必具其一。功能對實現(xiàn)它的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)溆兄軓姷南拗?，暗示著?fù)雜且多樣的生物網(wǎng)絡(luò)背后，有著簡約的設(shè)計原理，這些原理不僅能幫助我們理解自然體系，也可以指導(dǎo)我們設(shè)計人工合成的生物系統(tǒng)。

除此以外，生物網(wǎng)絡(luò)通過節(jié)點間相互作用來執(zhí)行和調(diào)控生物功能，是一個動態(tài)過程。即使細(xì)胞狀態(tài)不變，其中的網(wǎng)絡(luò)也處在動態(tài)平衡過程中。網(wǎng)絡(luò)動力學(xué)的研究不僅被用來模擬生物過程，對一些重要的理論和概念的建立也至關(guān)重要。如1997年Barkai和Leibler［19］通過建立大腸桿菌趨化適應(yīng)性的動力學(xué)模型，定量研究了生物網(wǎng)絡(luò)魯棒性的問題。對細(xì)胞周期等自然系統(tǒng)的研究表明生物系統(tǒng)的魯棒性很大程度上依賴于網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)［20］。

2 生物功能網(wǎng)絡(luò)的理性設(shè)計

調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的功能和結(jié)構(gòu)之間存在著密切的對應(yīng)關(guān)系，特定的功能往往由特定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)。然而，僅從自然界中搜索調(diào)控模塊并研究其對應(yīng)功能是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，這是因為：其一，盡管當(dāng)今生物組學(xué)數(shù)據(jù)規(guī)模和精度日益增加，但數(shù)據(jù)中一般不直接包含調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的信息，而從組學(xué)數(shù)據(jù)出發(fā)的網(wǎng)絡(luò)推斷本身是困難且不準(zhǔn)確的；其二，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的功能和結(jié)構(gòu)之間并不是簡單的一一對應(yīng)關(guān)系。一方面，一種功能可以通過多種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)實現(xiàn)，例如，生物系統(tǒng)的適應(yīng)性功能既可以通過負(fù)反饋網(wǎng)絡(luò)也可以通過不一致前饋網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)；另一方面，一種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)也可以實現(xiàn)多種功能，例如，細(xì)胞周期中實現(xiàn)振蕩功能與細(xì)菌趨化性過程中的適應(yīng)性功能同樣都是通過負(fù)反饋網(wǎng)絡(luò)來實現(xiàn)的。也就是說，從自然界中尋找到的網(wǎng)絡(luò)模塊只是在特定約束下生物進化得到的一種可行解，未必是理論最優(yōu)解，在不同約束下從頭進化可能得到完全不一樣的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。因此，我們需要從理論上對更大范圍的網(wǎng)絡(luò)空間進行探索，尋找更加普適的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，探究生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的設(shè)計原理［4］。

這里值得一提的是，傳統(tǒng)的從自然界識別生物模塊的研究范式可以認(rèn)為是自下而上（bottom-up）的，從網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)到功能的研究范式，而理性設(shè)計的研究范式則是自上而下（top-down）的，也即從目標(biāo)功能開始，逆向到尋找可能實現(xiàn)該功能的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在這種研究范式下，我們需要對網(wǎng)絡(luò)空間進行大范圍的搜索，目前常用的搜索方法可以分為窮舉法和優(yōu)化法兩種，接下來分別進行介紹（圖1）。

圖1 生物功能網(wǎng)絡(luò)的理性設(shè)計流程（a）確定需要研究的生物功能。（b）選擇設(shè)計方法：窮舉法或優(yōu)化法。（c）兩種方法的具體實現(xiàn)流程。窮舉法：根據(jù)反應(yīng)類型確定常微分方程（ODE），并隨機對參數(shù)采樣并模擬ODE，最后根據(jù)功能篩選拓?fù)?。?yōu)化法：用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)描述ODE，并優(yōu)化目標(biāo)功能對應(yīng)的誤差函數(shù)，最后通過敲除實驗獲得拓?fù)洹＃╠）獲得最終的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)Fig.1 Rational design for biological networks(a) Identification of biological functions.(b) Two typical design methods: enumeration and optimization.(c) Workflow for these methods.Enumeration method: determining ODE (ordinary differential equation) according to reaction types, randomly sampling parameters to simulate ODE,and finally filtering topological networks with their functions as criteria.Optimization method: describing ODE by neural network to optimize the error function, and finally obtaining the topological networks by knockout experiments.(d) Determination of the final topological networks

2.1 窮舉法

顧名思義，窮舉法的搜索策略是窮舉整個的網(wǎng)絡(luò)空間，即在合理的參數(shù)區(qū)間內(nèi)，通過評估每個網(wǎng)絡(luò)執(zhí)行功能的能力，保留能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)功能的網(wǎng)絡(luò)和參數(shù)（圖1）。這種全局性搜索需要的計算量通常較大，三節(jié)點的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)就有多達19 683種（每條邊僅包含激活、抑制、無相互作用三種調(diào)控），每條邊又對應(yīng)多組參數(shù)選擇，因此對于節(jié)點數(shù)多的系統(tǒng)可能難以計算，一般適用于四節(jié)點以下的系統(tǒng)。然而這種方法的好處是可以避免優(yōu)化法對初始網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)的依賴，尋找到全局最優(yōu)解，讓我們對功能到網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的映射關(guān)系有一個完整清晰的認(rèn)識。

之前的研究已經(jīng)利用窮舉法對于能實現(xiàn)生物單功能的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)做了很好的搜索，這些功能包括雙穩(wěn)［21］、適應(yīng)性［18］、振蕩［22］、體節(jié)發(fā)育［17］、細(xì)胞極性［23］的形成等。這其中被最為廣泛研究的例子是適應(yīng)性［18］。2009年，馬文喆等［18］利用窮舉法，研究了酶促反應(yīng)過程中可以實現(xiàn)適應(yīng)性的網(wǎng)絡(luò)，找到了所有可以完成適應(yīng)性的三節(jié)點網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和其相應(yīng)的原理。該研究通過窮舉三節(jié)點以內(nèi)的網(wǎng)絡(luò)，對其基于米氏方程建立的常微分方程模型進行階梯狀輸入信號的刺激。在模擬中，每個網(wǎng)絡(luò)都有10 000套隨機采樣的動力學(xué)參數(shù)。研究中為了檢驗適應(yīng)性功能的實現(xiàn)情況，定義了如下標(biāo)準(zhǔn)：首先，系統(tǒng)的輸出節(jié)點對外界信號需要有一定的響應(yīng)幅度；其次，輸出節(jié)點最終回到相當(dāng)接近信號改變前的初始狀態(tài)；最后，實現(xiàn)功能的網(wǎng)絡(luò)是魯棒的。為了衡量魯棒性定義了Q值，即每個網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)目標(biāo)功能的參數(shù)套數(shù)占總采樣套數(shù)的比例，Q值超過一定的閾值即被認(rèn)為是魯棒的。窮舉的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在上萬種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，總共有400多個網(wǎng)絡(luò)顯示出魯棒的適應(yīng)性，進一步分析表明，所有400多個網(wǎng)絡(luò)可以總結(jié)為兩類基本模塊，即負(fù)反饋和不一致前饋，而這兩類拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)也正是大腸桿菌和盤狀細(xì)胞黏菌（Dictyostelium discoideum）在趨化過程中產(chǎn)生適應(yīng)性所使用的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)［18，23］。

近年來，人們開始嘗試用窮舉法討論更為復(fù)雜的多功能網(wǎng)絡(luò)，如同時實現(xiàn)振蕩和適應(yīng)性雙功能網(wǎng)絡(luò)［24］，能同時響應(yīng)調(diào)頻和調(diào)幅的輸入信號的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)［25］以及能實現(xiàn)適應(yīng)性和抗噪雙功能［26］、振蕩和抗噪雙功能的網(wǎng)絡(luò)［27］等等。這些工作極大地豐富了我們對于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識（表1）。

表1 理論上獲得的典型功能拓?fù)銽able 1 Typical functional topology developed theoretically

2.2 優(yōu)化法

如前所述，窮舉法隨著網(wǎng)絡(luò)規(guī)模的增加，計算量是指數(shù)增加的，因此無法適用于大網(wǎng)絡(luò)的搜索。取而代之的是優(yōu)化法，它可以通過對所需功能的目標(biāo)函數(shù)進行優(yōu)化，避免大規(guī)模窮舉以減少計算量，因此可以適用于更大規(guī)模的網(wǎng)絡(luò)。早期的優(yōu)化法主要指進化算法，它是一種模擬真實生物進化過程的算法。進化算法從隨機的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、初始節(jié)點狀態(tài)、參數(shù)出發(fā)，進行數(shù)代進化。在每一輪的進化模擬中，網(wǎng)絡(luò)將進行一輪突變，包括節(jié)點的增加或者刪除、邊的增加或者刪除、動力學(xué)參數(shù)的擾動等等，繼而在每一代的模擬中挑選出較好（目標(biāo)函數(shù)分?jǐn)?shù)高）的一定比例網(wǎng)絡(luò)進行保留以及復(fù)制（也可以選擇進行網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)雜交，將結(jié)構(gòu)上有差異的部分進行互換），如此迭代進化。在多輪突變和選擇之后，最后保留下來的便是具有一定功能的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湟约跋鄳?yīng)的工作參數(shù)［29］。人們已經(jīng)利用進化算法對雙穩(wěn)［29］、振蕩［29］、適應(yīng)性［30］、發(fā)育斑圖的形成［31］等簡單的生物功能進行了網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)上的搜索。

近些年，隨著深度學(xué)習(xí)的應(yīng)用越來越廣泛［32］，人們開始嘗試?yán)蒙疃壬窠?jīng)網(wǎng)絡(luò)來代替進化算法對目標(biāo)函數(shù)進行優(yōu)化以提高搜索效率［33-34］（圖1）。具體而言，節(jié)點之間的調(diào)控關(guān)系可以用一個循環(huán)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)來描述，其輸入是各節(jié)點當(dāng)前時刻的濃度，輸出是該時刻各節(jié)點相互調(diào)控后的濃度增量。通過定義動力學(xué)上的目標(biāo)函數(shù)，可以對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的參數(shù)進行優(yōu)化，最終得到滿足目標(biāo)功能的網(wǎng)絡(luò)參數(shù)。為了從優(yōu)化后的調(diào)控函數(shù)中提取出離散的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可以仿照生物學(xué)家的思路對系統(tǒng)進行敲除實驗，即將某個輸出節(jié)點的值設(shè)為0，看對應(yīng)輸出節(jié)點的變化。若基因A輸入設(shè)為0后，基因B的表達量降低了，那就說明A對B為激活作用，以此可以將調(diào)控函數(shù)對應(yīng)的拓?fù)湔业?。通過深度學(xué)習(xí)的方法也可以對適應(yīng)性、振蕩、斑圖形成等生物功能進行行之有效的搜索，并得到和生物進化類似的解［33］。使用優(yōu)化法做網(wǎng)絡(luò)搜索，盡管效率大大提高，也能對大網(wǎng)絡(luò)進行搜索，然而其結(jié)果依賴于算法的初始狀態(tài)，因此容易陷入局部最優(yōu)解，無法像窮舉法一樣遍歷整個網(wǎng)絡(luò)空間，如何改進搜索算法，使得在保證效率的同時盡可能地探索更大范圍的網(wǎng)絡(luò)空間是未來的改進方向之一。

3 功能拓?fù)湓诤铣缮飳W(xué)中的應(yīng)用

對于以再造、重構(gòu)生命系統(tǒng)為核心的合成生物學(xué)而言，圍繞特定的功能需求進行基因回路的設(shè)計與構(gòu)建無疑是其學(xué)科發(fā)展的重要組成部分。在系統(tǒng)生物學(xué)探索功能拓?fù)涞脑O(shè)計原理的同時，合成生物學(xué)也通過實際構(gòu)建的方法探究著各種具有不同功能的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)?。本文接下來的部分將圍繞近年來合成生物學(xué)在實際系統(tǒng)中基因回路的設(shè)計和構(gòu)建展開。具體將以基于轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因線路為主，按照其內(nèi)部調(diào)控節(jié)點的數(shù)目，系統(tǒng)介紹不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)被用來實現(xiàn)的具體功能及其典型實例。最后介紹了近期自動化設(shè)計集成基因線路的發(fā)展、非轉(zhuǎn)錄多層次調(diào)控機制以及網(wǎng)絡(luò)魯棒性的設(shè)計原理。本綜述中介紹的已實際構(gòu)建與驗證的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和基因回路，其功能特點與主要基因元件歸納見表2。

表2 已構(gòu)建實現(xiàn)的基因線路及功能統(tǒng)計Table 2 Functional topology that has been constructed and used in synthetic biology

對天然生命系統(tǒng)中調(diào)控功能的研究最早始于對細(xì)菌中操縱子基因表達調(diào)控的機制，同時轉(zhuǎn)錄調(diào)控尤其是原核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控也是目前理解最為充分的一類調(diào)控機制。因此，合成生物學(xué)基因回路最初也多以轉(zhuǎn)錄因子作為線路中的設(shè)計節(jié)點，以轉(zhuǎn)錄因子對相關(guān)啟動子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)作為節(jié)點間的連接關(guān)系來進行設(shè)計。依據(jù)線路中的轉(zhuǎn)錄因子/單元個數(shù)，這里我們將其劃分為單節(jié)點、雙節(jié)點以及多節(jié)點調(diào)控基因回路。

3.1 單節(jié)點自調(diào)控回路

單節(jié)點的自調(diào)控是最簡單的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，它在設(shè)計上通常構(gòu)成一個轉(zhuǎn)錄表達單元，該轉(zhuǎn)錄單元編碼的蛋白即為轉(zhuǎn)錄因子，而其使用的啟動子即為該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的啟動子。根據(jù)其對自身表達的阻遏或促進作用，分為自抑制和自激活兩類，少數(shù)節(jié)點可同時存在自抑制和自激活的調(diào)控。

自抑制回路（負(fù)反饋）通常基于抑制型轉(zhuǎn)錄因子（或稱阻遏子）設(shè)計，依靠其分子作用機制，通過占位效應(yīng)與RNA聚合酶競爭啟動子結(jié)合位點，或通過路障效應(yīng)阻礙轉(zhuǎn)錄延伸。功能上，負(fù)反饋被認(rèn)為：①能夠有效控制下游信號受環(huán)境噪聲波動產(chǎn)生的異質(zhì)性。Becskei 與Serrano［11］構(gòu)建了基于轉(zhuǎn)錄因子TetR的自抑制回路，實驗發(fā)現(xiàn)相比于開環(huán)結(jié)構(gòu)，自抑制回路確實能夠降低不同個體中的表達水平的異質(zhì)性，并進一步證明了可通過使用aTc誘導(dǎo)劑調(diào)整抑制強度對表達水平變異程度進行控制。②改變系統(tǒng)的動力學(xué)行為。Rosenfeld等［5］同樣基于TetR構(gòu)建了自抑制回路，并實時測量了該線路的熒光輸出隨時間的變化。他們將從線路開啟表達的瞬間開始到線路的輸出達到其最大值的一半時所需要的時間定義為響應(yīng)速度，實驗發(fā)現(xiàn)自抑制回路的響應(yīng)速度比開環(huán)對照組快5倍［5］。值得一提的是，在隨后的工作中，Rosenfeld等［115-116］利用延時熒光顯微觀測技術(shù)對自抑制回路進行了單細(xì)胞水平的實時觀測，結(jié)合細(xì)菌生長速率以及轉(zhuǎn)錄因子合成速率兩個速率參數(shù)的獨立測量，對自抑制回路的表達水平實現(xiàn)了定量水平的從頭預(yù)測。除此以外，Nevozhay等［35］在真核生物芽殖酵母中構(gòu)建了aTc-TetR誘導(dǎo)表達系統(tǒng)，并通過在原有拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上疊加自抑制調(diào)控，將系統(tǒng)由原來對誘導(dǎo)劑的協(xié)同性響應(yīng)模式改變?yōu)榫€性響應(yīng)。此外，實驗中還觀察到自抑制結(jié)構(gòu)同時具有提高對上游信號劑量響應(yīng)靈敏度的功能。后續(xù)工作將該自抑制結(jié)構(gòu)跨物種遷移到哺乳動物細(xì)胞中，在經(jīng)過了對高等真核細(xì)胞底盤的適配調(diào)整后，實現(xiàn)了單模態(tài)、低噪聲、線性化的劑量響應(yīng)功能［36］；近期同樣利用該線性化響應(yīng)模塊結(jié)合光感元件模塊在哺乳動物細(xì)胞中實現(xiàn)了高精度光遺傳控制［37］，展示了自抑制回路的功能在生物系統(tǒng)中具有的普適意義和應(yīng)用價值。

自激活回路（正反饋）在構(gòu)建上利用激活型轉(zhuǎn)錄因子（或稱激活子），利用特定結(jié)構(gòu)域?qū)τ赗NA聚合酶的招募作用，促進對結(jié)合位點下游鄰近啟動子的轉(zhuǎn)錄。①當(dāng)正反饋達到一定強度，系統(tǒng)呈現(xiàn)雙穩(wěn)態(tài)，可以實現(xiàn)開關(guān)效應(yīng)。Longo等［40］利用哺乳動物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄激活因子rtTA構(gòu)建自激活線路，對雙穩(wěn)態(tài)誘導(dǎo)切換的變化過程進行了動態(tài)觀測，觀察到了一系列轉(zhuǎn)變中間過程的雙峰分布情況。②當(dāng)正反饋強度進一步加強，可以出現(xiàn)“磁滯”現(xiàn)象（hysteresis），即系統(tǒng)被一定強度信號刺激到達一個狀態(tài)后具有了記憶性，降低甚至撤掉信號系統(tǒng)仍可以維持原有狀態(tài)，即系統(tǒng)的狀態(tài)與歷史有關(guān)。Kramer與Fussenegger［41］在哺乳動物細(xì)胞中構(gòu)建了基于tTA-VP16的自激活線路，并利用紅霉素誘導(dǎo)解離的嵌合型轉(zhuǎn)錄沉默元件EKRAB額外調(diào)控啟動子的轉(zhuǎn)錄強度。實驗發(fā)現(xiàn)，即使最終走到同一誘導(dǎo)強度，不同初始狀態(tài)條件也會令自激活線路產(chǎn)生不同的狀態(tài)變化過程。與之類似，Chen與Arkin［42］在細(xì)菌中設(shè)計了RNA聚合酶中σ因子SigW的自激活線路，利用RsiW對SigW的拮抗作用實現(xiàn)“分子鎖存”（molecular sequestration）功能，調(diào)諧RsiW的表達量觀測到SigW的“磁滯區(qū)間”，誘導(dǎo)額外的SigW表達可進一步令“磁滯區(qū)間”在RsiW的濃度范圍內(nèi)“滑動”，實現(xiàn)更靈活的記憶狀態(tài)控制。對于如何控制和調(diào)試雙穩(wěn)態(tài)“磁滯區(qū)間”還有更多的研究，如可以通過雙重正反饋嵌套擴大“磁滯區(qū)間”動態(tài)范圍等［117］。除此以外，Ajo-Franklin等［38］在芽殖酵母中設(shè)計了DBD-VP64的嵌合轉(zhuǎn)錄激活因子，構(gòu)建了自激活回路，并利用另一pGal1啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄激活因子接收上游信號控制。通過在培養(yǎng)時控制誘導(dǎo)信號（乳糖濃度），自激活線路被成功地由低表達“撥動”到高表達狀態(tài)，并在信號撤去后依舊維持高表達。后續(xù)工作在哺乳動物細(xì)胞中利用鋅指蛋白-VP64轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體構(gòu)建自激活回路和承接不同的上游信號［39］。該系統(tǒng)被用于記錄不同事件，如誘導(dǎo)劑、低氧、DNA損傷等瞬時刺激，通過雙穩(wěn)態(tài)表型區(qū)分不同應(yīng)激程度的單細(xì)胞，從而可用于更有效、準(zhǔn)確地評估各類刺激對于細(xì)胞其他內(nèi)源生理狀態(tài)的影響。

3.2 雙節(jié)點調(diào)控回路

雙節(jié)點調(diào)控回路在構(gòu)成上包含兩個相互作用的功能單元，設(shè)計上一般由兩個基因表達框構(gòu)成。依據(jù)兩個節(jié)點間不同的反饋類型，可分為正反饋和負(fù)反饋。在構(gòu)建雙節(jié)點線路時可以組合在單節(jié)點中出現(xiàn)的自抑制、自激活回路。

經(jīng)典的雙節(jié)點正反饋回路就是Gardner等［43］最初設(shè)計構(gòu)建“撥動開關(guān)”（toggle switch）合成基因回路的工作，即利用轉(zhuǎn)錄因子LacⅠ和R1構(gòu)建了相互轉(zhuǎn)錄抑制的撥動開關(guān)基因回路。利用IPTG誘導(dǎo)劑對LacⅠ的解抑制和R1的溫敏特性，瞬時改變線路所處的誘導(dǎo)劑濃度狀態(tài)或培養(yǎng)溫度，可以執(zhí)行雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)的撥動效果。構(gòu)建該遺傳撥動開關(guān)的工作激發(fā)了大量對于基因線路狀態(tài)控制的研究和探索，大家相繼實現(xiàn)了利用紫外輻射DNA損傷通路［44］，阻遏蛋白的蛋白酶降解［45］等作為撥動開關(guān)的控制信號。最初版本的撥動開關(guān)聚焦于基因回路中的互抑制開關(guān)調(diào)控，Wu等［46］設(shè)計了撥動開關(guān)的上游開關(guān)，使用上游激活序列（UAS）與乳糖啟動子pGal作為線路中互抑制轉(zhuǎn)錄因子的啟動子，通過調(diào)整培養(yǎng)基的碳源條件直接控制基因回路的運行，期間作者們記錄了基因回路的整個變化路徑，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)是先過渡到中間的不穩(wěn)定動態(tài)平衡點，再由此走到兩個最終穩(wěn)定平衡點的兩階段過程，首次生動展現(xiàn)了基因回路在相空間中的演化景觀。Wu等［118］隨后對更復(fù)雜的多重嵌套自激活回路進行了研究，系統(tǒng)轉(zhuǎn)變過程中，信號變化的順序影響了最終回路的狀態(tài)，在某些信號順序條件下線路可表現(xiàn)出多達4個穩(wěn)態(tài)，而在某種特定順序下僅能形成雙穩(wěn)態(tài)，充分體現(xiàn)了雙穩(wěn)態(tài)基因回路結(jié)構(gòu)的記憶功能和線路動態(tài)演化的路徑依賴性。近年來，越來越多的系統(tǒng)被用來在不同底盤細(xì)胞中構(gòu)建撥動開關(guān)，Kramer等［47］通過設(shè)計轉(zhuǎn)錄因子PIP-KRAB與E-KRAB的相互轉(zhuǎn)錄抑制在中國倉鼠卵巢細(xì)胞系（CHO-K1）中實現(xiàn)了撥動開關(guān)。Lebar等［48］利用TALE系統(tǒng)，通過疊加自激活線路增大了TALE的協(xié)同性，從而在完全使用無協(xié)同性轉(zhuǎn)錄因子的情況下依靠線路設(shè)計最終在哺乳動物細(xì)胞中獲得了撥動開關(guān)。Li等［49］進一步系統(tǒng)性地設(shè)計了26個彼此正交的TALE阻遏子，通過在啟動子區(qū)串聯(lián)多個TALE結(jié)合位點提高其協(xié)同效應(yīng)并構(gòu)建了撥動開關(guān)。作者們以小發(fā)卡RNA（shRNA）對轉(zhuǎn)錄本的干擾沉默作為該線路的撥動信號，能夠在納克（ng）量級響應(yīng)并切換線路狀態(tài)，同時利用該線路能夠?qū)崿F(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)源RNA表達種類的有效識別，因此也可用于對處于不同狀態(tài)細(xì)胞亞群的鑒定。對撥動開關(guān)基因回路的構(gòu)建和深入理解同時引領(lǐng)研究者對線路功能進行定量、可預(yù)測的構(gòu)建和設(shè)計。Chen等［50］基于CI和CI434兩個阻遏蛋白設(shè)計了互抑制回路，建模分析發(fā)現(xiàn)可通過對于兩個阻遏蛋白翻譯強度的控制調(diào)諧出現(xiàn)雙穩(wěn)態(tài)。作者們繼而對兩個蛋白的核糖體結(jié)合位點區(qū)（RBS）進行了突變建庫，分析了RBS折疊的熱力學(xué)吉布斯自由能變，據(jù)此估計了翻譯強度，構(gòu)建了基于核糖體結(jié)合概率的統(tǒng)計熱力學(xué)模型。圍繞此預(yù)測，獨立設(shè)計不同折疊自由能的RBS，其構(gòu)建線路最終表現(xiàn)出的雙穩(wěn)態(tài)行為與預(yù)測結(jié)果吻合［119］。該工作有效結(jié)合理論模擬與實驗驗證，利用對底層元件的刻畫直接預(yù)測了系統(tǒng)功能表型，展示了基于第一性原理對基因回路進行定量可預(yù)測設(shè)計的能力。

雙節(jié)點負(fù)反饋回路在形式上為“激活-抑制”。它最經(jīng)典的功能應(yīng)用是“振蕩”。Stricker等［51］首先在細(xì)菌中基于阻遏蛋白LacⅠ和激活蛋白AraC構(gòu)建了振蕩回路。其中，LacⅠ同時抑制自身與AraC，AraC也同時激活自身與LacⅠ，構(gòu)成了雙節(jié)點負(fù)反饋同時各節(jié)點自調(diào)控（正/負(fù)自反饋）的多反饋嵌合線路。該線路能夠產(chǎn)生多次振蕩，且通過誘導(dǎo)劑IPTG和阿拉伯糖可對線路的振蕩周期進行調(diào)節(jié)，動力學(xué)模型顯示，負(fù)反饋的時間延遲是線路產(chǎn)生振蕩行為的首要條件，正反饋對于線路行為的魯棒性和可調(diào)節(jié)性起到增強效果。Hussain等［52］后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)該線路的振蕩周期與溫度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，線路內(nèi)的生化反應(yīng)動力學(xué)受到溫度的決定，作者們進而設(shè)計了溫敏LacⅠ元件（tsLacⅠ），運用到振蕩線路中以補償溫度變化，從而使線路的振蕩周期對環(huán)境溫度波動具備了魯棒性。Mondragón-Palomino等［53］進一步研究了當(dāng)存在周期性外部環(huán)境信號時上述線路的振蕩行為。振蕩功能是生物界中普遍存在的生物節(jié)律現(xiàn)象的基礎(chǔ)。Tigges等［54］利用正/反義mRNA首先在哺乳動物細(xì)胞中設(shè)計了雙節(jié)點負(fù)反饋線路。并在隨后的工作中，將正/反義mRNA的負(fù)反饋替換為基于siRNA的RISC干預(yù)降解作用，在單細(xì)胞水平觀察到了周期近似為26 h的低頻振蕩，接近天然晝夜節(jié)律的周期特征［55］。雙節(jié)點負(fù)反饋拓?fù)涞牧硗庖粋€功能應(yīng)用是適應(yīng)性（adaptation）。孫智等［56］以史文佳［120］、張明悅［24］等理論工作得到的最優(yōu)拓?fù)錇橐罁?jù)，在細(xì)菌中構(gòu)建了符合拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)且滿足關(guān)鍵參數(shù)條件的雙節(jié)點基因線路，實驗系統(tǒng)實現(xiàn)了精確的適應(yīng)性功能，同時在多種不同環(huán)境下均表現(xiàn)出魯棒性［56］。

3.3 多節(jié)點調(diào)控回路

多節(jié)點回路含有3個及以上的功能節(jié)點，同樣可以組合在單節(jié)點和雙節(jié)點中出現(xiàn)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。根據(jù)其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，可劃分為以下有代表性的幾類：負(fù)反饋回路、前饋回路、組合邏輯門線路等。

首先，多節(jié)點間可通過遍歷所有節(jié)點首尾依次串聯(lián)成環(huán)，當(dāng)存在奇數(shù)個抑制作用調(diào)控時，構(gòu)成負(fù)反饋回路。多節(jié)點負(fù)反饋最經(jīng)典的應(yīng)用是抑制振蕩子（repressilator）。2000年Elowitz與Leibler［28］率先在E.coli中進行了三節(jié)點負(fù)反饋回路的構(gòu)建，這也是合成生物學(xué)構(gòu)建的第一個人工拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。作者們使用了3個抑制型轉(zhuǎn)錄因子（TetR，LacⅠ，λCI），并令每一個轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的啟動子控制下游轉(zhuǎn)錄因子的表達構(gòu)成了抑制振蕩子，實現(xiàn)了周期性振蕩。在之后的工作中，Potvin-Trottier等［57］針對原始版本抑制振蕩子振蕩不穩(wěn)定的問題進行了改造，改造后的抑制振蕩子可在搖瓶培養(yǎng)和平板單克隆生長等復(fù)雜條件下僅依靠細(xì)胞內(nèi)的基因回路作用產(chǎn)生宏觀水平的群體同步振蕩。同樣為解決合成基因回路的功能穩(wěn)定性問題，Luro等［58］結(jié)合微流控芯片和光阱捕獲技術(shù)，發(fā)展了實時觀測選菌和回收后純培養(yǎng)的策略，通過拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)設(shè)計結(jié)合大規(guī)模表達強度建庫篩選，獲得了功能更穩(wěn)定的菌株。構(gòu)建抑制振蕩子或撥動開關(guān)等基礎(chǔ)回路也被作為檢驗新開發(fā)合成生物學(xué)基礎(chǔ)調(diào)控元件功能特性的參考手段。

多節(jié)點同時可以形成前饋，如前所述，前饋根據(jù)兩條調(diào)控線路作用到輸出節(jié)點的效果是否一致，分為一致前饋和不一致前饋［121］。不同的前饋回路可能具有如信號加速器、延遲器、脈沖發(fā)生器等功能［59-64］。在合成生物學(xué)中應(yīng)用比較多的是不一致前饋，其在時間響應(yīng)上表現(xiàn)為脈沖發(fā)生器（pulse-generator），在空間（濃度梯度）響應(yīng)上表現(xiàn)為帶通濾波器（band-pass filter）的功能。Basu等［65］設(shè)計了接收AHL小分子濃度信號的基因回路，組成型表達的轉(zhuǎn)錄因子LuxR可在AHL的誘導(dǎo)條件下激活CI和GFP的表達，CI隨之抑制GFP的轉(zhuǎn)錄，構(gòu)成了LuxR-CI-GFP的不一致前饋，在該系統(tǒng)中GFP的表達與否取決于LuxR受誘導(dǎo)激活開啟轉(zhuǎn)錄，且CI尚未達到有效抑制濃度的時間窗口。作者們進一步將帶通濾波器功能應(yīng)用到了空間，設(shè)計了可合成AHL的發(fā)送菌，在固體培養(yǎng)基上將發(fā)送菌與接收菌進行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)接收菌距離發(fā)送菌的遠(yuǎn)近影響了回路中產(chǎn)生GFP脈沖發(fā)生的時間［65］。隨后的工作中，作者們進一步拓展了不一致前饋的空間行為，理論分析了空間上不同位置的接收菌表達模式的時空演變，實驗驗證了空間中存在多個發(fā)送源時形成的復(fù)雜表達模式［66］。Tabor等［6］通過設(shè)計光敏傳感器，利用不一致前饋實現(xiàn)了邊界探測器。Greber與Fussenegger［68］利用tTA激活轉(zhuǎn)錄沉默元件E-KRAB和Pip構(gòu)成不一致前饋，在CHO細(xì)胞系中構(gòu)建了帶通檢測器。對基因回路的表達模式實現(xiàn)精準(zhǔn)控制依賴于對其內(nèi)部各基因元件功能及其組合相互作用的準(zhǔn)確定量，張浩千等［122］開發(fā)了對基因元件功能精確表征的測量方法，隨后利用該方法對E.coli中的轉(zhuǎn)錄激活元件和轉(zhuǎn)錄抑制元件進行了轉(zhuǎn)換曲線的精確定量，結(jié)合絕緣化裝配策略，批量構(gòu)建了不一致前饋回路，利用元件參數(shù)獨立預(yù)測線路的帶通濾波器行為，實驗驗證與理論預(yù)測能夠在定量水平上保持一致［69］。

除此以外，多節(jié)點網(wǎng)絡(luò)同時使得構(gòu)建復(fù)雜的邏輯線路變?yōu)榭赡堋＿壿嬀€路是對線路中輸入/輸出信號進行了離散化處理，組合邏輯門線路需要多個輸入信號共同對線路進行調(diào)控。線路對每種輸入信號所處邏輯狀態(tài)均可執(zhí)行“計算”，最終獲得輸入組合與輸出結(jié)果的“真值表”。Guet等［70］最初利用抑制振蕩子中的三個基本元件（LacⅠ、TetR、λCI），通過打亂啟動子控制的順序設(shè)計了一系列邏輯線路，在誘導(dǎo)劑IPTG、aTc的組合情況下表現(xiàn)出不同的邏輯行為，展示了利用生物介質(zhì)執(zhí)行邏輯運算的可能性。隨后更多對邏輯線路進行構(gòu)建和探索的研究工作就此展開。為解決設(shè)計任意邏輯門線路的功能完備性，Tamsir等［71］設(shè)計了利用雙啟動子構(gòu)建OR Gate控制阻遏蛋白NOT Gate，構(gòu)成了NOR Gate（與非門）的基本框架，理論上可由該基本單元的排布組合進行任意邏輯門的設(shè)計。Stanton等［72］設(shè)計了一套從原核TetR家族轉(zhuǎn)錄因子中進行篩選的策略，最終獲得16個可作為NOT Gate的高質(zhì)量阻遏子，可供支持構(gòu)建1054種不同的邏輯運算線路，足以展開用戶自定義的設(shè)計。此外，在元件設(shè)計方面也有關(guān)于組合邏輯門的工作，如通過設(shè)計核糖腳踏開關(guān)（toehold switch），在翻譯水平引入邏輯控制，實現(xiàn)一次性整合多輸入信號的邏輯計算［123-124］。常規(guī)邏輯線路中，每一次的輸入信號是彼此獨立的，不存在出現(xiàn)順序或次數(shù)對最終邏輯真值的影響。在某些特殊情況下，線路不僅會計算當(dāng)前輸入信號的狀態(tài)，輸入信號的歷史與順序也會影響最終的輸出值，此時線路對輸入信號具有了記憶功能，稱這類線路表現(xiàn)為時序邏輯（sequential logic）。婁春波等［73］率先構(gòu)建了具有單輸入信號和單層歷史記憶的時序邏輯線路。張浩千等［74］基于上述單輸入時序邏輯線路構(gòu)建了更為復(fù)雜的雙輸入型條件邏輯線路，線路根據(jù)某種輸入情況在過去發(fā)生與否決定未來對當(dāng)前輸入采取何種響應(yīng)，從行為上類似經(jīng)典的巴甫洛夫?qū)嶒灒和ㄟ^后天習(xí)得所建立的條件反射活動［74］。Andrews等［75］在時序邏輯基礎(chǔ)上，利用正反饋線路的磁滯特點，進一步設(shè)計了鎖存結(jié)構(gòu)（set-reset latch），可更靈活地對記憶模塊的“可修改性”進行控制，利用該系列模塊，建立了能夠在記憶狀態(tài)空間中的不同狀態(tài)間發(fā)生切換的檢查點邏輯，實現(xiàn)了對多達四種狀態(tài)的時序切換控制。

邏輯線路具有簡潔易編程的特點，以之為設(shè)計模式促進了基因線路設(shè)計向更大規(guī)模、更復(fù)雜連接的趨勢前進。目前合成生物學(xué)規(guī)模化的集成基因線路設(shè)計主要沿循集成電子線路設(shè)計的邏輯，對系統(tǒng)進行模塊化處理，同時對每個模塊進行元件的絕緣封裝，然后基于邏輯線路對復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)進行搭建。集成基因線路對基因元器件提出了更高的要求，比如首先要求在數(shù)量上應(yīng)產(chǎn)生更多的基因元器件以滿足可規(guī)?；男枨螅瑫r要求保證高度正交性、無明顯表達毒性、避免相似序列和元件復(fù)用等設(shè)計規(guī)范。為此開展了一批元件挖掘和表征的工作，如前文所述的原核阻遏子系統(tǒng)性挖掘工作［72］，表征與設(shè)計原核轉(zhuǎn)錄終止子文庫［125］，開發(fā)多套正交性好、動態(tài)區(qū)間廣的小分子傳感器［126］，以及對RBS等序列元件的強度預(yù)測乃至從頭定量設(shè)計等［119，127］。除此以外，從參數(shù)性能表征上，由于集成基因線路的設(shè)計無法像小規(guī)?；蚓€路一樣，通過自下而上地逐一驗證、逐層構(gòu)建調(diào)試來完成，這就要求對于底層元件的性能要有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的測定，功能刻畫要求足夠精準(zhǔn)，可公式化形成元件的內(nèi)稟參數(shù)以支持仿真模擬，且元件的行為在置入基因線路后不發(fā)生顯著改變。為使元件表征支持可規(guī)模放大，婁春波等［128］設(shè)計了基于核酶（ribozyme）的轉(zhuǎn)錄-翻譯水平絕緣子，對轉(zhuǎn)錄后mRNA的5＇端進行同一化處理，使功能元件性質(zhì)不受上游啟動子選擇的影響干擾，極大提升了元件組裝的可預(yù)測性；Gorochowski［129］、Espah Borujeni等［130］進一步借助RNA-Seq和ribosome profiling等高通量實驗手段對線路行為進行表征，可對元件功能進行更準(zhǔn)確的定義，對線路整體運行情況獲得更全面的理解，輔助進行故障歸因與修復(fù)，對于當(dāng)前基于表達量控制的基因回路設(shè)計主流方案有很大幫助。從線路設(shè)計上，針對復(fù)雜功能需求設(shè)計集成基因線路，無論是利用規(guī)則模型還是窮舉策略，都不可能基于手工完成，需要借助計算機輔助設(shè)計（computer-aided design，CAD）軟件實現(xiàn)。MIT的Voigt組開發(fā)了基因線路自動化設(shè)計軟件Cello（https：//cellocad.org），借用了硅基集成電路的設(shè)計模式，實現(xiàn)了從自定義需求到指定線路序列的CAD自動化設(shè)計［76］。Cello的設(shè)計目標(biāo)是符合用戶自定義真值表的細(xì)胞狀態(tài)線路，開發(fā)者們首批構(gòu)建了60條，總計全長約88萬個堿基對的基因線路，其中最多可達10個阻遏子表達單元，55個遺傳元件，在不經(jīng)任何調(diào)試的前提下，共有45條線路可正確執(zhí)行其全部邏輯狀態(tài)，測試正確的邏輯狀態(tài)約占全部設(shè)計的92%。隨后的工作中，圍繞Cello的基本原則，開發(fā)者們開發(fā)了在各類問題情境下的一系列適配版Cello［77-80，131］。近期Cello的開發(fā)團隊撰文，也在Nature Protocols期刊上對其最新在線版本與更新進展進行了系統(tǒng)完整的介紹［132］。

3.4 轉(zhuǎn)錄調(diào)控外的其他不同層次的調(diào)控工具

隨著對更多分子生化過程認(rèn)知理解的加深，形成了種類更加豐富的基礎(chǔ)基因元件，從而使基因回路可不再僅局限于轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，能夠在基因表達的各個環(huán)節(jié)展開設(shè)計。各類基因元件的功能屬性有著較大的差異，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特征時間尺度多以小時計，而酶促生化反應(yīng)可快至秒量級，不同層次基因元件的組合使用也豐富了基因回路的功能與應(yīng)用。

在DNA水平調(diào)控方面，Rubens等［81］開發(fā)了以絲氨酸重組酶為基礎(chǔ)的開關(guān)系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)構(gòu)建了不一致前饋，實現(xiàn)了濾波功能，同時進一步驗證了該設(shè)計模式下的多比特數(shù)字信號轉(zhuǎn)換、多輸入組合邏輯運算等功能。重組酶系統(tǒng)也可用于時序控制設(shè)計。Kim等［82］設(shè)計了拆分的重組酶，利用該系統(tǒng)，作者們在哺乳動物細(xì)胞中設(shè)計了一系列預(yù)先排布的表達框，當(dāng)且僅當(dāng)前一個表達框被移除后，下一個表達框開啟表達，從而實現(xiàn)了一系列目的基因的時序表達控制，并結(jié)合CRISPR系統(tǒng)進行了多基因時序調(diào)控、時序編輯，且功能結(jié)束后進行系統(tǒng)自毀的概念驗證。

在RNA水平調(diào)控方面，Wroblewska等［83］利用L7Ae RNA結(jié)合蛋白結(jié)合k-turn motif的翻譯抑制功能，在哺乳動物細(xì)胞中成功構(gòu)建了多輸入miRNA分類器，RNA調(diào)控級聯(lián)等回路，在RNA復(fù)制子（RNA replicon）協(xié)同設(shè)計下可獲得更高的變化倍數(shù)，以此構(gòu)建的RNA水平的撥動開關(guān)，能夠獲得更穩(wěn)定的雙穩(wěn)態(tài)和更高的信噪比。Wagner等［84］在上述基礎(chǔ)上進一步引入小分子誘導(dǎo)調(diào)控，使用TMP分子與DHFR降解肽等增強對RNA回路的調(diào)節(jié)能力，通過對RNA結(jié)合蛋白穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)，可進一步調(diào)控回路輸出的變化倍數(shù)。除此以外，CRISPR系統(tǒng)因其具備良好的可編程性和簡潔操作性，近年來有大量工作將CRISPR/Cas系統(tǒng)用作抑制、激活等轉(zhuǎn)錄調(diào)控工具，同樣也可作為基本元件用于搭建基因回路［85-90］。

在蛋白水平調(diào)控方面，可利用蛋白質(zhì)間的非共價親和作用或共價催化修飾作用等，直接在翻譯后水平進行基因回路設(shè)計。Fernandez-Rodriguez與Voigt［91］測試了多組植物病毒來源的蛋白酶，設(shè)計了蛋白酶切割對降解肽標(biāo)簽的移除或暴露等功能，實現(xiàn)了翻譯后水平的調(diào)控行為。Gao等［92］基于亮氨酸拉鏈二聚化與拆分蛋白酶的設(shè)計，在哺乳動物細(xì)胞中構(gòu)建了基于翻譯后水平的基因回路，設(shè)計了蛋白酶互作，邏輯門調(diào)控以及基于不一致前饋的濾波和脈沖發(fā)生器功能。Chen等［93］基于蛋白酶切割自身降解肽的自維持以及蛋白酶相互切割拆分二聚化的互抑制功能，通過上游輸入信號對兩個蛋白酶節(jié)點的全連接構(gòu)成了淺層的蛋白酶調(diào)控神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。Zhu等［94］模擬天然多穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)中以蛋白質(zhì)寡聚為調(diào)控手段的特點，利用鋅指以及寡聚結(jié)構(gòu)域設(shè)計了可同源/異源二聚化的合成轉(zhuǎn)錄因子，并繼而利用該系統(tǒng)設(shè)計三類轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動物細(xì)胞中實現(xiàn)了最多可達7個穩(wěn)態(tài)，后將該系統(tǒng)推廣到4個轉(zhuǎn)錄因子，多達15穩(wěn)態(tài)的設(shè)計。

3.5 功能網(wǎng)絡(luò)魯棒性的設(shè)計

隨著可構(gòu)建基因回路的規(guī)模與復(fù)雜度不斷增加，對基因回路行為的可預(yù)測性提出了更高的要求。由于基因回路在物理上并不絕緣的特點，以及生物系統(tǒng)中天然存在較高的內(nèi)外源噪聲，如何使得設(shè)計的基因回路在多種不同的環(huán)境條件下可以穩(wěn)定地執(zhí)行功能至關(guān)重要。

回路功能的“失穩(wěn)”因素首先會來源于回路內(nèi)部的組成，不同模塊之間可能通過“隱含”的相互作用對彼此的功能產(chǎn)生影響。隱含的相互作用是不被期望的，在設(shè)計之初也未主動設(shè)計，但當(dāng)回路的構(gòu)成模塊逐漸增多時，其隱含連接強度就會增強，致使回路表現(xiàn)出不符合預(yù)期的行為［133］。隱含連接的一個主要來源是對回路內(nèi)公共調(diào)控元件的分配利用，Jayanthi等［96］表征了轉(zhuǎn)錄調(diào)控回路中元件的功能干擾，阻遏子LacⅠ可調(diào)節(jié)下游報告基因，在報告基因?qū)acⅠ進行利用之外，同時也存在可對LacⅠ蛋白進行競爭的lacO負(fù)載位點，作者們實驗驗證了開啟或關(guān)閉LacⅠ基因表達對下游報告基因的調(diào)控動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)有負(fù)載存在時，開啟LacⅠ表達對報告基因產(chǎn)生抑制要明顯滯后于不存在負(fù)載時的情況，而當(dāng)關(guān)閉LacⅠ表達時，負(fù)載的存在也會導(dǎo)致報告基因表達獲得更快的恢復(fù)，證明了下游負(fù)載會通過對公共調(diào)控元件的資源競爭影響回路原本的動力學(xué)響應(yīng)過程。Qian等［97］進一步探討了回路模塊資源占用對回路功能行為的附加影響，他們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)把獨立表征良好的元件進行模塊化組合后，在某些情況下整體功能行為會完全偏離預(yù)期情況，作者將該回路異常歸因于元件表達對底盤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯公共資源的需求，并驗證了可通過調(diào)整基因拷貝水平和翻譯強度對線路預(yù)期功能的有效維持。

系統(tǒng)的動力學(xué)是由網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)所決定的。這種“隱含”連接所造成的公共調(diào)控元件的不合理分配利用，可以通過調(diào)整網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)來實現(xiàn)。目前最常見的方式：①增加額外的時間尺度分離調(diào)控策略，緩解資源的競爭效應(yīng)。Nilgiriwala等［98］設(shè)計了受激酶/磷酸酶調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，上游信號通過控制激酶表達水平而非直接控制轉(zhuǎn)錄因子對下游目的基因進行調(diào)控，作者們通過實驗與模擬證實了該設(shè)計結(jié)構(gòu)能夠有效緩沖下游負(fù)載間彼此的競爭，緩沖程度可通過改變轉(zhuǎn)錄因子總表達量進行調(diào)控；Mishra等［99］在芽殖酵母中設(shè)計了基于多重激酶/磷酸酶對的資源控制分配，消除了負(fù)載對于報告基因響應(yīng)動力學(xué)的干擾；Jones等［100］進一步將負(fù)載控制設(shè)計拓展到哺乳動物細(xì)胞中，開發(fā)了激酶/磷酸酶的基本元件，并通過下游表達磷酸酶構(gòu)成對可逆磷酸化過程的反饋控制，實現(xiàn)了在一定程度上對表達強度擾動的魯棒性和減弱表達噪聲的效果。②利用負(fù)反饋進行約束，包括自抑制、不一致前饋以及積分負(fù)反饋等。如Huang等［101］設(shè)計了在轉(zhuǎn)錄后水平的自約束模塊，該模塊同時表達目的蛋白和特異性σ因子，驅(qū)動表達針對目的基因轉(zhuǎn)錄本的互補siRNA，主動控制了目的基因mRNA濃度，從而實現(xiàn)了不同模塊之間的解偶聯(lián)，避免了對翻譯資源（如公共核糖體）的競爭，穩(wěn)定了目的基因的表達；Jones等［102］基于同樣的思路，在哺乳動物細(xì)胞中利用使用相同轉(zhuǎn)錄資源的RNA內(nèi)切酶對目的基因mRNA進行調(diào)控，構(gòu)建了不一致前饋，在較強前饋抑制的情況下較好地實現(xiàn)了目的基因表達對公共資源競爭的解耦；Fret等［103］則通過利用模塊內(nèi)共表達miRNA的方式對mRNA進行調(diào)控，屏蔽負(fù)載基因?qū)δK內(nèi)目的基因的干擾。除此以外，Huang等［104］借用CRISPR/dCas9系統(tǒng)中多個sgRNA對dCas9公共蛋白的競爭性，具象化地展示了下游各模塊間的隱含相互作用，通過設(shè)計dCas9自抑制的調(diào)控回路，使公共資源能夠根據(jù)下游競爭強度靈活補充資源供給，使得下游各sgRNA模塊能夠有效執(zhí)行預(yù)期調(diào)控功能。除上面的例子外，還有很多類似用負(fù)反饋進行控制的例子［7，108-114］，這里就不一一贅述。

除公共調(diào)控元件的分配利用會影響基因回路功能外，底盤細(xì)胞還存在各種各樣的外部和內(nèi)部噪聲，比如細(xì)胞的生長分裂等生理狀態(tài)變化，它們都會很大程度地影響細(xì)胞內(nèi)的各種反應(yīng)以及蛋白的表達水平，相同基因型的群體細(xì)胞內(nèi)同種蛋白質(zhì)的水平可能會有量級上的差別，而這些都會大大影響基因回路的功能。雖然其中的很多噪聲是隨機的，很難進行控制，但面對同樣的噪聲，不同拓?fù)涞墓δ荇敯粜允墙厝徊煌?。相同性質(zhì)的基因回路會因為其具體的拓?fù)鋵崿F(xiàn)方式不同，表現(xiàn)出對生長過程不同程度的敏感性，比如Zhang等［105］測試了單節(jié)點自激活回路和雙節(jié)點互抑制回路兩類雙穩(wěn)態(tài)，發(fā)現(xiàn)自激活雙穩(wěn)態(tài)表型會因為細(xì)胞的快速分裂丟失高態(tài)，而互抑制的雙穩(wěn)態(tài)則相對于分裂速率不敏感，并通過理論模擬分析了該假設(shè)。既然同一功能不同拓?fù)涞聂敯粜越厝徊煌?，如何對功能拓?fù)涞聂敯粜赃M行設(shè)計就變成了一個關(guān)鍵問題。事實上，除上述提到的增加各種負(fù)反饋來降噪外，在理論上對功能網(wǎng)絡(luò)進行理性設(shè)計的時候，是可以對網(wǎng)絡(luò)功能的魯棒性進行定量評估的［17］。理論上的評估一般是參數(shù)敏感性分析，比如在2009年適應(yīng)性網(wǎng)絡(luò)的理論工作中，作者對于每一個網(wǎng)絡(luò)撒了10 000套隨機采樣的動力學(xué)參數(shù)，通過動力學(xué)模擬觀測最終多少套參數(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)功能定義了拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的魯棒性，套數(shù)越多魯棒性越高。雖然該策略在理論上獲得了成功，但因為它對應(yīng)的是模型參數(shù)空間，而很多時候模型中的參數(shù)與真實生物系統(tǒng)無法一一對應(yīng)，所以仍需證明基于該策略所獲得的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在實際生物系統(tǒng)條件下確實具備魯棒性。這里值得一提的是，最近，孫智等［56］基于理論窮舉所得的完美適應(yīng)性的最優(yōu)（魯棒性最高）拓?fù)?，實驗?gòu)建了滿足理論要求的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和關(guān)鍵參數(shù)約束的基因回路。實驗發(fā)現(xiàn)從輸入信號改變、拓?fù)鋮?shù)系統(tǒng)性變異、改變底盤細(xì)胞生理條件甚至進行基因回路的直接跨物種遷移等維度，對基因回路的功能進行了系統(tǒng)的擾動，該基因回路均實現(xiàn)了精確適應(yīng)性行為，確實具有非常強的魯棒性；反之，對于拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)或關(guān)鍵參數(shù)約束被破壞的對照拓?fù)鋭t明顯魯棒性不足，適應(yīng)性行為的精確性極易受到擾動。該工作首次證明了基于理論發(fā)掘所得的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在各類復(fù)雜真實場景下執(zhí)行功能的有效性，為進一步理論結(jié)合實驗進行更有效、可靠的線路功能設(shè)計提供了參考與范例。

4 總結(jié)與展望

復(fù)雜的生物系統(tǒng)經(jīng)過長期的進化，可以精確地、魯棒地執(zhí)行各種生物功能。在分子和細(xì)胞水平上，生物功能是通過基因和蛋白質(zhì)相互作用，即生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來完成的。網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、動力學(xué)性質(zhì)與功能之間有著緊密的聯(lián)系。如何定量刻畫這種關(guān)系、找出其中的規(guī)律，是理解復(fù)雜生命現(xiàn)象的關(guān)鍵。越來越多的證據(jù)表明可以將不同生物系統(tǒng)、不同層次網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)統(tǒng)一起來的設(shè)計原理的確存在。系統(tǒng)生物學(xué)發(fā)揮計算的優(yōu)勢，建立了大量生物網(wǎng)絡(luò)的可計算模型，找到了多種關(guān)鍵生物行為中的核心功能拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，這些知識不僅能幫助我們理解自然體系，也可以指導(dǎo)我們設(shè)計人工合成的生物系統(tǒng)。功能拓?fù)涞臉?gòu)建作為引領(lǐng)合成生物學(xué)的開端工作，標(biāo)志著人類從理解生命、認(rèn)識生命開始走向改造生命、設(shè)計生命的階段。在此過程中，大量的天然基因得以表征和刻畫，對其性質(zhì)有了更深入乃至定量化的理解，大量的功能拓?fù)涞靡詷?gòu)建，功能涵蓋了穩(wěn)態(tài)行為、動態(tài)過程、劑量響應(yīng)、參數(shù)分岔、空間行為等諸多方面，而不同體系里面功能拓?fù)涞膶嶋H構(gòu)建又進一步深化了對拓?fù)浔旧淼睦斫狻Ｔ谶@個過程中，系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)無論是人員還是研究方法高度交叉，彼此借鑒。

隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，對復(fù)雜功能需求的增加，功能拓?fù)涞脑O(shè)計朝著規(guī)?；较虻陌l(fā)展是一個必然的趨勢。目前合成生物學(xué)的規(guī)?；募苫蚓€路設(shè)計主要沿循集成電子線路設(shè)計的邏輯，對系統(tǒng)進行模塊化，同時對每個模塊進行絕緣封裝，然后基于邏輯線路對復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)進行搭建。這種方式非常便于設(shè)計、規(guī)?；妥詣踊?，但隨著邏輯層數(shù)的增加，彼此噪聲的影響以及能量和代謝流的分配都將很大程度影響系統(tǒng)功能的穩(wěn)定性。對于一些復(fù)雜功能，如何借鑒生物本身復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)進行整體式、全景式的設(shè)計，如何能讓一個網(wǎng)絡(luò)在各種復(fù)雜環(huán)境下可以魯棒地執(zhí)行目的功能，如何讓同一網(wǎng)絡(luò)執(zhí)行多個功能，如何以能耗更低的成本實現(xiàn)預(yù)期功能，無疑為系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)帶來更大的機遇和挑戰(zhàn)。