李雪梅,徐新運(yùn),顧亞軍,王會(huì)會(huì),陳 銀,李 敏,徐崢嶸,魏先梅,王涵東,俞晨杰,高 下

0 引 言

鼻腔作為呼吸道的門戶和通道,對(duì)呼吸氣流在體外與體內(nèi)的接觸起重要作用。鼻黏膜面積廣闊,且毛細(xì)血管和腺體豐富。鼻黏膜不僅能感受吸入鼻腔內(nèi)氣體的氣流分布,而且能調(diào)節(jié)吸入氣體的溫度和濕度,這對(duì)于維持鼻腔正常生理功能至關(guān)重要。經(jīng)鼻腔處理的呼吸氣流會(huì)進(jìn)入肺部進(jìn)行氣體交換,肺在此過(guò)程中會(huì)受到廣泛而重復(fù)存在的機(jī)械力作用[1]。鼻黏膜在呼吸過(guò)程中可能同肺一樣受到類似的機(jī)械力作用,并通過(guò)感受這種機(jī)械力作用參與維持鼻腔正常生理功能。

機(jī)械敏感性離子通道是一類將機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化為電化學(xué)信號(hào)的離子通道,在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中占有重要地位,并且該類通道廣泛分布于不同物種和多種組織器官中,并參與各種生理過(guò)程[2]。Piezo家族,包括Piezo1和Piezo2,是2010年Coste等在小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種機(jī)械敏感性陽(yáng)離子通道[3]。在背根神經(jīng)元中可觀察到Piezo2的強(qiáng)表達(dá),并被認(rèn)為是介導(dǎo)觸覺(jué)的傳感器,而Piezo1在哺乳動(dòng)物各種組織中更是廣泛存在表達(dá),包括骨、膀胱、結(jié)腸、腎、肺和皮膚中都已證實(shí)Piezo1的存在,并發(fā)現(xiàn)其參與多種生物功能調(diào)控[4-12]。然而Piezo1在鼻黏膜組織中的表達(dá)、定位和功能尚無(wú)研究報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)Piezo1在人鼻黏膜及鼻息肉組織中的表達(dá)與定位進(jìn)行分析,為進(jìn)一步研究鼻黏膜組織是否可能通過(guò)Piezo1感知機(jī)械張力變化及具體機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床標(biāo)本選取2021年8月至2022年9月南京鼓樓醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科行鼻內(nèi)手術(shù)的14例患者的下鼻甲、中鼻甲和鼻息肉組織標(biāo)本。該研究已獲得南京鼓樓醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):2022-622-01),患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2主要試劑兔抗人Piezo1抗體(15939-1-AP)購(gòu)自Proteintech,SP試劑盒(SPN-9002)及DAB試劑盒(ZLI-9019)購(gòu)自中山公司,Trizol(R0016)購(gòu)自碧云天公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(K1622)購(gòu)自Thermo Fisher,2*SYBR Green(Q711)購(gòu)自諾唯贊公司。

1.3方法

1.3.1 HE染色將下鼻甲、中鼻甲和鼻息肉組織標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h后,經(jīng)石蠟包埋,連續(xù)切片4 μm厚,并用蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.3.2免疫組化染色根據(jù)SP試劑盒說(shuō)明制備鼻黏膜和鼻息肉切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。將載玻片與Piezo1抗體在4 ℃孵育過(guò)夜。孵育一抗后,將切片與SP標(biāo)準(zhǔn)試劑盒中的二抗在37 ℃孵育30 min。最后,切片用DAB顯色,蘇木精復(fù)染。使用光學(xué)顯微鏡觀察組織。陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)為棕黃色,低倍鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)區(qū)域,在陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野(400×)并使用Image-J圖像分析軟件進(jìn)行分析處理,根據(jù)積分光密度值(IOD)/面積計(jì)算平均光密度值(AOD)以確定染色強(qiáng)度。

1.3.3RT-qPCR實(shí)驗(yàn)取鼻黏膜和鼻息肉組織的RNA使用Trizol進(jìn)行提取,使用超微量分光光度計(jì)(NanoDrop 2000)鑒定RNA 濃度和質(zhì)量后,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用 SYBR Green和QuantStudio3系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR的定量檢測(cè)。Piezo1和內(nèi)參對(duì)照GAPDH的引物序列見(jiàn)表1。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算各組織中Piezo1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

表 1 RT-qPCR引物序列Table 1 The sequences of the primers for RT-qPCR

2 結(jié) 果

2.1 組織病理學(xué)上鼻息肉與鼻黏膜的比較與下鼻甲和中鼻甲組織相比,鼻息肉間質(zhì)呈現(xiàn)高度水腫,結(jié)構(gòu)十分松散。同時(shí),下鼻甲和中鼻甲組織腺體密集,而鼻息肉中腺體的分布顯著減少。此外,鼻息肉的表面上皮結(jié)構(gòu)也明顯不同于下鼻甲和中鼻甲,鼻息肉上皮結(jié)構(gòu)紊亂且纖毛明顯脫落,下鼻甲和中鼻甲上皮結(jié)構(gòu)整齊有序且纖毛完整。見(jiàn)圖1。

2.2Piezo1在鼻息肉、下鼻甲和中鼻甲組織的腺體、纖毛和血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)免疫組化染色結(jié)果顯示,下鼻甲、中鼻甲和鼻息肉均存在Piezo1的陽(yáng)性染色分布,其中固有層腺體、上皮層纖毛細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞為Piezo1陽(yáng)性表達(dá)的主要區(qū)域。并且Piezo1在下鼻甲和中鼻甲中陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)(0.44±0.01、0.43±0.03)較鼻息肉陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)(0.27±0.02)顯著增加(P<0.001)。見(jiàn)圖2。

黃色箭頭示Piezo1在腺體的表達(dá);黑色箭頭示在纖毛的表達(dá);紅色箭頭示在血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)圖 2 Piezo1在鼻息肉、下鼻甲和中鼻甲中的表達(dá)( ×400)Figure 2 Expression of Piezo1 in nasal polyps, inferior turbinate and middle turbinate( ×400)

2.3下鼻甲和中鼻甲的Piezo1表達(dá)水平較鼻息肉顯著增加RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,Piezo1在下鼻甲、中鼻甲的mRNA表達(dá)水平(1.72±0.21、2.17±0.09)較鼻息肉(1.02±0.19)顯著增加(P<0.001)。這與在免疫組化中觀察到的結(jié)果一致。

3 討 論

Piezo1的三聚體螺旋槳狀結(jié)構(gòu)使其敏感性地響應(yīng)局部膜曲率和張力變化,觸發(fā)機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo),激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路,從而導(dǎo)致各種細(xì)胞反應(yīng)[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn),Piezo1在下鼻甲和中鼻甲的固有層腺體、上皮層纖毛細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá),其中腺體中表達(dá)豐富,主要位于粘液腺和漿液腺,提示Piezo1參與維持鼻黏膜正常生理功能。

Piezo1在腺體中豐富表達(dá),提示Piezo1 可能與腺體功能有關(guān)。有研究表明機(jī)械刺激可激活I(lǐng)型肺泡細(xì)胞的Piezo1觸發(fā)ATP釋放和旁分泌刺激II型細(xì)胞分泌表面活性物質(zhì)[15]。在泌尿系統(tǒng)中也有研究表明Piezo1可能通過(guò)影響水通道蛋白2(AQP2)的運(yùn)輸進(jìn)而影響集合管的尿液稀釋和尿素濃度,參與滲透壓調(diào)節(jié)[16]。分布在腺體的Piezo1很可能通過(guò)感受黏膜表面液體的張力變化刺激腺體分泌,同時(shí)可能通過(guò)影響其他離子通道如水通道蛋白等起到調(diào)控液體分泌,水和各種離子重吸收,維持細(xì)胞內(nèi)外液體平衡等作用。

纖毛細(xì)胞中同樣觀察到Piezo1的陽(yáng)性表達(dá),提示Piezo1可能與感受和調(diào)控纖毛運(yùn)動(dòng)有關(guān)系。鼻黏膜的黏液-纖毛系統(tǒng)是上呼吸道重要的防御體系,纖毛規(guī)律擺動(dòng)為鼻黏膜表面的黏液向鼻咽部運(yùn)動(dòng)提供動(dòng)力,纖毛運(yùn)動(dòng)對(duì)維持鼻腔生理功能極為重要。有研究表明ATP可刺激體外培養(yǎng)的人鼻腔纖毛擺動(dòng)頻率升高,NO(一氧化碳)和鈣離子也與鼻黏膜纖毛運(yùn)動(dòng)的調(diào)控密切相關(guān)[17-19]。眾多研究表明當(dāng)機(jī)械力刺激時(shí)激活Piezo1開(kāi)放時(shí),導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化,Ca2+內(nèi)流,激活內(nèi)皮細(xì)胞釋放ATP及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS),參與合成NO、調(diào)節(jié)血管張力及血壓等[20-22]。有研究支持Piezo1與[Ca2+]i/鈣蛋白酶機(jī)制相關(guān),并以此解釋哮喘中末端氣道內(nèi)源性呼吸末正壓(iPEEP)的狀態(tài)[23]。鼻黏膜的Piezo1可能同樣通過(guò)釋放ATP和增加[Ca2+]內(nèi)流直接或間接導(dǎo)致鼻黏膜纖毛擺動(dòng)速度和傳輸速率增加,進(jìn)而增強(qiáng)黏液-纖毛系統(tǒng)的清除功能,參與維持鼻黏膜正常生理功能。

Piezo 1在鼻黏膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)提示Piezo1參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能。有研究證實(shí)Piezo1在小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá),且在胚胎發(fā)育中促進(jìn)血管發(fā)育和重塑[24-25]。也有研究表明Piezo1在肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中響應(yīng)肺泡機(jī)械拉伸作用激活鈣蛋白酶,維持肺泡-毛細(xì)血管屏障的穩(wěn)定,同時(shí)另一項(xiàng)研究也證實(shí)Piezo1在維持肺內(nèi)動(dòng)脈血管張力的作用[26-27]。表達(dá)在鼻黏膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中的Piezo1可能同樣參與重塑小血管和維持血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)等。

免疫組化和RT-qPCR定量結(jié)果證實(shí)Piezo1在鼻息肉中的表達(dá)較下鼻甲和中鼻甲明顯降低。鼻息肉組織病理學(xué)標(biāo)志主要為間質(zhì)水腫和表面上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變,腺體的數(shù)量明顯減少,而Piezo1主要表達(dá)在鼻黏膜的固有層腺體、上皮層纖毛細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中,因此造成Piezo1在鼻息肉、下鼻甲和中鼻甲中的表達(dá)差異可能與鼻息肉組織上皮屏障被破壞及腺體散布減少有關(guān)。

本研究證實(shí)Piezo1在人鼻黏膜及鼻息肉中存在表達(dá),且下鼻甲和中鼻甲表達(dá)較鼻息肉明顯升高,對(duì)鼻腔正常生理功能的維持很可能極為重要。目前關(guān)于Piezo1的研究處于初步階段,對(duì)其發(fā)揮的作用及調(diào)控機(jī)制仍不明確。研究Piezo1在鼻黏膜及鼻息肉中的表達(dá)利于更好了解鼻黏膜生理功能的作用機(jī)制,為鼻部疾病的臨床治療提供新的思路。