范 浩,綦 彬,任國(guó)慶,康文義,毛偉明

0 引 言

甲狀腺癌起源于濾泡上皮細(xì)胞或?yàn)V泡旁C細(xì)胞,其中濾泡細(xì)胞衍生的TC分為4種組織學(xué)類型:乳頭狀甲狀腺癌(papillary thyroid cancer,PTC,占80%～85%)、濾泡狀甲狀腺癌(10%～15%)、低分化甲狀腺癌(<2%)和間變性甲狀腺癌(<2%)[1-3]。PTC是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤,也是少數(shù)幾種發(fā)病率迅速增加的癌癥之一,其通常被認(rèn)為是一種惰性腫瘤。盡管大多數(shù)PTC預(yù)后良好,局部侵襲、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移率低,5年死亡率低于2%,但仍有一小部分患者癌組織表現(xiàn)出異質(zhì)性,發(fā)生更具侵襲性的變異,甚至有超過25%的PTC患者在長(zhǎng)期隨訪期間出現(xiàn)復(fù)發(fā)[4-6]。因此,尋求新的PTC治療策略具有重要意義。

黃酮類化合物是一種廣泛存在于植物界的天然多酚類物質(zhì),由于其具有抗炎和抗腫瘤等多種生物活性而引起廣泛關(guān)注。桑辛素是一種典型的異戊二烯化黃酮類化合物,已被證明對(duì)多種類型腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出抗癌作用[7-8]。已有研究報(bào)道顯示,桑辛素可通過激活MAPK信號(hào)通路對(duì)腎細(xì)胞癌發(fā)揮抗癌活性[7];另有研究報(bào)道稱,桑辛素可通過提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平抑制PI3K/Akt通路誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡[9]。然而,桑辛素對(duì)PTC細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制還有待研究。本研究以PTC細(xì)胞系TPC-1細(xì)胞為研究對(duì)象,探討桑辛素對(duì)TPC-1細(xì)胞凋亡的影響,并進(jìn)一步分析其作用機(jī)制,以期為PTC的臨床治療提供潛在新藥物。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑人乳頭瘤狀甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;RIPA裂解液、MTT試劑、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Hoechst染色試劑盒、ROS檢測(cè)試劑盒、抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔、小鼠IgG二抗購(gòu)自上海碧云天生物科技公司;Bax抗體、Bcl-2抗體、cleaved-caspase-3抗體、p-p38MAPK(Thr180/Thr182)抗體、p38MAPK抗體、p53抗體、MDM2抗體和PUMA抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruze公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于條件為37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3MTT實(shí)驗(yàn)將TPC-1細(xì)胞以3×103個(gè)/每孔接種到96 孔板上,待細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)后,采用不同濃度(0、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L)桑辛素分別處理24 h和48 h,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。提前4 h分別向每孔中加入20 μL MTT,孵育4 h后棄去孔內(nèi)液體,每孔添加150 μL DMSO充分溶解甲臜,通過酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(A值)。計(jì)算細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞抑制率公式如下:

細(xì)胞增殖活性(%)=(A實(shí)驗(yàn)-A空白)/(A對(duì)照-A空白)×100%

細(xì)胞抑制率(%)=100-細(xì)胞增殖活性(%)

1.4細(xì)胞分組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期TPC-1細(xì)胞鋪到6孔板或細(xì)胞培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度(0、5、10、20 μmol/L)桑辛素或20 μmol/L桑辛素聯(lián)合5 mmol/L NAC處理細(xì)胞24 h,并將細(xì)胞分為0 μmol/L桑辛素組、5 μmol/L桑辛素組、10 μmol/L桑辛素組、20 μmol/L桑辛素組和20 μmol/L桑辛素+5 mmol/L NAC組。

1.5Hoechst33258染色取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期TPC-1細(xì)胞,以1.5×104個(gè)/孔接種至內(nèi)置有無菌載玻片的6 孔板中,依照1.4分組處理。棄去培養(yǎng)液,加4%甲醛固定10 min,PBS洗滌2次,加5 μg/mL Hoechst33258染色5 min,PBS洗滌2次,在載玻片上滴加防猝滅劑蓋上蓋玻片后封片,置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)。

1.6Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期TPC-1細(xì)胞,以1.5×104個(gè)/孔接種至6孔板中,依照1.4分組處理。收獲細(xì)胞,用PBS洗滌2次并重懸計(jì)算,取1.5×105個(gè)細(xì)胞,離心半徑20 cm,500×g離心5 min,棄上清,加入195 μL緩沖液重懸浮細(xì)胞,先后加入5 μL Annexin V-FITC和1 μL PI,充分混勻,于室溫避光條件下孵育20 min,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析細(xì)胞凋亡情況。

1.7DCFH-DA染色法檢測(cè)細(xì)胞ROS含量將TPC-1細(xì)胞以1.5×104個(gè)/孔接種到6孔板,依照1.4分組處理。收集細(xì)胞,用含有10 mmol/L DCFH-DA的無血清培養(yǎng)基于37 ℃溫育20 min,棄培養(yǎng)基,用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次,收集細(xì)胞,通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度,其中激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm,再根據(jù)流式細(xì)胞儀所收集的細(xì)胞熒光強(qiáng)度值對(duì)各組細(xì)胞中ROS水平進(jìn)行量化。

1.8Western blot實(shí)驗(yàn)將TPC-1細(xì)胞以1.0×105個(gè)/孔接種到培養(yǎng)皿中,依照1.4分組處理。收集細(xì)胞,離心半徑20 cm,500×g離心5 min,棄培養(yǎng)基,采用RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞,置于冰上超聲破碎,離心半徑12 cm,10 000×g離心15 min。隨后,分離上清液,用分光光度計(jì)進(jìn)行定量。蛋白樣品通過10%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,隨后加入Bax抗體(1∶1000)、Bcl-2抗體(1∶1000)、cleaved-caspase-3抗體(1∶800)、p-p38MAPK(Thr180/Thr182)抗體(1∶1000)、p38MAPK抗體(1∶1000)、MDM2抗體(1∶1000)、p53抗體(1∶1000)、PUMA抗體(1∶1000)和GAPDH抗體(1∶1000),4 ℃輕搖孵育過夜。次日,室溫加二抗(1∶10 000)孵育2 h。滴加顯影液,用成像儀進(jìn)行可視化拍照。以GAPDH為內(nèi)參,通過Image J軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度桑辛素對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖活性的影響MTT檢測(cè)結(jié)果顯示,不同濃度(0、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L)桑辛素處理后,TPC-1細(xì)胞增殖活性逐漸降低,并且隨著藥物干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞增殖活性逐漸降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。不同濃度桑辛素處理TPC-1細(xì)胞24 h和48 h所對(duì)應(yīng)的IC50值分別為24.523 μmol/L和13.135 μmol/L。見圖1。

圖 1 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TPC-1細(xì)胞增殖活性Figure 1 The proliferation activity of TPC-1 cells were detected by MTT assay

2.2不同濃度桑辛素對(duì)TPC-1細(xì)胞凋亡的影響Hoechst33258染色結(jié)果顯示,不同濃度(0、5、10、20 μmol/L)桑辛素干預(yù)24 h后,TPC-1細(xì)胞中細(xì)胞核呈致密濃染的細(xì)胞數(shù)逐漸增多,表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化,而與20 μmol/L桑辛素組比較,20 μmol/L桑辛素+5 mmol/L NAC組細(xì)胞核呈致密濃染的細(xì)胞數(shù)減少。見圖2。Annexin V-FITC/PI法流式結(jié)果顯示,不同濃度桑辛素干預(yù)24 h后,TPC-1細(xì)胞凋亡率逐漸上升(P<0.001)。與20 μmol/L桑辛素組比較,20 μmol/L桑辛素+5 mmol/L NAC組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖3。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,不同濃度桑辛素干預(yù)24 h后,TPC-1細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3表達(dá)水平明顯升高(P<0. 05),而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平明顯降低(P<0. 05);與20 μmol/L桑辛素組比較,20 μmol/L桑辛素+5 mmol/L NAC組TPC-1細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3表達(dá)水平明顯降低(P<0. 05),而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平明顯升高(P<0. 05)。見圖4。

圖 2 不同濃度桑辛素對(duì)TPC-1細(xì)胞凋亡的影響( ×200)Figure 2 Effect of different concentrations of morusin on the nucleus of TPC-1 cells (Hoechst33258 staining ×200)

與0 μmol/L桑辛素組比較,*P<0.05;與20 μmol/L桑辛素組比較,#P<0.05圖 3 各組Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平Figure 3 The apoptosis levels of TPC-1 was detected by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI in each group

與0 μmol/L桑辛素組比較,*P<0.05;與20 μmol/L桑辛素組比較,#P<0.05圖 4 各組Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平Figure 4 The expression levels of apoptosis-related proteins were detected by Western blot in each group

2.3不同濃度桑辛素對(duì)TPC-1細(xì)胞內(nèi)ROS積累的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,不同濃度桑辛素干預(yù)24 h后,TPC-1細(xì)胞中ROS水平逐漸增加(P<0.001)。與20 μmol/L桑辛素組比較,20 μmol/L桑辛素+5 mmol/L NAC組細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯降低(P<0. 05)。見圖5。

與0 μmol/L桑辛素組比較,*P<0.05;與20 μmol/L桑辛素組比較,#P<0.05圖 5 各組流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中ROS水平Figure 5 The ROS levels in cells were detected by flow cytometryin each group

2.4桑辛素對(duì)TPC-1細(xì)胞中p38MAPK信號(hào)通路的影響Western blot結(jié)果顯示,不同濃度桑辛素干預(yù)24 h后,TPC-1細(xì)胞中p-p38MAPK/p38MAPK、p53和PUMA蛋白表達(dá)水平逐漸升高,而MDM2蛋白表達(dá)水平逐漸降低(P<0. 05);與20 μmol/L桑辛素組比較,20 μmol/L桑辛素+5 mmol/L NAC組TPC-1細(xì)胞中p-p38MAPK/p38MAPK、p53和PUMA蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0. 05),而MDM2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0. 05)。見圖6。

1:0 μmol/L桑辛素組; 2:5 μmol/L桑辛素組; 3:10 μmol/L桑辛素組; 4:20 μmol/L桑辛素組; 5:20 μmol/L桑辛素+5 mmol/L NAC組與0 μmol/L桑辛素組比較,*P<0.05;與20 μmol/L桑辛素組比較,#P<0.05圖 6 各組Western blot檢測(cè)TPC-1細(xì)胞中p38MAPK/p53軸相關(guān)蛋白表達(dá)水平Figure 6 The expression of p38MAPK/p53 axis-related proteins in TPC-1 cells were detected by Western blot each group

3 討 論

PTC近年來發(fā)病率迅速上升,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[6]。桑辛素是一種天然存在的異戊二烯化黃酮類化合物,在結(jié)直腸癌和骨肉瘤等多種類型腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出抗癌作用[10-11],然而其對(duì)PTC細(xì)胞的作用還有待研究。本研究旨在考察桑辛素在PTC細(xì)胞系TPC-1細(xì)胞中的抗癌作用,采用不同濃度的桑辛素處理TPC-1細(xì)胞不同時(shí)間,結(jié)果發(fā)現(xiàn)桑辛素可以明顯抑制TPC-1細(xì)胞的增殖活性,并呈濃度和時(shí)間依賴性。不同濃度的桑辛素處理可誘導(dǎo)TPC-1細(xì)胞核出現(xiàn)致密濃染的碎片狀變化,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,明顯上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bax和cleaved-caspase-3表達(dá)水平,而降低Bcl-2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果提示,桑辛素可以抑制TPC-1細(xì)胞的生長(zhǎng),并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。有研究報(bào)道,桑辛素可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,其中在肺癌細(xì)胞中,ROS含量的積累可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡[9,12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,桑辛素可以明顯提高TPC-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平,而桑辛素聯(lián)合ROS清除劑NAC處理TPC-1細(xì)胞可以明顯抑制桑辛素對(duì)ROS的誘導(dǎo)作用,并顯著抑制桑辛素誘導(dǎo)的TPC-1細(xì)胞凋亡。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路在將細(xì)胞外刺激傳遞到細(xì)胞內(nèi)以誘導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用,其影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移,其中p38MAPK是一種應(yīng)激活化蛋白激酶,其被激活可誘導(dǎo)細(xì)胞細(xì)胞凋亡[13-14]。細(xì)胞內(nèi)ROS的積累會(huì)導(dǎo)致DNA的損傷,并間接激活包括p38MAPK在內(nèi)的多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路[15]。已有研究報(bào)道,桑辛素可通過激活MAPK信號(hào)通路抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞增殖[7]。MDM2是p53的典型E3泛素連接酶,也是p53的靶基因之一。p38MAPK誘導(dǎo)p53磷酸化導(dǎo)致其與MDM2分離,從而使得p53逃避泛素-蛋白酶體降解,并且p38MAPK也被認(rèn)為通過未知機(jī)制調(diào)節(jié)MDM2的表達(dá)[14]。有研究報(bào)道,小檗胺通過MDM2-p53通路調(diào)控肺癌細(xì)胞的凋亡[16]。另有研究報(bào)道,125I粒子通過p38MAPK-MDM2-p53信號(hào)通路促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡[17]。本研究結(jié)果顯示,桑辛素可以明顯上調(diào)TPC-1細(xì)胞中p-p38MAPK/p38MAPK、p53和PUMA蛋白表達(dá)水平,同時(shí)明顯降低MDM2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果提示,在TPC-1細(xì)胞中,桑辛素可能通過激活p38MAPK負(fù)調(diào)節(jié)MDM2表達(dá),從而抑制p53蛋白被MDM2泛素化降解,胞內(nèi)積累的p53可進(jìn)一步促進(jìn)下游靶基因PUMA表達(dá),而p53含量的上升又進(jìn)一步負(fù)調(diào)控MDM2表達(dá)。然而,聯(lián)合NAC處理TPC-1細(xì)胞可以明顯抑制桑辛素對(duì)TPC-1細(xì)胞內(nèi)p38MAPK-MDM2-p53信號(hào)通路的活化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,桑辛素可能通過調(diào)控ROS介導(dǎo)的p38MAPK/p53軸促進(jìn)TPC-1細(xì)胞凋亡。

綜上所述,桑辛素可以抑制PTC細(xì)胞系TPC-1細(xì)胞的增殖活性,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與調(diào)控ROS介導(dǎo)的p38MAPK/p53軸有關(guān),這可能為桑辛素用于PTC的治療提供一定理論依據(jù)。本研究未驗(yàn)證抑制p38MAPK后,桑辛素對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖和凋亡的影響,在未來的研究中可以補(bǔ)充相關(guān)實(shí)驗(yàn),以及進(jìn)一步做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平研究。