李 澤,瞿桂文,陳 康,蔣運罡,黃金健,任建安

0 引 言

腸外瘺是指腸道破損與體外相通,導(dǎo)致腸內(nèi)容物漏出。腸外瘺是手術(shù)后常見的并發(fā)癥,會嚴重危及患者生命,顯著增加患者的病死率。腸外瘺包括管狀瘺、腸空氣瘺(enteroatmospheric fistula,EAF)以及唇狀瘺等,其中管狀瘺是最常見的腸外瘺[1]。腸外瘺的原發(fā)疾病主要為惡性腫瘤,常發(fā)生于空回腸[2]。近年來隨著人口老齡化和醫(yī)學(xué)的發(fā)展,腸瘺發(fā)病率呈逐年增加的趨勢。

自20世紀60年代,腸外瘺的治療經(jīng)歷了從早期手術(shù)治療到“引流+擇期手術(shù)”再到“腸腔隔絕技術(shù)和早期確定性手術(shù)”的過程[3-4]。早期盡快恢復(fù)腸道的完整性對于腸外瘺的治療極其重要,其可以減少水電解質(zhì)紊亂,減輕瘺口周圍皮膚損傷,同時,盡早恢復(fù)腸內(nèi)營養(yǎng)、維持腸道穩(wěn)態(tài)[5-6]。對于管狀瘺通常首選醫(yī)用凝膠進行封堵,促進其自愈合;EAF通常通過引流或通過補片臨時保持腸管的完整性后進行確定性手術(shù)[7]。然而,既往報道的腸外瘺動物模型極少關(guān)注管狀瘺的病理生理特征,難以對不同干預(yù)措施進行臨床前研究[8-10]。隨著近年來吻合口瘺、手術(shù)部位感染、炎性腸病以及放射性腸炎導(dǎo)致的管狀瘺患者逐年增加,亟待建立管狀瘺的動物模型。本研究旨在建立兔管狀腸外瘺動物模型,以期為管狀腸外瘺的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料新西蘭大白兔由我院比較醫(yī)學(xué)科提供,許可證號為SCXK(蘇)2019-0005。主要試劑:烏拉坦購自上海麥克林生化科技股份有限公司;5%葡萄糖氯化鈉注射液、10%葡萄糖注射液購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司;4%多聚甲醛固定液購自武漢賽維爾科技有限公司;注射用頭孢哌酮舒巴坦鈉購自揚子江藥業(yè)集團有限公司;亞甲藍注射液購自江蘇濟川藥業(yè)集團有限公司;外科縫線購自中國蘇州醫(yī)療用品有限公司。

1.2動物及分組雄性新西蘭大白兔12只,體重為 (2.5±0.15)kg,自然光照和暗循環(huán),相對濕度(50±5)%,食水自由攝取,動物適應(yīng)環(huán)境1周后開始試驗,實驗過程中喂食標(biāo)準顆粒飼料,術(shù)前禁食30 h,禁飲6 h,禁食時飲水換為5%葡萄糖水。通過隨機數(shù)表法,將新西蘭大白兔分為2組。實驗組8只,對照組4只。研究用實驗動物的使用與操作均由東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動物調(diào)查倫理委員會審核批準(倫理編號:2020JLHGKJDWLS-54)。

1.3造模實驗組:首先應(yīng)用烏拉坦等滲鹽水溶液(20%)進行基礎(chǔ)麻醉,按5 mL/kg經(jīng)耳緣靜脈注射,麻醉后將兔子仰臥位固定于手術(shù)臺上,充分備皮后,消毒3次,在距劍突下6 cm處取腹正中切口,長約5 cm,用電刀經(jīng)白線打開腹膜進入腹腔,標(biāo)記回腸末端距離闌尾伴行處10 cm的近心端腸管,自腹壁外側(cè)經(jīng)腹外斜肌斜行至近切口處造成一長0.8 cm、深0.5 cm的通道,在標(biāo)記腸管的系膜對側(cè)平行于腸管長軸切開腸管,長約0.5 cm,并將裁剪后的18號T管留置于腸腔內(nèi),用3-0可吸收線將腸管邊緣與T管充分固定后,將T管自腹壁的斜形切口取出,拉緊后在腹壁外側(cè)用絲線固定,用紗布封堵T管,防止腸液丟失。檢查腹腔內(nèi)無出血或異物,清點紗布數(shù)量后,用4-0可吸收線連續(xù)縫合肌層,用4-0絲線間斷縫合皮膚,邊距1.5～2.5 mm,針距3.5～5 mm關(guān)閉腹腔、消毒并放置造口袋保護創(chuàng)面。對照組:麻醉后行開腹探查手術(shù)。

1.4圍手術(shù)期管理依據(jù)鄭驚雷等[11]的研究,各組術(shù)中靜脈注射6 mL 0.3 g頭孢哌酮舒巴坦鈉溶液,術(shù)后給予100 mL 5%葡萄糖氯化鈉溶液緩慢靜脈滴注,禁食不禁飲,術(shù)后前3 d飲水器內(nèi)補充含0.5 g頭孢哌酮舒巴坦鈉的10%葡萄糖溶液,第4天給予正常飲食,第14天拔除T管。

1.5評價指標(biāo)及方法①實驗動物存活率:通過動物模型建立期間各組動物的存活及死亡的數(shù)量,計算存活率。②手術(shù)時間:記錄每只動物從開腹到關(guān)腹的時間。③術(shù)后3 d飲水量:每天按時記錄飲水瓶中剩余量與添加量,估算24 h的飲水量。④竇道形成評估:術(shù)后第14天飲水中加入亞甲藍(1 mL/100 mL),拔除T管后,觀察瘺口排泄物顏色變化。⑤血清指標(biāo)檢測:術(shù)后第14天麻醉后經(jīng)心臟取血10 mL,1000×g離心5 min后取上清液,通過全自動生化儀(邁瑞B(yǎng)S-240)檢測血清總蛋白(total protein,TP),血清白蛋白(albumin,ALB)和血糖(blood glucose,Glu)。⑥形態(tài)學(xué)變化:動物取血后行剖腹探查術(shù),按我們之前報道的方法,選擇腹部“U”型切口進腹,避開原手術(shù)切口,觀察腹腔粘連情況以及瘺口周圍腸管變化情況[12]。⑦瘺口形態(tài)及組織學(xué)變化:取瘺口處全層皮膚及腸管置于甲醛固定液中24 h,采用石蠟包埋后切片4 cm ,進行蘇木精-伊紅(HE)染色和Masson三色染色。觀察各組標(biāo)本中成纖維細胞、新生毛細血管以及炎性細胞浸潤情況。

2 結(jié) 果

2.1 實驗動物存活率對照組動物在造模過程中未出現(xiàn)死亡,實驗組死亡1只,于手術(shù)后第2天死亡,該組存活率為87.5%,死亡動物解剖發(fā)現(xiàn)腹腔有腸內(nèi)容物,考慮死亡原因為腸內(nèi)容物漏出導(dǎo)致的腹腔感染。

2.2手術(shù)時間實驗組的手術(shù)時間為(36.9±3.8)min,對照組相應(yīng)控制關(guān)腹時間為37 min。

2.3術(shù)后液體情況對照組術(shù)后3 d的飲水量比實驗組更多,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。拔管后24 h飲水量較造模術(shù)后增多(P<0.05)。見表1。

表 1 實驗兔術(shù)后指標(biāo)比較Table 1 Postoperative indicators of the two groups

2.4竇道形成評估拔除T管后可見腹壁瘺口有藍色物質(zhì)排除,證明腹壁瘺口與消化道相通。

2.5血清指標(biāo)實驗組和對照組在術(shù)后14 d的血清總蛋白、血清白蛋白、血糖差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.6形態(tài)學(xué)變化對照組1只動物的腸管與切口

處的腹壁輕微粘連,4只動物的腸管均無明顯水腫及缺血。實驗組見瘺口周圍的腸管與腹壁緊密相連。周圍腸管間輕度粘連,腸管輕度水腫,無明顯血凝塊及腸內(nèi)容物。見圖1。

a:內(nèi)側(cè)面(腸管側(cè)); b:外側(cè)面(皮膚側(cè))圖 1 管狀腸外瘺局部離體組織內(nèi)外側(cè)面的大體外觀Figure 1 Gross appearance of the local isolated tissue inside and outside of the tubular intestinal fistula

2.7瘺口形態(tài)及組織學(xué)變化在HE染色的切片中可見明顯的竇道結(jié)構(gòu),竇道內(nèi)有壞死組織,管狀瘺內(nèi)口的腸管與腹壁緊密相連,竇道周圍組織中存在成纖維細胞和毛細血管增生以及明顯的炎癥反應(yīng),見圖2a。Masson染色可見竇道兩側(cè)腸管漿膜與腹膜之間有明顯的粘連組織,膠原纖維排列紊亂。提示:管狀瘺形成,瘺口周圍的腸管與腹壁組織已形成穩(wěn)定的纖維粘連,見圖2b。

a:黑色虛線表示兩側(cè)竇道邊界,紅色實線框內(nèi)為腸管與腹壁的粘連部位,紅色虛線框內(nèi)為竇道旁皮膚;b:黃色框內(nèi)為竇道兩側(cè)腸管與腹壁的粘連部位,白色五角星為腸管漿膜與腹膜之間的粘連組織圖 2 管狀腸外瘺瘺口組織的HE染色和Masson染色Figure 2 HE staining and Masson staining of fistula tissue in tubular intestinal fistula

3 討 論

管狀腸外瘺是最常見的腸外瘺,約占2/3,外科手術(shù)是最主要的直接致瘺原因,而這些患者接受手術(shù)治療的原因多為腫瘤或者創(chuàng)傷[2]。這些患者通常需要進一步放化療或康復(fù)治療,一旦發(fā)生腸瘺患者往往要經(jīng)過漫長的引流、控制感染、營養(yǎng)支持、多學(xué)科密集的護理甚至是外科手術(shù)治療,這將會顯著影響患者原發(fā)疾病的治療進程。腸外瘺常好發(fā)于小腸,亦難以通過轉(zhuǎn)流手術(shù)建立腸內(nèi)營養(yǎng)。針對管狀腸外瘺,臨床上常通過纖維蛋白膠和富血小板血漿等醫(yī)用凝膠進行封堵以恢復(fù)腸道的連續(xù)性,但受限于其自身機械強度、抗消化性能以及制備成本,患者往往需要進行多次封堵,給患者帶來巨大的精神壓力和經(jīng)濟負擔(dān)。由于目前缺乏管狀腸外瘺的動物模型,許多生物化學(xué)膠水無法直接應(yīng)用于管狀腸外瘺患者。因此,管狀腸外瘺動物模型制備對研究管狀腸外瘺病理機制與治療極為重要。

在既往的研究中通常通過小腸或結(jié)腸造口的方法來模擬腸外瘺,但這種急性手術(shù)的方法難以模擬管狀瘺逐漸發(fā)生的病理過程[10,13]。陳懷仁等[9]曾通過部分切開犬的回腸并將其置于腹壁來模擬“感染型”腸瘺,但這種方法的動物死亡率高,疾病發(fā)生過程隨機性大,無法建立穩(wěn)定的竇道,難以模擬管狀腸外瘺的病理生理特征。本研究的造模方法可以使腸管與腹壁形成穩(wěn)定、緊密連接的竇道,能夠很好的模擬管狀瘺的病理生理過程,同時具有較高的動物存活率,此外,還能通過調(diào)整不同T管的型號以制備不同竇道直徑的動物模型。

本研究通過在兔的回腸處留置T管成功構(gòu)建了兔管狀腸外瘺動物模型,平均手術(shù)時間為37 min,實驗組動物模型的存活率為87.5%,與對照組相比,實驗組術(shù)后飲水量及營養(yǎng)指標(biāo)無明顯差異,拔管后24 h平均腸液漏出量為191.67 mL,與持續(xù)麻醉回腸末端雙腔造口后腸液漏出量一致[14]。死亡動物解剖發(fā)現(xiàn)腹腔有部分腸內(nèi)容物,考慮其在放置T管時腸管損傷較嚴重,致使縫合張力較大,導(dǎo)致術(shù)后腸管縫線處撕裂,最終死于嚴重腹腔感染,這提示我們在留置T管時要避免損傷腸管,手術(shù)操作要穩(wěn)定輕柔,同時,可以選擇12號的T管,降低放置難度,此外,在模型建立過程中需注意縫合前用等滲鹽水潤濕縫線,縫合打結(jié)時亦要注意力度。在建模過程中除了要注意手術(shù)技巧外,還需要注意圍手術(shù)期的管理[15]。由于兔子的腸道較長、造模手術(shù)屬于污染手術(shù)且術(shù)后需要動物至少存活2周,在術(shù)前需要充分的禁食和禁飲,術(shù)中、術(shù)后給予抗生素,術(shù)后前3天僅喂食糖水,逐步增加喂食量。

本研究結(jié)果表明,通過規(guī)范的手術(shù)操作及嚴格的圍手術(shù)期管理,將T管留置于兔的回腸可以較好的模擬管狀腸外瘺的病理特征,本模型制備的可控性強,能做到統(tǒng)一化建模,使腹壁瘺口與消化道形成穩(wěn)定的竇道,同時,具有較低的動物死亡率,可以為管狀腸外瘺的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。