孫 鑫, 王獻(xiàn)麗, 馬曉吉, 鄧芳芳, 潘成學(xué),

(1.鄭州大學(xué) 藥學(xué)院,河南 鄭州 450001; 2.河南鄭大杰諾醫(yī)藥技術(shù)有限公司,河南 鄭州 450001)

黃芩為中國傳統(tǒng)大宗藥材,主要用于上呼吸道感染等疾病。以“三方三藥”為代表的中醫(yī)藥在控制新冠疫情中發(fā)揮了巨大作用,而黃芩就是主要藥味之一[1-2],市場對于黃芩和黃芩提取物需求較大。黃芩苷是黃芩及其制劑的主要質(zhì)量控制指標(biāo)成分[3],《中國藥典》2020年版一部黃芩提取物項下規(guī)定黃芩苷純度不低于85%[4]。黃芩苷的分子結(jié)構(gòu)如下:

現(xiàn)有文獻(xiàn)對黃芩苷的純化工藝考察還僅限于實驗室研究,對工業(yè)化生產(chǎn)鮮有報道。因此目前黃芩提取物生產(chǎn)企業(yè)依然采用藥典純化方法對黃芩苷進(jìn)行精制。該純化工藝為將提取液加鹽酸調(diào)pH值至1.0～2.0,在80 ℃保溫,靜置,濾過。沉淀物加適量水?dāng)嚢?用40%氫氧化鈉調(diào)pH值至7.0,加等量乙醇,攪拌使溶解,濾過,濾液再加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1.0～2.0,60 ℃保溫,靜置,濾過,沉淀依次用適量水及不同濃度的乙醇洗至pH至中性,揮盡乙醇,減壓干燥,即得[4]。該純化過程反復(fù)堿溶酸沉,并采用乙醇除雜,造成有效成分損失較大,且操作煩瑣、生產(chǎn)周期長。本實驗結(jié)合工業(yè)化生產(chǎn)實際,以黃芩苷得率和黃芩苷純度為響應(yīng)值,對酸沉法、堿溶酸沉法、重結(jié)晶法和藥典純化方法進(jìn)行實驗對比,確定黃芩苷的最佳純化方法;然后采用篩選試驗(Plackett-Burman,PB)[5-7]和Box-Behnken響應(yīng)面試驗[8-10],對整個工藝條件進(jìn)行考察,同時基于QbD理念[11-12]構(gòu)建操作空間,為工業(yè)化生產(chǎn)黃芩提取物提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

賽默飛UltiMate3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司);DZKW-4電熱恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);THD-1008W低溫恒溫槽(寧波天恒儀器廠);101-1AB電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津賽得利斯實驗分析儀器制造廠)。

1.2 試藥

黃芩苷對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:110715-202122);黃芩藥材(購自中國禹州藥材市場);用于液相分析的甲醇為色譜級;其余試劑為分析純。

2 方法

2.1 黃芩水提液的制備

取黃芩粗粉500 g,加入沸水5 L,于90 ℃浸泡1 h,超聲提取20 min,濾過,再次加入沸水5 L,超聲提取20 min,濾過,合并提取液,備用。

2.2 純化方法比較

取黃芩水提液200 mL,依次采用酸沉法[13]、堿溶酸沉法[14]、重結(jié)晶法[15]和藥典純化方法[4]對黃芩苷進(jìn)行精制,將得到的粗品于60 ℃干燥,稱重,測定黃芩苷含量,計算黃芩苷得率。

2.3 堿溶酸沉法工藝操作

根據(jù)實驗設(shè)計表中的運行序開展實驗,將待純化樣品溶液濃縮成所需特定藥液濃度的水提液,每份樣品取200 mL,在設(shè)計的溫度下加入要求濃度的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至設(shè)計參數(shù)后,保溫相應(yīng)時間,過濾,濾液加熱至設(shè)計要求溫度,加入要求濃度鹽酸溶液,pH調(diào)至要求水平,保溫相應(yīng)時間,保溫結(jié)束后取出樣品并置于低溫恒溫槽中靜置相應(yīng)時間,濾過,沉淀用蒸餾水洗至中性,抽濾,60 ℃真空干燥得黃芩苷粗品,稱重,測定黃芩苷含量,計算黃芩苷得率。

2.4 黃芩苷含量的測定

2.4.1 色譜條件

色譜柱為Hypersil25005-254630(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2);檢測波長為280 nm;流速為1 mL·min-1;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

2.4.2 對照品溶液的制備

精密稱取黃芩苷對照品適量,加甲醇制成每1 mL含106.982 4 μg黃芩苷的對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備

黃芩水提液:精密量取提取液2 mL,置于100 mL容量瓶中,加適量70%乙醇,超聲使之溶解,放至室溫,加70%乙醇至刻度,搖勻。精密量取5 mL,置25 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

黃芩提取物:取本品10 mg,精密稱定,置25 mL量瓶中,加甲醇適量使溶解,再加甲醇至刻度,搖勻。精密量取5 mL,置25 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.4.4 線性關(guān)系考察

將對照品溶液稀釋至6個不同濃度,按2.4.1節(jié)色譜條件進(jìn)行分析。以峰面積為縱坐標(biāo),對照品的進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo),得到回歸方程,可知黃芩苷在3.343 2～106.982 4 μg·mL-1內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4.5 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率試驗

精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及回收率試驗按《中國藥典》2020年版四部[16]要求進(jìn)行考察,結(jié)果均符合要求,說明該方法具有良好的系統(tǒng)適用性。

2.5 黃芩苷得率計算

黃芩苷得率計算公式如下:

(1)

2.6 Plackett-Burman(PB)試驗設(shè)計

以黃芩苷得率(Y1)和黃芩苷純度(Y2)為指標(biāo),使用Design-Expert 10.0.4軟件對堿溶酸沉法中涉及的11個工藝參數(shù)進(jìn)行PB試驗設(shè)計,篩選出對黃芩苷得率和黃芩苷純度影響顯著的主要因素,因素及水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計因素及水平Table 1 Factors and levels for Plackett-Burman test design

2.7 Box-Behnken(BB)響應(yīng)面試驗設(shè)計

將PB試驗篩選得到的藥液質(zhì)量濃度(A)、堿溶溫度(B)、堿溶pH(D)、酸沉溫度(F)和酸沉pH(H)5個關(guān)鍵參數(shù)使用Design-Expert 10.0.4軟件進(jìn)行5因素3水平的響應(yīng)面試驗設(shè)計,3個因素各設(shè)高、中、低3個水平,分別用1、0、-1表示,因素及水平見表2。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計因素及水平Table 2 Factors and levels for Box-Behnken response surface design

3 結(jié)果與分析

3.1 對照品和供試品色譜圖

對照品溶液和供試品溶液分別按照2.4.2節(jié)和2.4.3節(jié)方法進(jìn)行制備,均通過2.4.1節(jié)色譜條件進(jìn)行分析,各色譜圖見圖1。

圖1 對照品與供試品HPLC圖Figure 1 HPLC of control and test sample

3.2 黃芩苷不同純化方法的實驗結(jié)果

黃芩苷不同純化方法的實驗結(jié)果如表3所示,由實驗結(jié)果可以看出,當(dāng)采用堿溶酸沉法對黃芩苷進(jìn)行精制時,黃芩苷得率和黃芩苷純度均較其他3種純化方法高,因此選取堿溶酸沉法更進(jìn)一步地研究。

表3 黃芩苷純化方法的比較Table 3 Comparison of purification methods of baicalin

3.3 Plackett-Burman(PB) 試驗結(jié)果

通過PB試驗設(shè)計對影響因素進(jìn)行顯著性分析,試驗設(shè)計及結(jié)果見表4,試驗結(jié)果效應(yīng)分析見表5,各模型的P值均小于0.01,可知該模型具有極顯著影響,表明模型具有統(tǒng)計學(xué)意義。從各個因素的P值可以看出藥液質(zhì)量濃度、堿溶溫度和酸沉pH對黃芩苷得率有極顯著影響;藥液質(zhì)量濃度、堿溶溫度、堿溶pH、酸沉溫度和酸沉pH對黃芩苷純度有極顯著影響。因此選取藥液質(zhì)量濃度(A)、堿溶溫度(B)、堿溶pH(D)、酸沉溫度(F)和酸沉pH(H)5個因素進(jìn)一步優(yōu)化處理。考慮到生產(chǎn)成本,在后續(xù)實驗中將剩余工藝參數(shù)固定為40%的氫氧化鈉溶液、堿溶保溫時間40 min、濃鹽酸、酸沉保溫時間40 min、5～30 ℃狀態(tài)下靜置12 h。

表4 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Experimental design and results of Plackett-Burman design

表5 Plackett-Burman試驗設(shè)計分析Table 5 Plackett-Burman test design analysis

3.4 響應(yīng)面試驗結(jié)果

3.4.1 Box-Behnken試驗設(shè)計結(jié)果及方差分析

應(yīng)用Design-Expert 10.0.4對表6的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合并進(jìn)行方差分析,由表7可知兩個模型P值均小于0.000 1,說明以黃芩苷得率和黃芩苷純度為評價指標(biāo)的回歸模型具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。失擬項P值分別為0.215 0和0.326 7,兩方程的R2分別為0.960 2和0.958 4,說明各模型擬合度較好且有良好的預(yù)測性。對于黃芩苷得率,A(藥液質(zhì)量濃度)、H(酸沉pH)對模型具有極顯著影響,B(堿溶溫度)具有顯著影響,各因素的影響程度從大到小為H(酸沉pH)、A(藥液質(zhì)量濃度)、B(堿溶溫度)、D(堿溶pH)、F(酸沉溫度);對于黃芩苷純度,H(酸沉pH)對模型影響極顯著,D(堿溶pH)具有顯著影響,各因素的影響程度從大到小為H(酸沉pH)、D(堿溶pH)、B(堿溶溫度)、F(酸沉溫度)、A(藥液質(zhì)量濃度);其余項不顯著?？梢钥闯?藥液質(zhì)量濃度、堿溶溫度、堿溶pH和酸沉pH是堿溶酸沉工藝中的關(guān)鍵參數(shù)。

表6 部分Box-Behnken設(shè)計及結(jié)果Table 6 Partial Box-Behnken design and results

表7 二項模型的方差分析Table 7 Analysis of variance of quadratic model

3.4.2 響應(yīng)面分析

采用Design-Expert 10.0.4軟件對黃芩苷得率(Y1)和黃芩苷純度(Y2)進(jìn)行響應(yīng)面分析,從圖2和圖3可以看出,酸沉pH對黃芩苷得率和黃芩苷純度的影響都較其他因素大:隨著酸沉pH的降低,黃芩苷得率逐漸升高,而黃芩苷純度逐漸下降。因此在純化過程中對于酸沉pH的調(diào)節(jié)極為重要,只有酸沉pH在合適的范圍內(nèi),才能保證響應(yīng)值達(dá)到最優(yōu)。

圖2 各因素交互作用對黃芩苷得率的響應(yīng)面圖Figure 2 Response surface of the effect of interaction terms on the yield of baicalin

圖3 各因素交互作用對黃芩苷純度的響應(yīng)面圖Figure 3 Response surface of the effect of interaction terms on the purity of baicalin

3.4.3 設(shè)計空間及驗證

為便于實際生產(chǎn)中的操作,選擇對響應(yīng)值影響較大的關(guān)鍵工藝參數(shù)藥液質(zhì)量濃度和酸沉pH,通過 Design Expert 10.0.4軟件建立了設(shè)計空間,結(jié)合生產(chǎn)企業(yè)實際生產(chǎn)需求,使響應(yīng)值Y1>85%,Y2>85%。但由于模型的預(yù)測值與真實值會存在一定偏差,所以設(shè)計空間的邊界具有不確定性。為了應(yīng)對設(shè)計空間邊界的不確定性,在定義設(shè)計空間時可加入置信水平α=0.05的置信區(qū)間,將設(shè)計空間優(yōu)化,最終確定設(shè)計空間:堿溶溫度為40 ℃、堿溶pH為8.0、酸沉溫度為80 ℃、藥液質(zhì)量濃度為11.53～14 mg·mL-1、酸沉pH為1.17～2.33,結(jié)果用Overlay Plot展示,如圖4所示,在黃色區(qū)域內(nèi)任選一點進(jìn)行操作,響應(yīng)值均能達(dá)到85%以上。

圖4 設(shè)計空間圖Figure 4 Design space map

為驗證設(shè)計空間的準(zhǔn)確性,在設(shè)計空間內(nèi)、外任取3個點進(jìn)行驗證,每個試驗平行做3份,具體驗證點試驗條件和結(jié)果見表8。由驗證結(jié)果得到的實際值和預(yù)測值接近,表明該模型具有良好的預(yù)測性。當(dāng)工藝參數(shù)未在設(shè)計空間內(nèi)時,不能達(dá)到目標(biāo)要求;而當(dāng)工藝參數(shù)落在設(shè)計空間內(nèi)時,能夠很好地達(dá)到預(yù)期目標(biāo),說明設(shè)計空間穩(wěn)定可靠,對指導(dǎo)黃芩苷的實際生產(chǎn)具有重大參考意義,同時也符合質(zhì)量源于設(shè)計(QbD)理念。

表8 設(shè)計空間驗證試驗結(jié)果Table 8 Design space validation test results

4 結(jié)論

以黃芩苷得率和純度為考察指標(biāo),進(jìn)行黃芩苷的純化工藝研究,通過對酸沉法、堿溶酸沉法、重結(jié)晶法和藥典純化方法進(jìn)行對比實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用堿溶酸沉法進(jìn)行黃芩苷純化時,其得率和純度均比較高,因此采用PB試驗和響應(yīng)面試驗對堿溶酸沉法中涉及的工藝參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)研究。結(jié)果得到工業(yè)化生產(chǎn)推薦的操作空間:藥液質(zhì)量濃度為11.53～14.00 mg·mL-1、堿溶溫度為40 ℃、堿溶pH為8.0、酸沉溫度為80 ℃、酸沉pH為1.17～2.33。在設(shè)計空間內(nèi)操作,能夠滿足關(guān)鍵工藝指標(biāo)黃芩苷得率和純度均在85%以上。實驗結(jié)果說明采用一次堿溶酸沉法對黃芩苷進(jìn)行純化,不僅能得到較高的黃芩苷得率和黃芩苷純度,且能夠縮短生產(chǎn)周期、降低生產(chǎn)成本,適合于工業(yè)化生產(chǎn),具有較好的實用價值。