趙喜強,逯文華,尚利強,黨瑞杰,安 然,何 鑫

據(jù)不完全統(tǒng)計,全球范圍內(nèi)糖尿病患者約為5.37億,預(yù)計到2030年將達到6.43億[1]。糖尿病狀態(tài)下由于炎癥因子、高血糖等因素的影響,常導(dǎo)致骨代謝紊亂,嚴重影響缺牙患者的口腔種植修復(fù)[2]。在糖尿病的高糖環(huán)境下,骨髓間充質(zhì)干細胞(bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的干性和成骨功能會受到抑制,引起口腔種植體周圍骨的重塑障礙[3]。因此,尋找一種能夠改善高糖抑制BMSCs成骨能力的藥物是目前亟待解決的問題。

髓源性生長因子(myeloid-derived growth factor,MYDGF)來源于單核巨噬細胞,在心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥、糖尿病等多種疾病模型中表現(xiàn)出良好的治療效果[4-7]。Wang等[6]發(fā)現(xiàn),MYDGF能夠通過促進胰高血糖素樣肽1的分泌來維持糖尿病小鼠的血糖穩(wěn)態(tài)。劉翠等[8]體外研究發(fā)現(xiàn),正常糖狀態(tài)下MYDGF能夠增強糖尿病小鼠 BMSCs的成骨分化能力。以上預(yù)示著MYDGF可能是糖尿病骨代謝事件的保護因子。然而,MYDGF在高糖環(huán)境中對BMSCs成骨分化的作用及具體機制尚不清楚。本實驗初步探討MYDGF對高糖環(huán)境中BMSCs成骨分化的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 24 h內(nèi)SD大鼠乳鼠(SPF級,北京斯貝福公司)10只;重組 MYDGF蛋白(百奧萊博,中國);α-MEM培養(yǎng)液、裂解液(賽維爾,中國);胎牛血清(Gibco,美國);成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(賽業(yè),中國);堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)檢測試劑盒(碧云天,中國);Trizol、PVDF膜、ECL發(fā)光液(普利萊,中國);兔單抗 β-actin、鼠單抗 β-catenin(Proteintech,美國);兔多抗 p-GSK3β(Abcam,美國);CD11b-FITC、CD29-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC抗體(BD Biosciences,美國);引物序列(上海生工,中國)。細胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺(博科,中國);恒溫水浴鍋(瑪瑞特,中國); 低速離心機(中科中佳,中國);電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(六一,中國)。

1.2 BMSC分離、培養(yǎng) 超凈工作臺中分離SD乳鼠雙側(cè)股骨,剪開骨髓腔后通過α-MEM 培養(yǎng)液稀釋骨髓,骨髓液離心(1000 r/min,5 min)后棄上層脂肪組織及上清。重懸管底細胞沉淀,接種到細胞培養(yǎng)瓶中,細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長匯合至80%時,傳代并繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 BMSCs鑒定 取P3代BMSCs并將其密度調(diào)整為1×106個/ml,按照1 ml/管的方法分裝至EP管。向EP管中加入5 μl的熒光標記抗體或PBS,抗體包括CD11b、CD29、CD45、CD90。4 ℃條件下孵育40 min,離心后重懸BMSCs,上機檢測BMSCs表面標記物。

1.4 ALP活性檢測 細胞分組:(1)NG組 (BMSCs培養(yǎng)于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液);(2)HG組(成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中加入44 mmol/L葡萄糖)[9];(3)MYDGF組(在HG組基礎(chǔ)上加入100 ng/ml MYGDF)[8],每組設(shè)3復(fù)孔。各組細胞成骨誘導(dǎo)7 d后,裂解提取上清。根據(jù)ALP檢測試劑盒說明書方法分別加入檢測緩沖液、標準品和細胞裂解液。37 ℃條件下孵育10 min后加入終止液,酶標儀測定吸光度OD值(波長405 nm)。

1.5 RT-qPCR檢測成骨相關(guān)基因 細胞分組同上。通過RT-qPCR檢測各組細胞的成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(osterix,OSX)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(runt-related transcription factor 2,RUNX2)及Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ,COL-Ⅰ)mRNA表達情況。各組細胞成骨誘導(dǎo)7 d后,提取細胞總RNA并測定RNA 純度,隨后逆轉(zhuǎn)錄RNA合成cDNA,按照 95 ℃反應(yīng)10 min(預(yù)變性),95 ℃反應(yīng)15 s、60 ℃ 反應(yīng)1 min的順序進行40個循環(huán)的PCR擴增。數(shù)據(jù)處理時以NG組為參照。

1.6 Wnt/β-catenin信號通路檢測 細胞分組如下:NG組,HG組,MYDGF組,MYDGF+Dkk1組(在MYDGF組基礎(chǔ)上加入10 μg/ml 通路抑制劑Dkk1)[10],每組設(shè)3復(fù)孔。各組細胞成骨誘導(dǎo)7 d后,提取細胞總蛋白,將蛋白變性后加樣,電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜,室溫下封閉1 h,將膜浸入一抗孵育,4 ℃過夜后再將膜浸入二抗封閉,最后于膜上滴加ECL發(fā)光液顯影,曝光。使用 Image-J定量分析曝光后的條帶。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs的分離培養(yǎng)和鑒定 貼壁法提取BMSCs,BMSCs形態(tài)多呈梭形及紡錘形,旋渦狀生長。BMSCs高表達間充質(zhì)干細胞表面抗原為CD29(91.6%)、CD90(94.2%),低表達造血干細胞表面抗原為CD11b(0.75%)、CD45(1.55%)。

2.2 MYDGF促進高糖環(huán)境中BMSCs的ALP活性 各組細胞成骨誘導(dǎo)7 d后,與NG組相比,HG組ALP活性顯著降低[(0.169±0.018)vs.(0.078±0.012);P<0.05];與HG組相比,MYDGF組ALP活性顯著升高[(0.141±0. 019)vs.(0.078±0.012);P<0.05],而NG組和MYDGF組的ALP活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義[(0.169±0.018)vs.(0.141±0.019)]。

2.3 MYDGF促進高糖環(huán)境中BMSCs的成骨相關(guān)基因表達 細胞成骨誘導(dǎo)7 d后,與NG組相比,HG組OSX、RUNX2、COL-I的mRNA水平均明顯降低(P<0.05);與HG組相比, MYDGF組OSX、RUNX2、COL-I的mRNA水平均顯著升高(P<0.05,表1)。

表1 不同處理組BMSCs成骨相關(guān)基因表達水平

2.4 MYDGF激活Wnt/β-catenin信號通路 各組細胞成骨誘導(dǎo)7 d后,Western blot結(jié)果如圖3和表 2所示:與NG組相比,HG組p-GSK3β和 β-catenin 蛋白水平顯著降低(P<0.05);與HG組相比,MYDGF組的p-GSK3β和β-catenin蛋白水平明顯上升(P<0.05);在加入Dkk1后,MYDGF促進p-GSK3β和β-catenin蛋白表達的作用受到抑制(P<0.05,表2)。

表2 不同處理組BMSCs的p-GSK3β和β-catenin蛋白表達水平

3 討 論

種植修復(fù)已成為缺牙患者恢復(fù)正常牙列的重要選擇,高血糖會影響種植體周圍的骨愈合及種植體的穩(wěn)定性,還會在種植體骨結(jié)合過程中損害骨質(zhì)量,增加種植體周圍炎的發(fā)生風(fēng)險,最終可能導(dǎo)致口腔種植的失敗[11,12]。

越來越多的研究表明,骨骼除具有結(jié)構(gòu)作用和造血功能外,還可以作為內(nèi)分泌器官調(diào)節(jié)機體的糖代謝[6,13,14]。MYDGF 是一種骨髓來源的細胞因子,能有效維持機體的糖穩(wěn)態(tài),有望成為糖尿病治療的新藥物[6]。研究表明,MYDGF能夠緩解高糖誘導(dǎo)的H9C2細胞的損傷,對心臟功能具有保護作用[15],能增強糖尿病小鼠 BMSCs的成骨功能[8],但MYDGF對于高糖誘導(dǎo)的BMSCs細胞的影響未見報道。因此本實驗通過高糖誘導(dǎo)BMSCs,探討MYDGF對高糖環(huán)境中BMSCs成骨分化的影響。

BMSCs是存在于骨髓組織的多能成體干細胞,在骨代謝過程中發(fā)揮重要作用[16]。當(dāng)骨組織受到損傷后,機體分泌的細胞因子會聚集到BMSCs周圍,刺激其增殖和分化為成骨細胞,從而促進骨組織的愈合和修復(fù)[17]。與健康人的BMSCs相比,糖尿病患者的BMSCs的成骨分化能力明顯降低[18]。因此,提高BMSCs的骨向分化能力是促進糖尿病患者種植體骨整合的關(guān)鍵要素。研究表明,MYDGF能夠通過抑制破骨細胞的形成和促進成骨細胞的分化來保護骨量[7]。本實驗的研究結(jié)果同樣表明,MYDGF能夠促進高糖環(huán)境中BMSCs的成骨分化。

本實驗證實了MYDGF能夠顯著升高高糖環(huán)境中BMSCs的ALP活性。作為早期成骨標志物,ALP活性的增高說明BMSCs正在向成骨細胞分化[19]。OSX是成骨細胞特異性表達的轉(zhuǎn)錄因子,RUNX2是早期成骨標志物;而COL-I參與調(diào)控成骨過程中細胞外基質(zhì)的分泌和礦化,是OSX和RUNX2成骨過程中的下游調(diào)控靶點[20, 21]。因此,本實驗選擇OSX、RUNX2和COL-I作為BMSCs的靶基因,來驗證各組BMSCs的成骨分化水平。本實驗RT-qPCR結(jié)果表明,高糖環(huán)境能夠下調(diào)BMSCs 的成骨相關(guān)基因(OSX、 RUNX2和COL-I)的表達,而加入MYDGF后,OSX、 RUNX2和COL-I的mRNA表達水平均出現(xiàn)上調(diào),說明MYDGF能夠彌補高糖環(huán)境對BMSCs成骨分化的負面影響。

Wnt/β-catenin信號通路是參與骨形成的重要調(diào)控通路[22]。GSK3β是經(jīng)典Wnt通路上游的負性因子,GSK3β磷酸化水平在Wnt 通路被激活時升高,從而抑制 β-catenin 的降解,導(dǎo)致β-catenin在胞質(zhì)中堆積,隨后積聚入核后調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[23]。對于糖尿病機體而言,局部組織細胞處于高糖環(huán)境下,Wnt/β-catenin信號通路在其中仍有重要作用。Zhang等[24]研究發(fā)現(xiàn),高糖環(huán)境能夠抑制β-catenin,從而影響干細胞的增殖、遷移等能力。此外,Deng等[25]研究表明,Exendin-4抑制糖尿病小鼠骨丟失的能力與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。本實驗結(jié)果表明,高糖環(huán)境下p- GSK3β和β-catenin的蛋白表達水平降低,而MYDGF顯著增加了高糖環(huán)境中p-GSK3β和β-catenin的蛋白水平;在添加通路抑制劑Dkk1后,MYDGF促進p-GSK3β和β-catenin的蛋白表達能力下降,表明Wnt/β-catenin信號通路受到抑制。進一步證實MYDGF促進高糖環(huán)境中BMSCs的成骨分化作用可能與Wnt/β-catenin信號通路的激活有關(guān)。

綜上所述,本實驗發(fā)現(xiàn)MYDGF在體外能夠促進高糖環(huán)境中BMSCs的成骨分化,且這一效應(yīng)可能與Wnt/β-catenin信號通路的激活有關(guān),但其具體機制尚需進一步研究。