楊 鍇,程小虎,趙 杰,黃冀楠,于翠紅,張 麗,胡夢蕓,孫麗靜,李 輝,王清濤,張穎君

(1.河北工程大學(xué) 園林與生態(tài)工程學(xué)院,河北 邯鄲 056038;2.河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所,河北省作物遺傳育種實驗室,河北 石家莊 050035;3.定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,甘肅 定西 743000)

水是限制農(nóng)作物生產(chǎn)力的主要因素[1],目前,全球超過三分之二的淡水資源被用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。在水資源日益緊張的現(xiàn)在,農(nóng)業(yè)用水引起的社會矛盾也越來越突出。我國黃淮麥區(qū),尤其是河北省,水資源非常匱乏。作為河北省的小麥科研單位,培育抗旱、節(jié)水小麥品種的任務(wù)尤為突出,使其在干旱條件下可以獲得相當(dāng)?shù)某苫盥屎褪找?而在水分相對充足的條件下得到更高的產(chǎn)量。為達(dá)到此目標(biāo),鑒定和應(yīng)用與抗旱相關(guān)的遺傳資源是提高小麥抗旱性的關(guān)鍵[2],挖掘小麥抗旱基因、探究抗旱機(jī)理、提高植株水分利用效率是必由之路。

近年來,涉及植物非生物脅迫反應(yīng)和耐受的信號網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)得到了較好研究。已證實轉(zhuǎn)錄因子家族包括WRKY、NAC、AP2/ERF、bHLH和MYB等在植物應(yīng)答非生物脅迫的表達(dá)調(diào)控中起著重要作用[3-8]。例如,在擬南芥中,NAC轉(zhuǎn)錄因子ATAF1通過活性氧信號通路影響非生物應(yīng)激反應(yīng)[9],它還通過影響DREB2A,調(diào)控水脅迫應(yīng)答基因表達(dá),調(diào)節(jié)植物的抗旱性[10]。在小麥中,過表達(dá)TaPIMP1(1個MYB基因)可以改變脅迫應(yīng)答基因的響應(yīng)強(qiáng)度,提高轉(zhuǎn)基因小麥的耐旱能力[11]。在水稻中,已證明干旱誘導(dǎo)基因OsWRKY47通過調(diào)節(jié)CaBP和CRRSP11的表達(dá),來提高植株的抗旱性[12]。

植物碳吸收與蒸騰作用強(qiáng)度密切相關(guān)。在植物干旱響應(yīng)過程中,氣孔發(fā)揮著核心作用,它可以調(diào)節(jié)蒸騰作用和CO2的吸收[13]。光合作用時,CO2和水蒸氣在氣孔中進(jìn)行交換混合,這個過程受氣體壓力梯度和擴(kuò)散系數(shù)影響[14-15]。在干旱條件下,植物蒸騰作用降低,為了使碳的同化吸收保持在較高水平,必須增加葉片中CO2的濃度梯度使其得到補(bǔ)償,從而維持植株得到較高的生物學(xué)產(chǎn)量,這樣也就提高了水分利用效率(WUE)。脫落酸(ABA)在提高植物水分利用效率中的核心作用是大家公認(rèn)的。首先,水分利用效率受氣孔密度和大小的影響,而氣孔孔徑由ABA信號控制。在干旱條件下,在植物中產(chǎn)生水勢變化信號,此信號在植株內(nèi)長距離快速傳遞,誘導(dǎo)ABA合成[16]。ABA含量的增加可以啟動控制保衛(wèi)細(xì)胞抗旱反應(yīng)的信號通路[17],激活OPENSTOMATA1(SnRK2.6)。SnRK2.6是ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的核心調(diào)控元件,它通過磷酸化激活SLOW ANION CHANNEL ASSOCIATED 1因子,導(dǎo)致氣孔關(guān)閉,減少蒸騰作用,提高植物的抗旱性[18-19]。有研究證實,提高ABA受體響應(yīng)可以使植株在相同的水蒸發(fā)量下獲得更高的生物產(chǎn)量,如在植物中同時表達(dá)ABA受體基因RCAR6/PYL12可以提高植株40%的水分利用效率[20]。其次,ABA還會促進(jìn)葉片衰老,使?fàn)I養(yǎng)優(yōu)先供應(yīng)新生組織和器官,提高植物在干旱脅迫條件下的存活率[21-22]。例如,異源表達(dá)RCARs[23-24]和降低PP2Cs的表達(dá)[25]可以減少植物蒸騰作用,提高轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫下的存活率。

本研究利用黃淮麥區(qū)主栽小麥品種或優(yōu)異品系為試驗材料,利用KASP標(biāo)記檢測技術(shù)對已報道的3個抗旱主效基因1-fehw3、TaDREb和CWI-4A進(jìn)行等位基因分型,分析抗旱基因在不同環(huán)境下對小麥千粒質(zhì)量的影響,以明確抗旱基因?qū)Ξa(chǎn)量性狀的貢獻(xiàn)率,為進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選育抗旱小麥品種提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料

通過對黃淮麥區(qū)小麥種質(zhì)材料的地理分布、系譜、表型和基因型等數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,篩選出352份有代表性的小麥品種作為試驗材料。田間試驗在河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所堤上試驗站進(jìn)行,設(shè)2個處理,①正常灌溉條件:足墑播種,在小麥拔節(jié)期、灌漿期各澆1水,灌水量為750 m3/(hm2·次);②干旱處理:足墑播種,小麥全生育期不澆水。4 m行長,110粒,隨機(jī)區(qū)組設(shè)計,3次重復(fù)。干旱處理的試驗地與周邊試驗地設(shè)5 m的保護(hù)區(qū),以減少周邊試驗地灌溉對其的影響。小麥千粒質(zhì)量數(shù)據(jù)調(diào)查采用萬深SC-G型自動種子考種分析儀進(jìn)行。

1.2 KASP標(biāo)記檢測

挑選了3個抗旱主效基因,分別是1-fehw3[26]、TaDreb-B1[27]和Cwi-4A[28],利用KASP標(biāo)記[29]對試驗材料進(jìn)行基因分型,引物序列如表1所示。以CTAB法提取供試材料葉片基因組DNA,加400 μL TE溶解。DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測,所提DNA要求無明顯雜質(zhì)、條帶清晰、無降解。利用NanoDrop 2000(Thermo Fisher)檢測DNA濃度,統(tǒng)一稀釋為28.3 ng/μL,以稀釋后的小麥基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表1 抗旱基因及KASP標(biāo)記引物序列Tab.1 Drought resistant gene and KASP marker sequence

KASP標(biāo)記引物工作液制備:取2條上游引物(100 μmol/L)各12 μL、下游引物(100 μmol/L)30 μL,用無菌超純水補(bǔ)充至100 μL,作為KASP標(biāo)記的引物工作液,-20 ℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增體系為:模板DNA 1.5 μL,引物工作液0.041 7 μL,2× KASP Master Mix(LGC公司,Lot No.13426773)0.75 μL,用無菌超純水補(bǔ)充反應(yīng)體系至3 μL。PCR反應(yīng)程序為:94 ℃預(yù)變性15 min;94 ℃變性20 s、復(fù)性20 s(第1次的復(fù)性溫度為61 ℃,每個循環(huán)降溫0.6 ℃)共10個循環(huán);94 ℃變性20 s、55 ℃復(fù)性1 min,共26個循環(huán);72 ℃延伸3 min,4 ℃保存。

PCR反應(yīng)完成后利用熒光信號閱讀儀(Omega)和熒光檢測系統(tǒng)(Araya)將熒光信號轉(zhuǎn)變?yōu)榭煞治龅臄?shù)值對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)讀取。熒光掃描結(jié)果利用R軟件包進(jìn)行圖形化展示,抗旱基因類型帶有FAM熒光,分布于x軸附近;不抗旱基因類型帶有HEX熒光,分布于y軸附近。對抗旱基因型和不抗旱基因型品種的千粒質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行t-test檢測,以明確這3個抗旱基因?qū)π←溓ЯＹ|(zhì)量性狀的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 KASP標(biāo)記檢測效果

3個小麥抗旱基因(1-fehw3、TaDreb-B1和Cwi-4A)的KASP標(biāo)記檢測結(jié)果如圖1所示?？购祷蛐蛶в蠪AM熒光,分布于x軸附近。不抗旱基因類型帶有HEX熒光,分布于y軸附近。從結(jié)果看,每個基因2種不同基因型的小麥材料各分為1群,差異顯著。利用KASP標(biāo)記能夠?qū)⒉煌蝾愋偷男←湶牧线M(jìn)行有效區(qū)分,1-fehw3和Cwi-4A基因的分型結(jié)果比TaDreb-B1基因更優(yōu)。

圖1 小麥抗旱基因KASP標(biāo)記檢測結(jié)果Fig.1 KASP marker result of wheat drought resistance gene

2.2 單基因檢測結(jié)果

通過連續(xù)3 a(2019—2021年)在正常灌溉和干旱條件下檢測抗旱基因?qū)π←溓ЯＹ|(zhì)量的影響。結(jié)果分析顯示,1-fehw3、TaDreb-B1和Cwi-4A3個基因的優(yōu)勢等位基因型分布頻率分別為36.9%,41.1%,35.1%。但利用1-fehw3、TaDreb-B1和Cwi-4A3個基因單獨檢測時,在不同年份和不同條件下,抗旱基因型與不抗旱基因型品種間千粒質(zhì)量均未達(dá)到顯著水平(表2—4)。

表2 不同環(huán)境下1-fehw3基因?qū)π←溓ЯＹ|(zhì)量的影響Tab.2 Effect of 1-fehw3 gene on thousand grains weight of wheat under different environments

表3 不同環(huán)境下TaDreb-B1基因?qū)π←溓ЯＹ|(zhì)量的影響Tab.3 Effect of TaDreb-B1 gene on thousand grains weight of wheat under different environments

表4 不同環(huán)境下Cwi-4A基因?qū)π←溓ЯＹ|(zhì)量的影響Tab.4 Effect of Cwi-4A gene on thousand grains weight of wheat under different environments

2.3 雙基因檢測結(jié)果

當(dāng)以2個基因進(jìn)行聯(lián)合檢測時,顯示1-fehw3+TaDreb-B1在2019年正常灌溉條件下抗旱基因型平均千粒質(zhì)量為46.46 g,不抗旱基因型平均千粒質(zhì)量為44.36 g;2020年干旱條件下抗旱基因型平均千粒質(zhì)量為49.21 g,不抗旱基因型為47.30 g,2個環(huán)境下千粒質(zhì)量均達(dá)到顯著水平(表5)。當(dāng)利用1-fehw3+Cwi-4A兩基因進(jìn)行聯(lián)合檢測時,在2019干旱、2020干旱兩環(huán)境下抗旱基因型較不抗旱基因型千粒質(zhì)量達(dá)到顯著水平(表6)。利用TaDreb-B1+Cwi-4A兩基因檢測時,在2020干旱環(huán)境下抗旱基因型較不抗旱基因型千粒質(zhì)量達(dá)到顯著水平(表7)。

表5 不同環(huán)境下1-fehw3+TaDreb-B1基因?qū)π←溓ЯＹ|(zhì)量的影響Tab.5 Effect of 1-fehw3+TaDreb-B1 gene on thousand grains weight of wheat under different environments

表6 不同環(huán)境下1-fehw3+Cwi-4A基因?qū)π←溓ЯＹ|(zhì)量的影響Tab.6 Effect of 1-fehw3+Cwi-4A gene on thousand grains weight of wheat under different environments

表7 不同環(huán)境下TaDreb-B1+Cwi-4A基因?qū)π←溓ЯＹ|(zhì)量的影響Tab.7 Effect of TaDreb-B1+Cwi-4A gene on thousand grains weight of wheat under different environments

2.4 三基因聯(lián)合檢測結(jié)果

當(dāng)以1-fehw3、TaDreb-B1和Cwi-4A3個基因進(jìn)行聯(lián)合檢測時,優(yōu)勢等位基因類型分布頻率約占8.2%。除2020年正常灌溉條件之外,其余5個環(huán)境(2019年正常灌溉、2019年干旱、2020年干旱、2021年正常灌溉、2021年干旱)下,抗旱基因型平均千粒質(zhì)量均高于不抗旱基因型,達(dá)到顯著水平(表8)。

表8 不同環(huán)境下1-fehw3+TaDreb-B1+Cwi-4A基因?qū)π←溓ЯＹ|(zhì)量的影響Tab.8 Effect of 1-fehw3+TaDreb-B1+Cwi-4A gene on thousand grains weight of wheat under different environments

3 結(jié)論與討論

小麥?zhǔn)俏覈笞魑镏?與我國糧食安全息息相關(guān)。為了滿足人們不斷增長的糧食需求,在過去幾十年中育種工作者對小麥產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性、適應(yīng)性等性狀進(jìn)行了改良,不僅使小麥表型產(chǎn)生明顯變化,而且對重要基因的優(yōu)異等位變異進(jìn)行了強(qiáng)烈選擇。我國黃淮麥區(qū)地下水資源嚴(yán)重缺乏,小麥的抗旱性對于小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)至關(guān)重要。小麥粒質(zhì)量是小麥產(chǎn)量構(gòu)成的三要素之一,提高粒質(zhì)量是現(xiàn)代小麥育種的主要目標(biāo)之一。通過分子生物學(xué)手段,鑒定小麥抗旱基因分布、研究抗旱基因?qū)αＹ|(zhì)量的貢獻(xiàn)率,對于培育抗旱、高產(chǎn)小麥品種和多基因聚合育種都具有較高的應(yīng)用價值和指導(dǎo)意義。

隨著基因組學(xué)的迅速發(fā)展,特別是高通量檢測技術(shù)的應(yīng)用,利用小麥功能標(biāo)記解析品種關(guān)鍵基因或優(yōu)異等位變異成為可能,分子標(biāo)記在小麥遺傳改良中應(yīng)用越來越廣泛。目前,SNP標(biāo)記由于其在基因組中的豐富性、共顯性遺傳、位點特異性、能夠進(jìn)行高通量基因分型等優(yōu)點得到大家的認(rèn)可,提高了小麥分子標(biāo)記輔助育種的效率。KASP標(biāo)記也逐漸取代了以往的RFLP、RAPD、AFLP、CAPS、SSR等分子標(biāo)記,成為主要的分子標(biāo)記類型。很多學(xué)者利用開發(fā)的KASP標(biāo)記對小麥抗旱功能基因進(jìn)行檢測,促進(jìn)了對抗旱小麥遺傳基礎(chǔ)解析和基因聚合育種的發(fā)展。如國審小麥品種漯麥18抗旱能力突出,袁謙等[30]為了深入了解漯麥18抗旱的分子機(jī)制,采用KASP標(biāo)記分析了漯麥18含有的抗旱功能基因。結(jié)果表明,漯麥18同時含有1-fehw3、CWI-4A和CWI-5D3個抗旱基因。以上信息為深入認(rèn)識漯麥18的特征性狀的分子機(jī)制提供了理論支持,對品種的進(jìn)一步應(yīng)用和未來小麥遺傳改良具有較強(qiáng)的實用價值。高振賢等[31]利用KASP標(biāo)記檢測了河北省153份審定小麥品種的光周期、春化、株高、粒質(zhì)量、穗發(fā)芽、抗旱和抗病相關(guān)基因。結(jié)果表明,2個與抗旱相關(guān)的基因TaDREB-B1和1-fehw3優(yōu)異等位變異占比分別是49.0%和39.9%。王志偉等[32]利用3個抗旱基因的KASP標(biāo)記對云南育成的42份小麥品種(系)進(jìn)行檢測,顯示23份材料為TaDreb-B1基因的耐旱單倍型,頻率為54.76%;24份材料為1-fehw3基因的抗旱單倍型,頻率為57.14%;35份材料為TaCwi-4A基因的抗旱單倍型,頻率為83.33%。有11份材料為3個抗旱基因的抗性單倍型組合,頻率為26.19%。本研究利用1-fehw3、TaDreb-B1和Cwi-4A3個抗旱基因的KASP標(biāo)記對352份黃淮麥區(qū)小麥種質(zhì)材料進(jìn)行檢測,1-fehw3、TaDreb-B1和Cwi-4A3個基因的優(yōu)勢等位基因型分布頻率分別為36.9%,41.1%和35.1%,與高振賢等[31]的結(jié)果相似,低于王志偉等[32]的結(jié)果。這可能是由于試驗材料的區(qū)域不同的原因,高振賢等[31]檢測的河北省審定小麥品種,本研究所用試驗材料來自黃淮麥區(qū),包括河北省、河南省和山東省,所以結(jié)果相似。而王志偉等[32]的試驗材料來自云南省,與黃淮麥區(qū)小麥材料差異較大。

本研究中,利用1-fehw3、TaDreb-B1和Cwi-4A3個基因單獨檢測時,試驗結(jié)果均未達(dá)到顯著差異,但同時利用3個基因聯(lián)合檢測時差異顯著,說明作物的抗旱性是由多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀,單個基因起的作用較小,在利用單個基因進(jìn)行檢測時結(jié)果存在較大偏差,而同時利用2個或3個基因進(jìn)行聯(lián)合檢測,可以大大提高分子標(biāo)記選擇的準(zhǔn)確性。前人也報道過相似情況,如張海萍等[33]為探索我國小麥微核心種質(zhì)及地方品種籽粒休眠的遺傳基礎(chǔ),利用已報道的5個分子標(biāo)記對107份我國小麥微核心種質(zhì)及31份地方品種進(jìn)行籽粒休眠的分子標(biāo)記鑒定。結(jié)果表明,單個基因效應(yīng)存在一定差異,而利用5個標(biāo)記聯(lián)合則可解釋95.9%的性狀變異。利用2個標(biāo)記聯(lián)合檢測時的準(zhǔn)確率也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單個基因,如Vp1-b2和Xbarc294的組合可解釋表型變異的89.1%。小麥抗白粉病基因Pm6具有良好的成株期抗性,但在苗期對一些小種的抗性較差,采用傳統(tǒng)的方法難以很快鑒定Pm6基因的存在。Xwg996為共顯性標(biāo)記,與Pm6基因連鎖而且專一性很強(qiáng)。KSUK948為互斥相標(biāo)記,與Pm6基因連鎖專一性較強(qiáng)。王瑞等[34]聯(lián)合使用這2個標(biāo)記有效地檢測了Pm6基因的存在。同樣,單獨使用一個分子標(biāo)記很難檢測小麥抗白粉病基因Pm4,王俊美[35]利用2個標(biāo)記STS463和STS410進(jìn)行聯(lián)合檢測,即能夠有效地進(jìn)行Pm4基因的分子檢測,有助于將Pm4基因準(zhǔn)確導(dǎo)入農(nóng)藝性狀優(yōu)良的感病品種。