張 斌

(湖南科技學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院,湖南省銀杏工程技術(shù)研究中心,湖南 永州 425199)

植物作為固著生物,在其整個(gè)生命周期經(jīng)常會(huì)受到不利的環(huán)境因素影響,如鹽、干旱等都能影響植物正常發(fā)育過程,嚴(yán)重時(shí)則導(dǎo)致作物減產(chǎn)或絕產(chǎn)。為了適應(yīng)不利的生存條件,在不斷地自然選擇和進(jìn)化過程中,植物形成了多種策略提高自身對環(huán)境的適應(yīng)能力。植物對環(huán)境脅迫適應(yīng)的調(diào)控機(jī)制主要是通過激活或抑制脅迫響應(yīng)途徑中的基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的[1]。已有研究指出,多種轉(zhuǎn)錄因子家族成員在脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)調(diào)控方面發(fā)揮功能,從而調(diào)節(jié)植物對不利環(huán)境的適應(yīng)能力[2]。如WRKY、AP2/ERF、MYB、NAC、bZIP和GRAS等家族成員在植物對鹽、干旱等脅迫中的功能和分子機(jī)制已被報(bào)道[3-5]。

GRAS是植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子家族,至今在其他物種中未見有關(guān)該家族成員的報(bào)道。通常GRAS蛋白的C端高度保守,被稱為GRAS結(jié)構(gòu)域,該保守結(jié)構(gòu)域由SAW、RVER、PFYRE、V/IHIID等基序組成。到目前為止,已有多種植物GRAS家族成員被鑒定出來,如擬南芥(Arabidopsisthaliana)[6]、水稻(Oryzasativa)[6]、煙草(Nicotianatabacum)[7]、玉米(Zeamays)[8]、胡楊(Populuseuphratica)[9]、甘薯(Ipomoeatrifida)[10]、棉花(Gossypiumhirsutum)[11]和大豆(Glycinemax)[12]等。研究顯示,GRAS基因在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腋生分生組織發(fā)育和根細(xì)胞伸長調(diào)節(jié)等過程發(fā)揮重要功能[13-14]。GRAS基因正調(diào)控植物對生物和非生物脅迫的耐受功能也已被報(bào)道,如番茄SlGRAS6沉默的植株表現(xiàn)出更高的抗病能力,而過表達(dá)SlGRAS40基因的轉(zhuǎn)基因番茄植株則表現(xiàn)出對鹽和干旱脅迫更強(qiáng)的耐受性[15]。結(jié)縷草(ZoysiajaponicaSteud.)GRAS家族成員ZjCIGR1,其表達(dá)水平在冷凍脅迫下顯著上升,其過表達(dá)可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因材料耐冷性[16]。山葡萄(Vitisamurensis)GRAS家族基因VaPAT1在擬南芥中異源表達(dá)可增強(qiáng)AtSIZ1、AtCBF1、AtATR1/MYB34、AtMYC2、AtCOR15A、AtRD29A和AtRD29B等逆境相關(guān)基因的表達(dá);在寒冷、干旱和鹽脅迫下,過表達(dá)株系通過積累較高水平的脯氨酸和可溶性糖含量增強(qiáng)脅迫耐受性[17]。Yang等[18]在甘藍(lán)型油菜中鑒定到一個(gè)GRAS家族LAS亞族基因BnLAS,該基因過表達(dá)可通過激活蠟質(zhì)合成相關(guān)基因(CER1、CER2、KCS1和KCS2)的表達(dá),增加蠟質(zhì)在蓮座葉表皮的積累,進(jìn)而賦予轉(zhuǎn)基因擬南芥更強(qiáng)的耐旱能力。白菜型油菜GRAS家族基因BrLAS也具有類似的功能,其過表達(dá)擬南芥植株的發(fā)育受到抑制,如抽薹和開花時(shí)間延遲、育性降低和衰老延遲等;干旱脅迫下,BrLAS可通過增強(qiáng)擬南芥SOD、POD、CAT2和APX等基因表達(dá)水平,提高抗氧化酶活性,清除過量的ROS,最終使過表達(dá)植株表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐旱性[19]。Ma等[20]研究發(fā)現(xiàn),干旱和鹽處理能夠?qū)е聴顦銹eSCL7基因(屬于GRAS家族)的表達(dá)水平顯著上調(diào),同時(shí)過表達(dá)PeSCL7基因的擬南芥耐旱和耐鹽性均明顯增強(qiáng)。而Wang等[2]發(fā)現(xiàn)大豆GmGRAS37基因的表達(dá)水平在干旱和鹽脅迫處理下顯著上調(diào),過表達(dá)GmGRAS37的大豆毛狀根對干旱和鹽脅迫的抗性明顯增強(qiáng),且非生物脅迫相關(guān)的基因(GmDREB1、GmNCED3、GmCLC1、GmSOS1、GmSOD1和GmSOD2)的表達(dá)水平較EV植株顯著上調(diào)。大豆是一種原產(chǎn)于中國的重要豆科植物,為人類生產(chǎn)生活提供大量的蛋白質(zhì)和植物油,也是動(dòng)物飼料的主要原材料,但其生長和產(chǎn)量易受到干旱脅迫影響。探究大豆耐旱的機(jī)理,尋求調(diào)控耐旱的關(guān)鍵基因?qū)υ鰪?qiáng)大豆抗旱性至關(guān)重要。前期研究中,在栽培大豆中鑒定到78個(gè)GRAS家族成員;通過轉(zhuǎn)錄組測序和熒光定量PCR檢測,發(fā)現(xiàn)大豆GmGRAS14、GmGRAS33和GmGRAS69的相對表達(dá)水平在鹽處理后顯著增加[12]。本研究發(fā)現(xiàn),GmGRAS69的表達(dá)水平受干旱誘導(dǎo)上調(diào),過表達(dá)GmGRAS69的轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱性明顯增強(qiáng),這些結(jié)果可為解析大豆耐旱機(jī)理和培育耐旱品種提供理論支持和重要的候選基因。

1 材料和方法

1.1 序列多重比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

使用氨基酸序列構(gòu)建不同植物GRAS家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹。首先將所需的GRAS成員氨基酸序列整理成FASTA格式,然后利用多序列比對分析軟件(Clustal X)進(jìn)行多重比對[21],保存比對結(jié)果。使用MAGA-X軟件再次分析氨基酸多重比對結(jié)果,然后基于鄰接法和泊松模型構(gòu)建不同植物GRAS家族成員的進(jìn)化樹[22]。

1.2 植物材料培養(yǎng)和干旱處理

本研究使用的植物材料包括栽培大豆Williams 82和擬南芥(Col-0)。將大豆和擬南芥種子直接播種于營養(yǎng)土和蛭石混合(1∶1)基質(zhì)中,用Hoagland營養(yǎng)液澆灌,在植物培養(yǎng)室生長,培養(yǎng)室條件:長日照(16 h晝/8 h夜),溫度22～25 ℃,空氣濕度60%～70%。用30%的PEG溶液模擬干旱條件,處理生長14 d的大豆幼苗,分別在0,1,3,6,9,12 h取大豆的根和葉,用于RNA提取和基因表達(dá)水平檢測,每種處理均包含3個(gè)獨(dú)立的生物重復(fù)樣品。

1.3 總RNA提取和熒光定量PCR檢測

為了檢測大豆GmGRAS69基因是否參與干旱脅迫響應(yīng),研究使用30% PEG溶液模擬干旱條件處理大豆植株,分別檢測基因在根和葉中的表達(dá)水平變化。使用液氮將植物組織磨成粉末,然后提取總RNA,并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA提取質(zhì)量,同時(shí)測定RNA濃度。取2 μg RNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ThermoFisher scientific,美國)獲得cDNA第1條鏈作為PCR模板。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(CFX96,Bio-Rad,美國)進(jìn)行基因表達(dá)量檢測。熒光定量PCR體系包括10 μL 2×SYBR Green Mix,定量PCR引物(10 μmol/L)1.0 μL,cDNA模板(10 mg/μL)1.0 μL,加入超純水至總體積20 μL。PCR儀程序設(shè)置為:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性20 s,60 ℃退火和延伸30 s(40個(gè)循環(huán))。以大豆UBI3和擬南芥ACT基因作為內(nèi)參基因,利用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)水平。本研究使用的定量PCR引物序列見表1。

表1 用于熒光定量PCR試驗(yàn)的引物序列Tab.1 Primer sequences for Real-time quantitative PCR experiments

1.4 大豆GmGRAS69基因過表達(dá)載體構(gòu)建和擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

以大豆cDNA為模板,使用高保真DNA聚合酶克隆GmGRAS69基因的CDS片段,用T4DNA連接酶將克隆得到的片段連至雙元表達(dá)載體pFGC5941的35S啟動(dòng)子下游。利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥[23],將收獲T0種子播種,噴灑草銨膦篩選抗性植株。此外,使用CTAB法提取葉片總DNA用于轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR鑒定,提取RNA進(jìn)行半定量PCR檢測外源基因是否成功高表達(dá),選取外源基因高表達(dá)的株系,篩選到T3、獲得純合材料用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥耐干旱分析

野生型擬南芥和過表達(dá)株系(T3)的種子經(jīng)75%乙醇表面消毒后,均勻播種于濕潤的營養(yǎng)土和蛭石混合(1∶1)基質(zhì)上,在4 ℃冷藏箱放置3 d后轉(zhuǎn)移至植物培養(yǎng)室。14 d后取大小一致的擬南芥用于干旱處理,首先將培養(yǎng)擬南芥的基質(zhì)吸水飽和,然后停止供水,使其自然干旱,觀察野生型和過表達(dá)株系的表型變化。測定葉片相對含水量時(shí)取葉片稱質(zhì)量即鮮質(zhì)量(Fresh weight,FW);將葉片浸沒在去離子水中,放置在4 ℃冷藏箱12 h,擦干表面水后再次稱質(zhì)量即吸水后的總質(zhì)量(Total weight,TW);將葉片在75 ℃烘箱烘干,再稱質(zhì)量即干質(zhì)量(Dry weight,DW);葉片相對含水量=(FW-DW)/(TW-DW)×100%[24]。葉片可溶性糖含量的測定參考Yuan等[17]描述的方法。SOD、POD和CAT活性參考Li等[19]描述的方法測定,利用熒光定量PCR檢測對應(yīng)的SOD、POD和CAT基因在野生型和過表達(dá)植株中的表達(dá)水平,方法同前述,引物序列見表1。其中,測定鮮質(zhì)量、葉片相對含水量和可溶性糖含量時(shí)均取6個(gè)生物重復(fù)樣品進(jìn)行試驗(yàn);SOD、POD和CAT活性及對應(yīng)的基因表達(dá)水平測定時(shí)均取3個(gè)生物重復(fù)樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆GmGRAS69的結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)已有報(bào)道,本研究整理了植物中參與植物干旱脅迫調(diào)控的GRAS家族成員的氨基酸序列,包括大豆GmGRAS37[2]、水稻OsGRAS23[25]、番茄SlGRAS40[15]、山葡萄VaPAT1[17]、白菜型油菜BrLAS[19]、紫花苜蓿MsGRAS51[26]和楊樹PeSCL7[20]與GmGRAS69進(jìn)行序列多重比對。結(jié)果顯示,C端氨基酸非常保守、相似度很高,其包含高度保守的IHIID、PFYRE、RVER和SAW基序(圖1-A)。根據(jù)這些氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹,顯示大豆GmGRAS69和MsGRAS51、GmGRAS37、VaPAT1具有較近的進(jìn)化關(guān)系(圖1-B)。前期已有報(bào)道指出GmGRAS37和VaPAT1在干旱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮正調(diào)控作用,因此,推測大豆GmGRAS69可能具有類似的功能。

A.大豆GmGRAS69和其他GRAS蛋白的氨基酸序列比對;B.GRAS家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹。A.Amino acid sequence alignment of soybean GmGRAS69 and other GRAS proteins;B.Phylogenetic tree of the GRAS family.

2.2 干旱處理下GmGRAS69基因表達(dá)變化

熒光定量PCR結(jié)果顯示,GmGRAS69基因的表達(dá)水平在大豆根和葉中均受PEG誘導(dǎo)上調(diào);PEG處理6 h,在葉中的表達(dá)水平達(dá)到最高(上調(diào)約3.4倍),然后逐漸下降,在12 h與對照(0 h)無顯著差異(圖2)。GmGRAS69基因的表達(dá)水平在根中受PEG誘導(dǎo)上調(diào)更顯著;處理3 h上調(diào)約5.5倍,隨后表達(dá)水平逐漸下降,但12 h仍顯著高于0 h(圖2)。這一結(jié)果說明GmGRAS69基因能夠響應(yīng)干旱脅迫,導(dǎo)致表達(dá)水平發(fā)生改變。

不同小寫字母表示差異顯著。圖4—5同。Different lowercase letters indicate significant difference.The same as Fig.4—5.

2.3 GmGRAS69基因過表達(dá)擬南芥轉(zhuǎn)化和鑒定

本研究克隆了大豆GmGRAS69基因的CDS序列,片段長度為1 638 bp(圖3-A);回收片段后插入植物表達(dá)載體pFGC5941,再利用XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切驗(yàn)證片段成功插入目的位點(diǎn)(圖3-B),最終獲得構(gòu)建成功的重組載體(圖3-C)。利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花轉(zhuǎn)化法將重組載體轉(zhuǎn)化野生型擬南芥,利用草銨膦篩選T0抗性植株(即對草銨膦有抗性、葉片呈綠色且可正常生長的幼苗)(圖3-D)。進(jìn)一步進(jìn)行PCR驗(yàn)證顯示,編號(hào)1,2,3,5號(hào)植株都能擴(kuò)出目的條帶,說明這些植株為轉(zhuǎn)基因材料(圖3-E)。進(jìn)一步提取RNA檢測基因表達(dá)水平,顯示野生型材料中未檢測到GmGRAS69基因的表達(dá);轉(zhuǎn)基因植株#1、#2和#3中外源基因GmGRAS69則能夠表達(dá)(圖3-F),說明成功獲得GmGRAS69基因過表達(dá)株系,這些株系可用于下一步功能分析。

A.GmGRAS69基因CDS片段克隆;B.重組載體酶切驗(yàn)證;C.過表達(dá)載體示意圖;D.抗草銨膦的擬南芥植株篩選;E.轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR鑒定;F.GmGRAS69基因異源表達(dá)的半定量PCR檢測。A.Cloning of CDS fragment of GmGRAS69;B.Enzyme digestion verification of recombinant vector;C.Schematic diagram of overexpression vector;D.Screening of Arabidopsis plants resistant to glufosinate;E.PCR identification of transgenic Arabidopsis;F.Semi-quantitative PCR detection of heterologous expression of GmGRAS69.

2.4 GmGRAS69基因過表達(dá)擬南芥耐旱性分析

選取2個(gè)過表達(dá)株系(OE#1和OE#2)純合植株(T3)進(jìn)行耐旱性分析。野生型和過表達(dá)植株正常培養(yǎng)14 d后,分成對照組和干旱處理組,其中對照組營養(yǎng)基質(zhì)吸水飽和后仍正常澆水,處理組營養(yǎng)基質(zhì)吸水飽和后停止供水。處理14 d后,發(fā)現(xiàn)對照組植株長勢正常,植株大小和單株鮮質(zhì)量無顯著差異;而處理組植株生長雖然都受到了抑制、葉片失綠,但是WT受抑制更嚴(yán)重,其蓮座葉萎蔫,單株鮮質(zhì)量顯著低于過表達(dá)株系OE#1和OE#2(圖4-A、B)。干旱處理后,擬南芥WT、OE#1和OE#2植株葉片相對含水量都顯著下降,但是,在OE#1和OE#2植株中顯著高于WT;干旱處理導(dǎo)致葉片中可溶性糖含量顯著上升,在過表達(dá)植株中的積累量比WT更高(圖4-C、D)。這些植株生長表型和生理指標(biāo)表明大豆GmGRAS69基因異源表達(dá)增強(qiáng)了擬南芥的耐旱性。

圖4 GmGRAS69基因過表達(dá)擬南芥的耐旱性分析Fig.4 Analysis of drought tolerance of Arabidopsis overexpressing GmGRAS69

2.5 GmGRAS69基因過表達(dá)植株中抗氧化途徑被激活

為了探究GmGRAS69基因調(diào)控植物耐旱的可能機(jī)理,測定擬南芥葉中SOD、POD和CAT活性。結(jié)果顯示,正常生長的擬南芥WT和過表達(dá)植株中的酶活性無顯著差異;干旱處理后,野生型WT和過表達(dá)植株的SOD、POD和CAT活性均顯著增強(qiáng),且在過表達(dá)植株中顯著高于WT(圖5)。檢測對應(yīng)的SOD、POD和CAT基因表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)干旱處理后3個(gè)基因在擬南芥WT和過表達(dá)植株(OE#1和OE#2)中的表達(dá)水平都顯著上調(diào),并且在OE#1和OE#2植株中上調(diào)倍數(shù)顯著高于WT(圖5)。說明GmGRAS69可以通過上調(diào)抗氧化酶編碼基因的表達(dá)、增強(qiáng)抗氧化酶的活性賦予轉(zhuǎn)基因擬南芥更強(qiáng)的耐旱性。

圖5 GmGRAS69基因過表達(dá)對抗氧化酶活性和抗氧化酶基因表達(dá)水平的影響Fig.5 Effects of overexpression of GmGRAS69 on antioxidant enzyme activity and expression level of antioxidant enzyme genes

3 結(jié)論與討論

研究表明,植物GRAS蛋白,如大豆GmGRAS37、山葡萄VaPAT1、白菜型油菜BrLAS、楊樹PeSCL7等在植物干旱脅迫響應(yīng)過程發(fā)揮重要作用[2,17,19-20]。本研究通過氨基酸結(jié)構(gòu)分析表明,大豆GmGRAS69蛋白與上述蛋白在C端具有共同的保守結(jié)構(gòu)域。對基因家族或同源基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析時(shí),一般認(rèn)為屬于同一亞家族或同一進(jìn)化分支的基因同源性較高、可能具有類似的生物學(xué)功能[10]。本研究中構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示GmGRAS69與MsGRAS51、GmGRAS37、VaPAT1具有更近的進(jìn)化關(guān)系,表明其在大豆干旱脅迫響應(yīng)和適應(yīng)過程也發(fā)揮特定功能。前期研究表明,GmGRAS69基因在大豆根中受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)[12]。本研究顯示PEG處理的大豆根和葉中GmGRAS69基因的表達(dá)水平都顯著上調(diào),且在根中上調(diào)倍數(shù)更高,這種干旱誘導(dǎo)的表達(dá)特性可能與其對干旱脅迫的適應(yīng)有關(guān)。為了探究GmGRAS69參與植物耐旱的功能,獲得了GmGRAS69基因過表達(dá)擬南芥植株。有研究顯示,外源基因的表達(dá)會(huì)對抑制轉(zhuǎn)基因擬南芥的正常生長、延緩發(fā)育過程[19]。比較正常培育和干旱處理后的擬南芥野生型WT和GmGRAS69過表達(dá)株系(OE#1和OE#2)生長表型發(fā)現(xiàn),正常條件下過表達(dá)植株和WT的表型無顯著差異,說明大豆基因的異源表達(dá)未對擬南芥的生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響;而在干旱處理后,所有植株均表現(xiàn)為生長受到抑制,葉片失氯、萎蔫,但是過表達(dá)植株的長勢明顯由于WT,主要體現(xiàn)在單株鮮質(zhì)量和葉片相對含水量均顯著高于WT,說明GmGRAS69基因過表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱性。可溶性糖是一種十分重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),多種非生物脅迫(干旱、鹽、冷脅迫等)都會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)的可溶性糖含量變化;一般認(rèn)為脅迫條件下可溶性糖含量積累越多,植物抗逆性越強(qiáng)[17]。干旱脅迫下,WT和過表達(dá)植株中的可溶性糖含量都顯著增加,但是過表達(dá)植株中的可溶性糖含量顯著高于WT;因此,相比于WT,OE#1和OE#2植株受到的傷害減輕,長勢優(yōu)于WT。干旱脅迫能夠直接引起氧化損傷,植物中的ROS清除酶(包括SOD、POD、CAT、APX和GST)能夠減輕氧化損傷,增強(qiáng)植物的耐旱性[20,27]。為了進(jìn)一步解析GmGRAS69參與耐旱的分子機(jī)制和調(diào)控途徑,測定了正常培育和干旱處理的WT和過表達(dá)植株中SOD、POD和CAT活性,發(fā)現(xiàn)干旱處理的所有植株中上述酶活性均顯著增強(qiáng),而在過表達(dá)植株中顯著高于WT。檢測擬南芥葉中SOD、POD和CAT對應(yīng)編碼基因的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),干旱脅迫下過表達(dá)植株中的SOD、POD和CAT基因表達(dá)水平也顯著高于WT。以上結(jié)果說明,大豆GmGRAS69蛋白可以通過激活抗氧化途徑,增強(qiáng)抗氧化酶活性,清除干旱脅迫導(dǎo)致的ROS,以緩解對植物的損傷。類似的,已有研究證明白菜型油菜GRAS家族成員BrLAS也可以通過增強(qiáng)SOD、POD和CAT活性、清除干旱脅迫下過量積累的ROS,提高對應(yīng)的SOD、POD和CAT2基因的表達(dá)水平,增強(qiáng)BrLAS基因過表達(dá)擬南芥的耐旱性[19]。本研究從大豆GRAS家族中篩選到一個(gè)受干旱誘導(dǎo)的成員GmGRAS69,通過序列比對和進(jìn)化分析以及對轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型分析,初步證明了GmGRAS69通過抗氧化途徑和增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖的積累,增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性。但是轉(zhuǎn)錄因子GmGRAS69是如何參與調(diào)控抗氧化酶的活性,通過哪種機(jī)制調(diào)控下游基因的表達(dá),這是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過程,值得進(jìn)一步探究,也是接下來的研究方向。