張沛沛,陳 濤,景凡麗,,劉 媛,馬靖福,田 甜,王 鵬,楊德龍,

(1.干旱生境作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070)

植物磺肽素(Phytosulfokine,PSK)是一類小肽類植物內(nèi)源激素,為僅有5個(gè)氨基酸組成的磺化五肽,在植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆和抗病反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用[1-3]。已有的研究結(jié)果表明,PSK與細(xì)胞膜上的磺化肽激素受體PSKR(PSK receptor)結(jié)合來發(fā)揮功能。PSKR是一類胞外區(qū)富含亮氨酸重復(fù)序列LRRs(Luecine-rich repeat)型的跨膜類受體蛋白激酶(Receptor-like protein kinases,RLKs)。從結(jié)構(gòu)上看,擬南芥PSKR由胞外的配體識(shí)別結(jié)構(gòu)域、LRR結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域組成。PSK配體與PSKR胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合后,激活胞內(nèi)蛋白激酶域,進(jìn)一步通過磷酸化下游調(diào)節(jié)因子來發(fā)揮調(diào)控作用[4]。目前已有研究表明,PSK-PSKR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在響應(yīng)非生物脅迫、調(diào)控植物生長(zhǎng)和發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用,如調(diào)控根形態(tài)、子葉伸長(zhǎng)、細(xì)胞增殖、體細(xì)胞胚的形成、對(duì)病原菌侵染的抗性以及花粉的萌發(fā)與受精等[5-10]。

目前,PSKR家族個(gè)別成員在擬南芥、水稻和其他物種中相繼被克隆和研究。在擬南芥中PSKR包含2個(gè)旁系同源基因,分別為AtPSKR1和AtPSKR2[11]。在擬南芥中,AtPSKR1除了與共受體BAK1結(jié)合外,還可以與H+-ATPases的2個(gè)成員AHA1 和AHA2結(jié)合形成復(fù)合體,該復(fù)合體進(jìn)而與環(huán)核苷酸門控離子通道(Cyclic nucleotide-gated channel 17,CNGC17)結(jié)合,從而通過細(xì)胞增殖促進(jìn)了子葉和根的伸長(zhǎng)[12]。過表達(dá)AtPSKR1的擬南芥植株還表現(xiàn)出更高的愈傷組織分化能力,同時(shí)植株的衰老顯著延遲。在水稻中已經(jīng)鑒定了15個(gè)PSKR家族成員[13],并對(duì)少數(shù)幾個(gè)成員的功能進(jìn)行了較深入的研究,如OsPSKR15、LRK1和LRK2基因。在水稻中,已發(fā)現(xiàn)OsPSKR15的激酶結(jié)構(gòu)域可以磷酸化ABA受體AtPYL9和OsPYL11,從而正向調(diào)控ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,過表達(dá)OsPSKR15可顯著增強(qiáng)擬南芥植株的抗旱性[14]。之前研究人員在水稻中克隆了一個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列的類受體激酶(Leucine-rich repeat receptor kinases,LRKs)基因簇,該基因簇是一個(gè)與提高產(chǎn)量相關(guān)的QTL,包含8個(gè)LRKs基因(LRK1～LRK8)。Nagar等[13]最近報(bào)道,水稻LRK1～LRK8基因所編碼的蛋白均屬于PSKR家族成員。在水稻中LRK1基因的過量表達(dá)通過提高細(xì)胞的增殖能力從而提高了谷粒數(shù)和籽粒千粒質(zhì)量,使水稻的單株產(chǎn)量增加了27.09%[15]。Kang等[16]對(duì)水稻PSKR家族成員研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)LRK2基因可顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的側(cè)根數(shù)、分蘗數(shù),進(jìn)而提高了水稻的抗旱性。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,水稻LRK2與擬南芥AtPSKR1同源性最高。迄今為止,對(duì)PSKR家族基因功能的研究主要集中在模式植物擬南芥和水稻中,關(guān)于PSKR受體激酶對(duì)小麥產(chǎn)量及抗逆性的影響還未進(jìn)行研究。

小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物之一,提高小麥的產(chǎn)量直接關(guān)系到我國(guó)糧食安全的重大問題。鑒于植物PSKR1在調(diào)控細(xì)胞增殖及提高植物抗逆性中具有重要作用。本研究對(duì)象是TaPSKRs基因家族成員中與擬南芥AtPSKR1、AtPSKR2以及水稻LRK1/2同源性最高的TaPSKR1基因。采用同源克隆的方法,從普通小麥品種晉麥47根組織中克隆TaPSKR1的3個(gè)部分同源基因的cDNA序列,命名為TaPSKR1-6A、TaPSKR1-6B和TaPSKR1-6D,利用生物信息學(xué)對(duì)其基因和編碼的氨基酸序列進(jìn)行了分析,同時(shí)研究了TaPSKR1基因在不同組織器官及非生物脅迫下的表達(dá)模式,以期為進(jìn)一步研究小麥TaPSKR1的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)與處理

供試小麥品種為晉麥47。

選取籽粒飽滿的種子經(jīng)1%次氯酸鈉消毒5 min,無菌水沖洗3次后,置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中黑暗培養(yǎng)48 h(25 ℃),待種子露白后置于光照培養(yǎng)箱(光暗周期16 h/8 h,溫度25 ℃/20 ℃)中進(jìn)行水培培養(yǎng)。7 d后換用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),每2 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液,待幼苗生長(zhǎng)至兩葉一心時(shí),分別對(duì)小麥幼苗進(jìn)行20% PEG-6000和 200 mmol/L NaCl處理。脅迫處理0,3,6,12,24 h后采集對(duì)照組和處理組幼苗的葉片和根,迅速置于液氮中速凍后,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。同時(shí)未處理的幼苗轉(zhuǎn)移至4 ℃春化柜中春化30 d左右后,移載到裝滿營(yíng)養(yǎng)土的花盆中,在溫室中繼續(xù)培養(yǎng),于小麥的孕穗期采集植株的幼穗、根、莖、葉片以及灌漿期10 d的籽粒,用于后續(xù)基因的特異表達(dá)分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA合成 利用天根生化科技(北京)有限公司的RNAprep pure植物RNA提取試劑盒,提取晉麥47根、莖、葉片、幼穗和籽粒以及逆境脅迫處理后的根和葉片總RNA,使用Dnase Ⅰ去除gDNA的污染。單鏈cDNA的合成采用TOYOBO公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover)。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及TaPSKR1基因的克隆 在擬南芥(http://www.arabidopsis.org)數(shù)據(jù)庫獲得AtPSKR1(基因ID At2g02220)和AtPSKR2(基因ID At5g53890)的蛋白序列,同時(shí)根據(jù)Kang等[16]研究報(bào)道的OsPSKR8/LRK2(基因ID LOC_Os02g05970)基因序列在水稻數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/)獲得其蛋白序列。利用水稻和擬南芥的PSKR基因序列在WheatOmics 1.0[17]數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源搜索,獲得小麥TaPSKR1的3個(gè)部分同源基因的cDNA序列,分別定位在6A、6B和6D染色體上,基因ID分別是TraesCS6A02G124300、TraesCS6B02G152300、TraesCS6D02G114600,使用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)基因特異性引物(表1)。以晉麥47根組織的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性10 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸3.5 min,共35個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒DP219(天根,北京)進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)物的回收,并與克隆載體pEASY-Blunt Cloning vector(全式金,北京)連接,之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌液PCR鑒定后送至西安擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 基因克隆和熒光定量的引物序列Tab.1 The primers for gene cloning and fluorescence quantification

1.2.3 小麥TaPSKR1基因的生物信息學(xué)分析 利用ExPASy在線工具(https://web.expasy.org/compute_pi/)計(jì)算小麥TaPSKR1蛋白的等電點(diǎn)(Isoelectric point,pI)和分子量(Molecular weight,MW)。采用PlantCARE數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)TaPSKR1的啟動(dòng)子中的順式作用元件進(jìn)行分析,進(jìn)一步使用GSDS 2.0 在線軟件(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對(duì)調(diào)控元件的分布進(jìn)行繪制。使用DNAMAN軟件對(duì)TaPSKR1的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)和保守性分析。在NCBI 網(wǎng)站(http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/)利用BlastP程序搜索不同物種的PSKR蛋白,利用MEGA 6.0 軟件中NJ(Neighbor Joining)鄰接法,Bootstrap迭代數(shù)設(shè)置為1 000,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用TargetP 2.0在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析蛋白質(zhì)是否含有信號(hào)肽。通過在線分析軟件TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析目的蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域。利用在線工具ProtComp 9.0(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)對(duì)編碼蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析。利用SMART在線網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析目的蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)進(jìn)行分析。使用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org)程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用在線數(shù)據(jù)庫STRING(https://string-db.org/)預(yù)測(cè)TaPSKR1-6A的互作蛋白。

1.2.4TaPSKR1基因的表達(dá)模式分析 利用實(shí)時(shí)定量檢測(cè)TaPSKR1的3個(gè)部分同源基因在不同組織和不同脅迫下的表達(dá)模式。qRT-PCR所用特異引物序列詳見表1。實(shí)時(shí)熒光定量使用KOD SYBR qPCR Mix(TOYOBO,日本)試劑在 QuanStudioTM5(Foster City,CA,美國(guó))實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。qRT-PCR采用20 μL反應(yīng)體系:2×KOD SYBR qPCR Mix 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,cDNA模板1 μL,ddH2O 8.2 μL。擴(kuò)增條件:98 ℃ 變性20 s;98 ℃ 變性10 s,60 ℃退火10 s,68 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)試驗(yàn)3次生物學(xué)重復(fù),以小麥TaACTIN作為內(nèi)參基因,基因表達(dá)量采用2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaPSKR1基因全長(zhǎng)cDNA克隆及序列分析

以晉麥47生長(zhǎng)至三葉期的根組織cDNA為模板,使用特異性引物對(duì)TaPSKR1進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),獲得3 000 bp左右的特異性條帶(圖1),與預(yù)期結(jié)果基本一致。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn),TaPSKR1的3條cDNA序列位于6A、6B和6D染色體上,將其分別命名為TaPSKR1-6A、TaPSKR1-6B和TaPSKR1-6D,其編碼序列CDS全長(zhǎng)各自為 3 153,3 132,3 156 bp,分別編碼1 050,1 043,1 051個(gè)氨基酸。利用DNAMAN對(duì)3個(gè)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明,TaPSKR1-6B和TaPSKR1-6D兩者同源性達(dá)到94%,3個(gè)蛋白間的同源性在91%左右,氨基酸序列較保守,都包含ATP結(jié)合位點(diǎn)、鈣調(diào)蛋白結(jié)合位點(diǎn)和鳥苷酸環(huán)化酶催化中心(圖2)。Protparam預(yù)測(cè)TaPSKR1-6A、TaPSKR1-6B和TaPSKR1-6D的分子式分別為C5100H8171N1369O1544S43、C5064H8070N1368O1524S43和C5098H8143N1379O1539S46,相對(duì)分子量為114.75,113.88,114.85 ku,理論等電點(diǎn)(pI)分別為 5.91,6.08,6.09,屬于弱酸性蛋白?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明,TaPSKR1的3個(gè)部分同源基因僅包含一個(gè)外顯子。

M.D5000;1.TaPSKR1-6A;2.TaPSKR1-6B;3.TaPSKR1-6D。

紅色方框的氨基酸表示可能的ATP結(jié)合位點(diǎn),藍(lán)色方框氨基酸代表推測(cè)的鈣調(diào)蛋白結(jié)合位點(diǎn),黑色下劃線序列表示可能的鳥苷酸環(huán)化酶催化中心。The ATP binding site is shown in red box,the calmodulin binding site is framed in blue,the black underlined amino acids represent the potential guanosine cyclase catalytic center.

2.2 TaPSKR1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用SOPMA對(duì)TaPSKR1的3個(gè)同源蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,3個(gè)TaPSKR1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組分相似,主要由α螺旋、β折疊、延伸鏈和無規(guī)則卷曲組成。其中,無規(guī)則卷曲占總蛋白44.58%～48.14%,α螺旋占35.20%～37.97%,β折疊和延伸鏈占少部分(表2)。由于TaPSKR1蛋白同源性較高,故利用在線軟件SWISS-MOEDL對(duì)3個(gè)小麥TaPSKR1蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),以65%序列覆蓋度的磺肽素受體蛋白(Phytosulfokine receptor)4z63.1.A為參考建立模型,結(jié)果顯示,3個(gè)TaPSKR1蛋白主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲組成,其三維結(jié)構(gòu)模型相似,但是在無規(guī)則卷曲處稍有差別(圖3)。

表2 TaPSKR1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Tab.2 Predicted secondary structure of TaPSKR1 proteins %

圖3 TaPSKR1-6A(A)、TaPSKR1-6B(B)和TaPSKR1-6D(C)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of the tertiary structure of TaPSKR1-6A(A),TaPSKR1-6B(B)and TaPSKR1-6D(C)

2.3 TaPSKR1基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用在線數(shù)據(jù)庫PlantCARE對(duì)TaPSKR1起始密碼子上游2.0 kb的啟動(dòng)子序列的順式作用元件進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,TaPSKR1基因啟動(dòng)子序列包含激素響應(yīng)元件、逆境脅迫相關(guān)的作用元件、光響應(yīng)元件以及與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的元件。其中激素響應(yīng)元件只包含的脫落酸ABA響應(yīng)元件(ABRE、ABRE4、ABRE3a、AAGAA-motif),而不含有其他激素響應(yīng)元件。植物逆境有關(guān)的響應(yīng)元件主要是干旱脅迫響應(yīng)元件(MBS、MYC、MYB、DRE1、W-box)。此外,還有較多的光響應(yīng)有關(guān)的元件(Sp1、G-box)以及參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的響應(yīng)元件(CCGTCC-motif、CAT-box)(圖4)。

圖 4 TaPSKR1啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)Fig.4 Predicted cis-acting elements in TaPSKR1 promoters

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為進(jìn)一步了解TaPSKR蛋白的進(jìn)化關(guān)系,使用MEGA 6.0對(duì)小麥(Triticumaestivum)與烏拉爾圖小麥(Triticumurartu)、擬斯貝爾托山羊草(Aegilopsspeltoides)、粗山羊草(Aegilopstauschii)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、大麥(Hordeumvulgare)、玉米(Zeamays)、高粱(Sorghumbicolor)、谷子(Setariaitalica)、油菜(Brasiccarapa)、陸地棉(Gossypiumhirsutum)、玉米(Zeamays)的PSKR氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析。進(jìn)化分析表明,TaPSKR1與烏拉爾圖小麥、擬斯卑爾托山羊草、粗山羊草和水稻分為一組。TaPSKR1-6A與烏拉爾圖小麥TuPSKR1-6A,TaPSKR1-6B與擬斯卑爾托山羊草AsPSKR1-6B,TaPSKR1-6D與粗山羊草AetPSKR1-6D的氨基酸序列相似度分別為100%,94%和100%(圖5)。

Ta.小麥;At.擬南芥;Os.水稻;Zm.玉米;Tu.烏拉爾圖小麥;As.擬斯卑爾托山羊草;Aet.粗山羊草;Hv.大麥;Bd.二穗短柄草;Si.谷子;Sb.高粱;Nt.煙草;Gh.陸地棉;Br.油菜。Ta.Triticum aestivum;At.Arabidopsis thaliana;Os.Oryza sativa;Zm.Zea mays;Tu.Triticum urartu;As. Aegilops speltoides;Aet.Aegilops tauschii;Hv.Hordeum vulgare;Bd.Brachypodium distachyon;Si. Setaria italica;Sb.Sorghum bicolor;Nt.Nicotiana tabacum;Gh.Gossypium hirsutum;Br.Brasicca rapa.

2.5 信號(hào)肽、功能結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位分析

通過TMHMM-2.0在線工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析發(fā)現(xiàn),3個(gè)基因編碼的蛋白均含有一個(gè)sec信號(hào)肽(可能性是95%以上),推測(cè)小麥TaPSKR1蛋白可能是一種分泌蛋白或跨膜蛋白。利用SMART在線分析(圖6),預(yù)測(cè)到3個(gè)小麥TaPSKR1蛋白均含有跨膜結(jié)構(gòu)域、8個(gè)LRR結(jié)構(gòu)域和一個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域。其中TaPSKR1-6A和TaPSKR1-6B含有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,TaPSKR1-6A蛋白的第13—32位、以及第684—706位含有跨膜結(jié)構(gòu)域,TaPSKR1-6B蛋白的第13—35位、以及第684—706位含有跨膜結(jié)構(gòu)域,而TaPSKR1-6D只含有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(685—707位)。使用ProtComp 9.0在線預(yù)測(cè)3個(gè)蛋白的亞細(xì)胞定位,結(jié)果顯示TaPSKR1蛋白主要定位于細(xì)胞膜上。

圖6 小麥PSKR1蛋白結(jié)構(gòu)域的分布Fig.6 Domain organization of TaPSKR1 proteins

2.6 TaPSKR1 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

在線軟件STRING進(jìn)行蛋白互作預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),10個(gè)蛋白與TaPSKR1-6A互作, Traes_2AS_8E399F637.1、Traes_2AS_82E3A46B8.1、Traes_2BS_AE4EF2B88.1、Traes_2BS_50B4F489A.1、Traes_2DS_1A29CC291.1和Traes_2DS_7A6AC6376.1編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶;Traes_1AL_2312E9D23.1編碼肌球蛋白(Myosin-17);Traes_4DS_AE1B1438E.1和Traes_4DS_AE1B1438E1.1編碼人類Ski互作蛋白,與水稻OsSKIPa同源;Traes_3B_16817E311.1編碼剪切因子3a亞基(圖7)。

圖7 TaPSKR1與其他小麥蛋白聚類互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 The protein-protein interaction network between TaPSKR1 and other wheat proteins

2.7 TaPSKR1基因特異表達(dá)分析

為進(jìn)一步挖掘TaPSKR1基因的潛在功能,本研究以三葉期的根、莖、葉片和發(fā)育中期的穗和種子的cDNA為模板,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析TaPSKR1的3個(gè)部分同源基因在不同組織中的表達(dá)模式。結(jié)果表明,TaPSKR1在不同組織中表達(dá)水平存在顯著差異,3個(gè)部分同源基因在小麥根、莖、葉片、穗和種子中均有表達(dá),但是在根中的表達(dá)量顯著高于其他組織,葉片中次之,在莖和穗中的表達(dá)最低。TaPSKR1-6A、TaPSKR1-6B和TaPSKR1-6D在根中的表達(dá)量分別是穗的97.0,26.7,96.2倍,顯示出極強(qiáng)的組織特異性(圖8)。

不同小寫字母表示0.05水平差異顯著。圖9同。Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level.The same as Fig.9.

2.8 NaCl和PEG脅迫下TaPSKR1的表達(dá)特性

為了進(jìn)一步研究TaPSKR1在非生物脅迫處理下的表達(dá)模式,利用qRT-PCR方法分析PEG和NaCl處理后小麥葉片和根中基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明,小麥葉和根中TaPSKR1的3個(gè)部分同源基因響應(yīng)2種脅迫處理,但是響應(yīng)程度有所不同(圖9)。在PEG脅迫處理下,葉片中TaPSKR1的3個(gè)部分同源基因在0～6 h內(nèi)表達(dá)量未見顯著變化,之后呈逐步上調(diào)的表達(dá)趨勢(shì),特別在脅迫處理48 h后,TaPSKR1-6A、TaPSKR1-6B和TaPSKR1-6D表達(dá)急劇上調(diào),分別是對(duì)照的34,18,23倍。而在根中,TaPSKR1的3個(gè)部分同源基因表達(dá)量受誘導(dǎo)程度比葉片中要弱很多。其中,TaPSKR1-6B在脅迫處理3 h后顯著上調(diào)表達(dá),為對(duì)照的2.2倍,之后又逐漸下降。TaPSKR1-6A在處理3 h基因表達(dá)量最高,之后總體呈下降趨勢(shì)。TaPSKR1-6D的表達(dá)量在脅迫處理的12,48 h顯著高于對(duì)照,分別是對(duì)照的1.3,1.5倍。

在NaCl脅迫條件下,葉片中TaPSKR1的3個(gè)部分同源基因隨著處理時(shí)間增加表達(dá)量呈不斷上升的趨勢(shì),直到12 h,TaPSKR1-6A和TaPSKR1-6B基因相對(duì)表達(dá)量已劇烈增加了約40倍。TaPSKR1-6A、TaPSKR1-6B和TaPSKR1-6D均在處理48 h基因表達(dá)量最高,分別是對(duì)照的128,164,87倍。在根部,TaPSKR1的3個(gè)部分同源基因受鹽脅迫誘導(dǎo)均上調(diào)表達(dá),其中TaPSKR1-6A在處理6 h表達(dá)量最高,上調(diào)倍數(shù)是18倍,而TaPSKR1-6B和TaPSKR1-6D在48 h表達(dá)量達(dá)到最高,分別是未處理前的22,14倍以上。總體來看,葉片中TaPSKR1對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)比根中更加劇烈。

3 結(jié)論與討論

在植物中,PSK介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要通過細(xì)胞增殖控制器官的生長(zhǎng)。PSK被細(xì)胞膜外的受體激酶PSKR所感知。PSKR胞外區(qū)含有數(shù)量不等的LRR結(jié)構(gòu)域,屬于LRR-RLK X家族[18]。目前,通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn),PSK可以與第17,18位LRR之間的島區(qū)結(jié)合,誘導(dǎo)其構(gòu)象發(fā)生改變產(chǎn)生能夠與共受體SERK1、SERK2和BAK1結(jié)合的新界面并形成異源二聚體,通過LRR二聚化使胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域磷酸化從而激活受體PSKR[19]。PSKR不僅通過促進(jìn)細(xì)胞增大和分裂調(diào)控植物生長(zhǎng),還參與了植物對(duì)逆境脅迫響應(yīng)。本研究通過同源克隆的方法從小麥品種晉麥47中克隆了TaPSKR1的3個(gè)同源基因,將其命名為TaPSKR1-6A、TaPSKR1-6B和TaPSKR1-6D,其編碼的氨基酸長(zhǎng)度接近,理化性質(zhì)相似。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn),小麥TaPSKR1具有信號(hào)肽、8個(gè)LRR胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域,屬于LRR-RLK超家族。氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),3個(gè)TaPSKR1蛋白N端氨基酸一致性差異較大,但是在C端都具有ATP結(jié)合位點(diǎn)、鈣調(diào)蛋白結(jié)合位點(diǎn)和鳥苷酸環(huán)化酶催化中心。這些結(jié)合位點(diǎn)與已報(bào)道的擬南芥AtPSKR1結(jié)構(gòu)域特征相一致[20-21]。研究發(fā)現(xiàn),擬南芥AtPSKR1具有自我磷酸化和對(duì)下游底物的磷酸化活性[22]。此外,AtPSKR1的激酶結(jié)構(gòu)域還具有鳥苷酸環(huán)化酶催化中心,可以使細(xì)胞內(nèi)的GTP轉(zhuǎn)化為cGMP[23]。AtPSKR1還包含鈣調(diào)蛋白結(jié)合位點(diǎn),該位點(diǎn)突變顯著抑制根和地上部位的生長(zhǎng)[4]。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),TaPSKR1與水稻OsPSKRs所有家族成員聚為一類,表明它們親緣關(guān)系相對(duì)較近。

Nagar等[13]分析了水稻OsPSKRs家族成員的組織表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)多數(shù)OsPSKRs家族成員在根中表達(dá)量較高,只有少數(shù)家族成員在葉片、穗和胚中表達(dá)量較高,猜測(cè)大多數(shù)OsPSKRs參與調(diào)節(jié)了根組織的形態(tài)建成。Kutschmar等[24]研究表明,擬南芥中AtPSKR1基因在幼苗的根和葉片中均有表達(dá),但是在葉片中表達(dá)量較低,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),AtPSKR1在主根和側(cè)根的根冠組織中高表達(dá),在根的成熟區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)表達(dá)量較低。另外,擬南芥AtPSKR2同樣在根尖中高表達(dá)。在本研究中,TaPSKR1在小麥根組織中表達(dá)量極高,葉片中次之,穗中最少,說明TaPSKR1基因在調(diào)控根的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

受體激酶在植物對(duì)逆境適應(yīng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用。擬南芥胞質(zhì)受體激酶(Receptor-like cytoplasmic kinase,RLCK)家族成員CARK1正向調(diào)控ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),過表達(dá)該基因可顯著提高擬南芥抗旱性[25]。水稻中的OsRLCK241編碼LRR型RLK,在干旱和鹽脅迫下強(qiáng)誘導(dǎo)表達(dá),其過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出對(duì)干旱和鹽脅迫更高的耐受性[26]。Kang等[16]的研究表明,過量表達(dá)水稻OsPSKRs家族成員LRK2基因可顯著提高水稻的耐旱性。OsPSKR15過表達(dá)后顯著提高了水稻的抗旱性。本研究中對(duì)啟動(dòng)子元件分析表明,TaPSKR1啟動(dòng)子含有較多的干旱脅迫響應(yīng)元件,預(yù)示TaPSKR1可能參與非生物脅迫的表達(dá)調(diào)控。實(shí)時(shí)定量結(jié)果顯示,在干旱脅迫下,小麥根中TaPSKR1的3個(gè)部分同源基因表達(dá)小幅波動(dòng),而葉片中該基因在脅迫后期急劇上調(diào)表達(dá),說明相較于根,葉片中的TaPSKR1基因?qū)Ω珊得{迫產(chǎn)生更積極的響應(yīng)。在鹽脅迫下,TaPSKR1在根和葉片中均顯著上調(diào)表達(dá),但是上調(diào)程度和趨勢(shì)有所不同。小麥根中TaPSKR1在處理6,48 h 顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)。與根相比,葉片中TaPSKR1在鹽脅迫后期上調(diào)劇烈,其中,TaPSKR1-6A和TaPSKR1-6B表達(dá)上調(diào)至 100 倍以上,其上調(diào)幅度顯著高于根組織。以上結(jié)果表明,在小麥不同組織部位,TaPSKR1對(duì)非生物脅迫表現(xiàn)出不同的響應(yīng)程度,暗示TaPSKR1基因在干旱和鹽脅迫中具有潛在應(yīng)答功能。本研究結(jié)果為后續(xù)小麥TaPSKR1基因功能研究提供一定的理論基礎(chǔ)。