魏嘉瑞,代相鵬,張 勝,李子義

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 人類疾病動(dòng)物模型國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,吉林 長春 130021)

胚胎發(fā)育是一系列復(fù)雜的細(xì)胞生物學(xué)事件所組成的有序動(dòng)態(tài)過程,包括細(xì)胞分裂、生長以及向特定功能細(xì)胞命運(yùn)分化的過程。著床前胚胎發(fā)育對胎兒的正常生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用,因此需要更為精確地調(diào)控。近年來,隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)以及不斷更新,使得對胚胎早期發(fā)育機(jī)制有了更深入的認(rèn)知,尤其是胚胎發(fā)育過程中的mRNA選擇性剪接事件也不再神秘。先前大多數(shù)關(guān)于mRNA選擇性剪接調(diào)控的研究都是通過體外分析或基于細(xì)胞培養(yǎng)的系統(tǒng)進(jìn)行的。直至近幾年,小鼠基因靶向技術(shù)的應(yīng)用才提高了對剪接因子的生物學(xué)功能以及選擇性剪接產(chǎn)生特定蛋白異構(gòu)體的重要性認(rèn)識。因此,本綜述將簡要總結(jié)mRNA可變剪接在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中作用的研究進(jìn)展以及相關(guān)剪接因子的敲除對早期胚胎發(fā)育的影響。

1 可變剪接

RNA前體的剪接,即內(nèi)含子的去除和外顯子的連接,是成熟mRNA合成過程中一個(gè)關(guān)鍵且靈活的過程[1]?？勺兗艚?alternative splicing,AS)是指在前體mRNA中選擇不同的剪接位點(diǎn),形成各種排列組合,從而擴(kuò)大蛋白質(zhì)組多樣性,其發(fā)生在被稱作剪接體的大型核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)復(fù)合體中[2-3]。

AS幾乎在真核生物的各個(gè)方面都發(fā)揮著重要作用,包括細(xì)胞生長、死亡、多能性維持、分化、發(fā)育和疾病等[4-6]。近期的高通量測序結(jié)果顯示,95%～100%的人類基因和63%的小鼠基因會(huì)發(fā)生剪接事件[7-8]。剪接包含以下幾種模式:外顯子跳躍(exon skipping,ES)、內(nèi)含子保留(retention intron,RI)、可變的5′端(alternative 5′ splice site,A5SS)、可變的3′端(alternative 3′ splice site,A3SS)、可變第一外顯子(alternative first exon,AFE)、可變最末外顯子(alternative last exon,ALE)和互斥外顯子(mutually exclusive exon,MXE)[9-10]。

一般來說,剪接的過程是由復(fù)雜、動(dòng)態(tài)的剪接體介導(dǎo)的。剪接體由5個(gè)小核糖核蛋白顆粒組成,包括U1、U2、U4/U6和U5。在剪接發(fā)生時(shí),U1 snRNA(small nuclear RNA)以堿基互補(bǔ)的方式識別mRNA前體5′剪接位點(diǎn),而結(jié)合在3′剪接點(diǎn)上游富含嘧啶區(qū)的U2AF識別3′剪接位點(diǎn)并引導(dǎo)U2 snRNP與分支點(diǎn)相結(jié)合,形成剪接前體。隨后,剪接前體與U4、U5和U6 snRNP三聚體相結(jié)合,形成60S的剪接體,此時(shí)內(nèi)含子彎曲成套索狀,上、下游的外顯子相靠近,釋放U1、U4和U5、U2、U6形成催化中心,發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng),引起前體RNA分子發(fā)生剪接(圖1)。

AS對于基因的表達(dá)及蛋白質(zhì)的多樣性至關(guān)重要。REVIL等[11]研究了8～12 d小鼠胚胎中的剪接敏感外顯子芯片,發(fā)現(xiàn)AS在早期發(fā)育階段和組織中很常見。尤其是在哺乳動(dòng)物植入前胚胎發(fā)育過程中非常普遍,其中ES和MXE類型占據(jù)很大比例。然而,AS在著床前發(fā)育過程中的具體調(diào)控模式尚不清楚。

圖1 可變剪接體的作用機(jī)制

2 早期胚胎發(fā)育過程中的AS

2.1 小鼠早期胚胎發(fā)育過程哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育通過多個(gè)層次的細(xì)胞命運(yùn)決定,最終形成了器官發(fā)生、形態(tài)建成的整個(gè)發(fā)育藍(lán)圖,是生命體誕生的最重要分子事件之一。哺乳動(dòng)物的生命起始于精卵結(jié)合形成的受精卵,而后會(huì)經(jīng)歷一段復(fù)雜的早期胚胎發(fā)育過程,即從1個(gè)細(xì)胞(受精卵)逐漸分裂分化形成1個(gè)含有上百種細(xì)胞類型、多種器官的復(fù)雜有機(jī)體。在小鼠中,早期胚胎發(fā)育包括受精(受精卵)和胚胎生長(2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞、桑葚胚和囊胚)的序列成熟事件[12]。其中還包含合子基因組激活、胚胎致密化以及第1次細(xì)胞分化等多個(gè)關(guān)鍵事件,在這個(gè)過程中也受到表觀遺傳修飾、蛋白翻譯后修飾等多種途徑的調(diào)節(jié)。在囊胚階段出現(xiàn)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass,ICM)和滋養(yǎng)層細(xì)胞(trophectoderm,TE)的分化,然而最新研究表明,在4細(xì)胞或之前更早的時(shí)期就進(jìn)行了第1次細(xì)胞命運(yùn)決定,在這些過程中有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和表觀修飾因子發(fā)揮重要作用。

研究表明,在哺乳動(dòng)物的早期胚胎發(fā)育中AS是必不可少的[11]。然而,對其在早期胚胎發(fā)育中的范圍和功能的了解主要是基于一些單獨(dú)的案例研究。高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)以及不斷更新,尤其是轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)技術(shù)的出現(xiàn),極大的推動(dòng)了該方向相關(guān)的研究進(jìn)程[13]?，F(xiàn)在,選擇性剪接的研究己經(jīng)從記錄單個(gè)剪接事件及其對蛋白質(zhì)表達(dá)的影響,轉(zhuǎn)到描述全基因組范圍AS網(wǎng)絡(luò)及其如何進(jìn)行分子協(xié)調(diào)上。使得對胚胎早期發(fā)育機(jī)制有了更加深入的了解。

2.2 胚胎在2細(xì)胞階段發(fā)生大量AS早期胚胎發(fā)育是一高度有序的過程,需要精確的時(shí)空基因表達(dá)調(diào)控。AS是1個(gè)重要的分子生物學(xué)事件,它將基因組指令轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ艿鞍?在基因表達(dá)的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。通過對RNA-seq數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)AS在植入前的胚胎發(fā)育中非常普遍[14]。

AS調(diào)控著由單個(gè)細(xì)胞發(fā)育成1個(gè)成熟的生物體所需要的一系列形態(tài)變化事件,在近年來得到了廣泛研究,它可以大大增加轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性[15]。然而,對于早期胚胎發(fā)育過程中AS調(diào)控的細(xì)節(jié)人們還知之甚少。

2010年REVIL等[11]利用微陣列芯片技術(shù)報(bào)道了小鼠胚胎8.5,9.5和11.5 d AS事件的發(fā)生。揭示了AS事件在整個(gè)發(fā)育階段和組織中都很常見,從而提出了AS對發(fā)育起著重要的調(diào)節(jié)作用[11]。然而,由于技術(shù)的限制,在植入前胚胎發(fā)育中的AS事件仍有待研究。隨著單細(xì)胞RNA測序的發(fā)展,成功形成了著床前胚胎發(fā)育中的轉(zhuǎn)錄組圖譜[16-17]。 2020年,TIAN等[14]發(fā)現(xiàn),AS事件在著床前胚胎發(fā)育過程中廣泛存在,并且鑒定出695個(gè)在2細(xì)胞發(fā)生AS的基因。發(fā)現(xiàn)與著床前胚胎發(fā)育的其他階段相比,AS事件在2細(xì)胞階段的發(fā)生更為廣泛。與此同時(shí),XING等[18]也觀察到在受精卵和2細(xì)胞階段AS的發(fā)生數(shù)量顯著升高,提出AS可能在受精卵后被激活,尤其是在2細(xì)胞階段,這個(gè)過程被稱作合子AS活化(zygotic AS activation,ZASA)。通過觀察發(fā)現(xiàn)大多數(shù)AS事件屬于SE和MXE類型,這2種類型都常發(fā)生在2細(xì)胞階段。

3 剪接因子缺失導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯

3.1 剪接因子剪接因子(splicing factor,SF)是參與前體RNA剪接過程的重要蛋白質(zhì)因子,是所有AS調(diào)控的關(guān)鍵因素。SF表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致基因的AS發(fā)生改變,目前報(bào)道的SF主要包括hnRNP蛋白家族和SR蛋白家族。hnRNP蛋白主要抑制前體mRNA特定部位的剪接體形成,而SR蛋白主要促進(jìn)剪接體的轉(zhuǎn)錄。目前2個(gè)蛋白家族已經(jīng)得到了廣泛的研究。絕大部分SR蛋白對于個(gè)體的生長發(fā)育至關(guān)重要[19],特異性SR蛋白的失活可能會(huì)導(dǎo)致RNA代謝的多種缺陷,從而造成細(xì)胞死亡或影響早期胚胎發(fā)育,是調(diào)控剪接事件以及基因表達(dá)等方面的關(guān)鍵因素[20-21],并且它們經(jīng)常與其他SF合作形成增強(qiáng)復(fù)合物,如TRA2、SRRM1和SRRM2[22]。

然而,SR蛋白和hnRNPs家族在選擇剪接位點(diǎn)和外顯子時(shí)通常有相反的作用,并以競爭的方式發(fā)揮作用[23]。ESEs和ISEs主要招募SR蛋白作為剪接激活因子,而ESSs和ISSs通常被hnRNPs蛋白識別,作為剪接抑制因子[24]。例如,β-原肌凝蛋白基因的6B外顯子的剪接依賴于G-rich內(nèi)含子S3序列和6B外顯子的下游,它既可以作為增強(qiáng)子,也可以作為沉默子。ASF/SF2和SC35與S3結(jié)合,正向刺激6B外顯子的剪接,而hnRNPA1則競爭性地破壞它們的相互作用[25]。因此,SF的突變和剪接機(jī)制的失調(diào)會(huì)影響下游剪接靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò),導(dǎo)致癌癥、神經(jīng)退行性疾病和代謝性疾病等人類疾病[26]。

3.2 剪接因子敲除致死事件剪接機(jī)制功能的完整性對于正常發(fā)育和組織特異性基因表達(dá)調(diào)控至關(guān)重要,人類疾病越來越多地歸因于剪接調(diào)控的紊亂。由于SF可能調(diào)節(jié)許多不同前體mRNA的選擇性剪接,在小鼠中敲除已知的SF通常對胚胎或者幼崽的生存能力有很大的影響。大多數(shù)SF敲除會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯(表1)。能夠看到它們一部分在妊娠中期停止發(fā)育,一部分在臨產(chǎn)期或出生后幾周內(nèi)死亡。這也更加印證了SF正確發(fā)揮作用在胚胎發(fā)育過程中的必要性。

更加徹底的分析需要基因靶向以及特異性的基因缺失,目前只對ASF/SF2和SC35進(jìn)行了深入研究。ASF/SF2基因完全敲除缺失會(huì)導(dǎo)致7.5 d前的胚胎死亡;在心臟組織中特異性敲除發(fā)現(xiàn)這些小鼠以孟德爾比例出生,并開始正常發(fā)育,但在出生后6～8周死于心力衰竭[27]。此外,這些小鼠在大約4周齡時(shí)就出現(xiàn)了Ca2+代謝紊亂,并在整個(gè)剩余的生命周期中惡化,最終導(dǎo)致心臟收縮裝置的失效。SC35是一種典型的SR蛋白,最初被認(rèn)為是參與剪接體組裝的多個(gè)步驟的必要SF[28-29],后來發(fā)現(xiàn)是可以影響選擇性剪接。SC35基因完全敲除同樣可導(dǎo)致7.5 d前的胚胎死亡,與心臟中ASF/SF2特異性缺失導(dǎo)致的出生后早期死亡相比,心臟中SC35特異缺失的小鼠表現(xiàn)出正常的活力[30-31]。然而,隨著年齡的增長,這些小鼠表現(xiàn)出擴(kuò)張性心肌病的跡象。SRp20屬于高度保守的SR蛋白家族的SF[32],在體內(nèi)組成性剪接和選擇性剪接的調(diào)控中具有重要作用。SRp20是第1個(gè)關(guān)于小鼠缺乏SR蛋白家族成員的報(bào)告,其被敲除后囊胚形成受阻,桑葚胚期著床前胚胎死亡[32]。PTB是一種廣泛表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白,在RNA加工中發(fā)揮多種作用,包括選擇性外顯子的剪接、mRNA穩(wěn)定性以及mRNA的定位,2009年SHIBAYAMA等[33]報(bào)道了小鼠Ptb基因的純合子突變導(dǎo)致植入后不久的胚胎死亡。這些完全敲除或組織特異性敲除模型更加驗(yàn)證了SF在早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮了重要且非冗余的作用。

表1 剪接因子靶向缺失突變體的表型匯總

4 結(jié)語

前體mRNA的AS是基因表達(dá)調(diào)控的一種保守分子機(jī)制,在高等真核生物中普遍存在。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展,人們建立了眾多數(shù)據(jù)庫用于對可變剪接體進(jìn)行篩選,通過分子生物學(xué)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),可變剪接體在調(diào)節(jié)動(dòng)物發(fā)育和功能等方面具有十分重要的影響。目前,通過建立基因敲除模型,逐漸深入了可變剪接對胚胎發(fā)育的研究。然而,AS在發(fā)育過程中參與的信號通路、分子調(diào)控機(jī)制的研究中仍有很多空白需要填補(bǔ)。需要通過分子生物學(xué)技術(shù)與多組學(xué)技術(shù)的結(jié)合,對AS在胚胎植入前和植入后發(fā)育中的作用及分子機(jī)制展開更深層次的探究。