李小鳳,謝芝勛,阮志華,范 晴,謝志勤,武曉倩,韋 悠,張民秀,李 丹,萬麗軍,李 孟

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所,廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部中國(廣西)-東盟跨境動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530001)

血清4型禽腺病毒(fowl adenovirus serotype 4,FADV-4)是一種無囊膜的雙鏈DNA病毒,主要感染3～6周齡肉雞,誘發(fā)心包積液肝炎綜合征(hydropericardium hepatitis syndrome,HHS)[1],其發(fā)病迅猛,傳播途徑廣,致死率高,制約著我國家禽業(yè)的發(fā)展[2]。

FADV-4病毒可以入侵雞大部分器官,但病變主要發(fā)生在心臟、肝臟、腎臟,并誘發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,組織壞死[3-4]。關(guān)于FADV-4致病機(jī)制研究較少。當(dāng)病毒入侵宿主時(shí),宿主的天然免疫系統(tǒng)其特有的模式識(shí)別受體(patterns recognition receptors,PPRS)識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAM-Ps),觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素(INF)、細(xì)胞因子產(chǎn)生建立防護(hù)屏障保護(hù)宿主[5-6]。DNA模式識(shí)別受體是一種新型模式識(shí)別受體,其中一種是由環(huán)鳥苷-腺苷二磷酸合成酶(cGAS)/干擾素刺激基因(STING)介導(dǎo),識(shí)別病毒雙鏈DNA(dsDNA)[7]。當(dāng)病毒入侵機(jī)體時(shí),cGAS結(jié)合病毒dsDNA,激活干擾素刺激基因STING[8-9]。STING蛋白構(gòu)像發(fā)生變化,結(jié)合2′,3′-cGAMP,招募TANK連接酶(TBK1)[10-11],使TBK1磷酸化,為干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF7)提供結(jié)合平臺(tái),促使Ⅰ干擾素和細(xì)胞因子表達(dá),從而抑制病毒復(fù)制[12]。FADV-4感染LMH細(xì)胞,由STING依賴的干擾素及細(xì)胞因子變化情況還不明確。監(jiān)測(cè)FADV-4感染LMH細(xì)胞病毒后不同時(shí)間點(diǎn)STING介導(dǎo)信號(hào)通路識(shí)別受體及其下游干擾素、細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平動(dòng)態(tài)變化,分析其變化規(guī)律,進(jìn)一步了解FADV-4的致病機(jī)制和免疫機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 病毒與細(xì)胞FADV-4與雞肝癌細(xì)胞(LMH)均由廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基(批號(hào):8122171)、胎牛血清(FBS,批號(hào):WXBD8944V),購自美國賽默飛世爾科技公司;Universal Genomic DNA Kit(批號(hào):18221),購自北京康為世紀(jì)生物科技公司;Gene JET RNA Purification Kit(批號(hào):00968689)、2×SYBR Green Master Mix(批號(hào):91302107),購自美國英杰生命技術(shù)公司;Prime Script RT Master Mix(批號(hào):AL12412A),購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器超微量分光光度計(jì)(型號(hào)為NanoDrop2000)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)為Quant Studio 5),購自美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品;倒置熒光顯微鏡(型號(hào)為ECLIPSETi2-U),購自日本Nikon公司。

1.4 FADV-4感染LMH細(xì)胞及樣品收集LMH細(xì)胞按1×106個(gè)/mL接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)24 h,棄掉培養(yǎng)基,接種FAdV-4病毒液稀釋液(1∶500)0.5 mL,對(duì)照組接種等量的PBS,作用1～2 h,后每孔補(bǔ)加1.5 mL的培養(yǎng)基。以24 h為1個(gè)時(shí)間點(diǎn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞病變情況并收集細(xì)胞樣品,連續(xù)培養(yǎng)至120 h。

1.5 LMH細(xì)胞的病毒載量測(cè)定參照Universal Genomic DNA Kit的抽提試劑盒提供的方法進(jìn)行病毒DNA抽提,NanoDrop2000測(cè)定質(zhì)量濃度后將病毒DNA定量為100 mg/L,進(jìn)行絕對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR,擴(kuò)增體系(總體積為20 μL):2×SYBR Green Mix 10 μL,10 μmol/L上、下游引物各1 μL(引物信息見表1 FADV-4),DNA模板 2 μL,RNasefree水6 μL。擴(kuò)增程序:50℃激活2 min,95℃預(yù)變性2 min,95℃變性15 s,60℃退火1 min,60℃延伸1 min,共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。結(jié)果按照前期實(shí)驗(yàn)室建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算[13]。

1.6 STING依賴的干擾素及細(xì)胞因子表達(dá)量的測(cè)定參照Gene JET RNA Purification Kit抽提試劑盒說明書進(jìn)行RNA抽提,超微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度,進(jìn)行一步法反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(總體積為20 μL):5×PrimeScript RT Master Mix 4 μL,RNA 1 μg,無核酸酶水補(bǔ)至20 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序:37℃ 15 min,85℃ 5 s。以得到的cDNA稀釋10倍后作為模板進(jìn)行相對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR,實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系和程序同1.5所述。檢測(cè)STING、TBK1、IRF7、INF-α、INF-β、IL-6、IL-8、IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平,以β-actin為內(nèi)參基因,引物信息見表1[14]。

1.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析將獲得的FADV-4基因的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)值(Ct)后,代入已建好的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算細(xì)胞內(nèi)病毒拷貝數(shù)。通過將獲得的試驗(yàn)組與對(duì)照組目的基因,β-actin的Ct值,代入2-ΔΔCt公式計(jì)算相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平,計(jì)算公示為:△Ct(試驗(yàn)組)=Ct(試驗(yàn)組目的基因)-Ct(試驗(yàn)組內(nèi)參基因);△Ct(對(duì)照組)=Ct(對(duì)照組目的基因)-Ct(對(duì)照組內(nèi)參基因),△△Ct=△Ct(試驗(yàn)組)-△Ct(對(duì)照組),表達(dá)量的差異倍數(shù)使用2-ΔΔCt。利用IBM SPSS Statistics 2.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Studentt差異性分析,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著P<0.01。采用Prism8軟件制圖。

表1 熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 FAdV-4感染LMH細(xì)胞后病變和病毒復(fù)制情況FAdV-4感染LMH細(xì)胞,24 h后初露病變跡象,48 h后小部分細(xì)胞變圓、變亮;72 h后細(xì)胞聚集,間隙增大,病變較為明顯;96～120 h細(xì)胞出現(xiàn)大量脫落、破裂、死亡,細(xì)胞內(nèi)部有被侵蝕現(xiàn)象(圖1)。為明確LMH細(xì)胞中FAdV-4病毒復(fù)制情況,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的病毒拷貝數(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn),FAdV-4病毒感染LMH細(xì)胞后,病毒拷貝數(shù)整體趨勢(shì)是先增加后減少,在48 h前快速增加,72 h達(dá)到最大值,拷貝數(shù)為9.13×1010copies/μL,96～120 h出現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖2)。

圖1 FADV-4感染LMH細(xì)胞的病變圖片(×100 μm )

圖2 FADV-4感染LMH細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)的病毒載量

2.2 FAdV-4感染LMH細(xì)胞后STING依賴的干擾素及細(xì)胞因子表達(dá)量動(dòng)態(tài)變化為了明確FAdV-4感染LMH細(xì)胞后STING依賴的干擾素及細(xì)胞因子表達(dá)量動(dòng)態(tài)變化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定STING、TBK1、IRF7、INF-α、INF-β、IL-6、IL-8、IL-1β在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量。以未接毒組為對(duì)照組,β-actin為內(nèi)參基因,所測(cè)定的這8種基因表達(dá)量呈現(xiàn)規(guī)律性變化。STING感染后表達(dá)量與對(duì)照組的相比,24 h先出現(xiàn)下調(diào),之后上調(diào),72 h 顯著上調(diào)(P<0.05),96～120 h極顯著上調(diào),在96 h達(dá)到上調(diào)高峰(19.23倍,P<0.01)(圖3A)。TBK1感染后表達(dá)量與對(duì)照組的相比,24～48 h顯著上調(diào)(P<0.05),72 h輕微下調(diào),隨后持續(xù)下調(diào),96～120 h顯著下調(diào)(P<0.05),趨于平穩(wěn)(圖3B)。IRF7感染后表達(dá)量與對(duì)照組相比,24 h先上調(diào),48 h 反而輕微下調(diào),72～120 h后持續(xù)上調(diào),在96～120 h 出現(xiàn)極顯著上調(diào)且在120 h達(dá)到上調(diào)高峰(12.02倍,P<0.01)(圖3C)。Ⅰ型干擾素INF-α、INF-β和細(xì)胞因子IL-6、IL-8感染后表達(dá)量與對(duì)照組的相比,均呈現(xiàn)較大幅度的上調(diào)。INF-α表達(dá)量在24～120 h連續(xù)上調(diào),在72～120 h極顯著上調(diào)(P<0.01),到120 h上調(diào)44.30倍(P<0.01)(圖3D)。INF-β表達(dá)量變化趨勢(shì)是先上升后下降,96 h 達(dá)到上調(diào)高峰(63.85倍,P<0.01)(圖3E)。IL-6表達(dá)量變化趨勢(shì)與INF-α的相似,在所檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)連續(xù)上調(diào),在96～120 h極顯著上調(diào)(P<0.01),120 h上調(diào)達(dá)到89.23倍(P<0.01)(圖3F)。IL-8表達(dá)量在24～96 h 持續(xù)上調(diào),72～120 h達(dá)到極顯著上調(diào)(P<0.01),96 h出現(xiàn)峰值(75.34倍,P<0.01),120 h出現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)(圖3G)。炎癥因子IL-1β表達(dá)量在感染24～72 h降低(P<0.05),72～120 h有升高趨勢(shì),這可能是降低LMH細(xì)胞受FADV-4傷害的一種方式(圖3H)。

*.差異顯著(P<0.05);**.差異極顯著(P<0.01)

3 討論

天然免疫細(xì)胞的模式識(shí)別受體特異性識(shí)別病原體,促進(jìn)干擾素和細(xì)胞因子表達(dá),誘發(fā)一系列“自我防衛(wèi)”,其中STING介導(dǎo)的信號(hào)通路是抗病毒的重要環(huán)節(jié)之一。FAdV-4不僅感染肉雞、蛋雞、種雞[15-16],且在鴨子、鵝,鴿子、鴛鴦等動(dòng)物發(fā)現(xiàn)[17-19],其病程短、致死率高,造成養(yǎng)殖業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此,監(jiān)測(cè)FAdV-4感染LMH細(xì)胞后STING依賴的干擾素及細(xì)胞因子表達(dá)量動(dòng)態(tài)變化,為進(jìn)一步研究FADV-4致病機(jī)制奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。結(jié)果表明,STING、TBK1、IRF7、INF-α、INF-β、IL-6、IL-8的表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的上調(diào),干擾素INF-α、INF-β及細(xì)胞因子IL-6、IL-8的表達(dá)量上調(diào)較為顯著。提示STING-TBK1-IRF7介導(dǎo)的信號(hào)通路受體誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素和細(xì)胞因子表達(dá),在應(yīng)答FADV-4感染LMH細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。

STING是DNA信號(hào)通路的一個(gè)關(guān)鍵接頭蛋白,位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),在免疫系統(tǒng)作為樞紐蛋白,發(fā)揮信號(hào)傳遞,啟動(dòng)天然免疫功能[20-21]。已有研究表明,當(dāng)病原體核酸暴露于細(xì)胞質(zhì),STING被激活,形成二聚體,開始膜運(yùn)輸,經(jīng)過高爾基體最終到達(dá)細(xì)胞核周圍,其C端尾部(CTT)打開呈線性化,連接TBK1,同時(shí)TBK1被磷酸化,并為IRF7提供結(jié)合平臺(tái),使其磷酸化,激活下游的干擾素和炎性因子上調(diào)表達(dá)。本試驗(yàn)中,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn),FADV-4感染LMH細(xì)胞后,STING、TBK1、IRF7表達(dá)量出現(xiàn)不同程度的上調(diào)。STING在感染24 h出現(xiàn)輕微下調(diào),后上調(diào),在96 h達(dá)到19.23倍(P<0.01),分析STING表達(dá)量在24 h下調(diào)原因可能是LMH細(xì)胞天然免疫系統(tǒng)識(shí)別到FADV-4的入侵時(shí)被活化,形成二聚體,之后表達(dá)量上調(diào),在72 h顯著上調(diào),此時(shí)的FADV-4的病毒達(dá)到增殖高峰(9.13×1010copies/μL),96～120 h病毒載量出現(xiàn)下降趨勢(shì),病毒復(fù)制拷貝數(shù)從9.13×1010copies/μL下降到9.03×1010copies/μL,STING的轉(zhuǎn)錄水平維持在一個(gè)較高水平,表明STING與病毒復(fù)制有一定正相關(guān)性。TBK1的轉(zhuǎn)錄水平在感染24～48 h 顯著上調(diào),72 h輕微下調(diào),保持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的數(shù)值,分析下調(diào)原因可能是當(dāng)天然免疫系統(tǒng)被激活時(shí),TBK1被STING磷酸化,其以磷酸化形式(PTBK1)存在。IRF7表達(dá)量在感染后,先上調(diào)后下調(diào),再持續(xù)上調(diào),在120 h出現(xiàn)峰值,暗示隨著FADV-4快速增殖,IRF7開始與FADV-4病毒作較量,抑制病毒復(fù)制。STING、IRF7表達(dá)量平升高與LI[22]在感染FADV-4的雞身上研究的結(jié)果一致。以上提示,STING介導(dǎo)的信號(hào)通路受體在FADV-4感染LMH細(xì)胞后,48 h前可能是識(shí)別過程,隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)病毒復(fù)制拷貝數(shù)增加,STING-TBK1-IRF7介導(dǎo)的信號(hào)通路積極參與調(diào)控LMH細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

STING介導(dǎo)的信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素表達(dá)抗病毒已經(jīng)得到證實(shí)。INF-α、INF-β屬于常見的Ⅰ型干擾素,是免疫調(diào)節(jié)和抗病毒感染的重要因子。INF-α和INF-β在感染后72 h劇烈上調(diào),INF-α在120 h出現(xiàn)峰值(44.30倍),INF-β在感染后96 h達(dá)到上調(diào)高峰(63.85倍)。IL-6是一種典型的功能性多效性細(xì)胞因子,在宿主防御中發(fā)揮重要作用。當(dāng)感染或組織損傷發(fā)生時(shí),IL-6由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞迅速產(chǎn)生,有幫助清除感染因子和修復(fù)受損組織作用[23]。IL-8是趨化因子家族的成員,介導(dǎo)局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答輔助抗體生成。IL-6、IL-8表達(dá)量在感染72 h后與對(duì)照組的相比出現(xiàn)劇烈的上調(diào),上調(diào)高峰分別為89.23,75.34倍,研究結(jié)果與NIU等[24]的研究一致。FADV-4感染LMH細(xì)胞后,病毒在48 h前快速復(fù)制,72 h病毒復(fù)制拷貝數(shù)最高,INF-α、INF-β、IL-6、IL-8在感染后24～72 h呈上升趨勢(shì),在72 h時(shí)上升倍數(shù)從高到低分別為IL-8(32.80倍)、INF-β(19.76倍)、IL-6(15.52倍)、INF-α(14.84倍)。表明IL-8是抗感染的主要免疫因子。72 h正是病毒感染的高峰期,病毒迅速入侵細(xì)胞內(nèi)部,侵害細(xì)胞,使細(xì)胞聚集,間隙增大,破裂,導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)吸收降低,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。96～120 h期間,FADV-4在LMH細(xì)胞中呈下降趨勢(shì),大量細(xì)胞死亡。INF-α、IL-6依然處于上升趨勢(shì),INF-β、IL-8呈現(xiàn)下降趨勢(shì),在120 h時(shí),INF-α、INF-β、IL-6、IL-8表達(dá)量從高到低分別為IL-6(89.23)、IL-8(57.38)、INF-α(44.30)、INF-β(42.60)。表明在感染后期,IL-6是主要的抗感染的細(xì)胞因子,這與其幫助清除感染因子和修復(fù)受損組織作用相一致[23]。猜測(cè)FADV-4的病毒載量下降原因有2個(gè):一是INF-α、INF-β、IL-6、IL-8起到了抗病毒復(fù)制的作用;二是LMH細(xì)胞在感染后期,細(xì)胞大量死亡病毒失去了宿主,失去營養(yǎng)物質(zhì)的來源,導(dǎo)致下降。這有待進(jìn)一步研究。炎癥因子IL-1β感染后先降低后升高,可能是通過降低其表達(dá)量減少病毒對(duì)LMH細(xì)胞的損傷利于病毒復(fù)制,后升高是抑制病毒復(fù)制。FADV-4感染LMH細(xì)胞后,72 h增殖出現(xiàn)高峰后下降,可能是因?yàn)長(zhǎng)MH細(xì)胞免疫應(yīng)答被激發(fā)后INF-α、INF-β、IL-6、IL-8表達(dá)量升高,協(xié)同抑制FADV-4的復(fù)制。提示INF-α、INF-β、IL-6、IL-8在抗FADV-4感染LMH細(xì)胞發(fā)揮重要作用。

在FADV-4感染LMH細(xì)胞后,STING介導(dǎo)的信號(hào)通路識(shí)別受體,誘導(dǎo)細(xì)胞因子和干擾素上調(diào)表達(dá),提高免疫應(yīng)答,抑制FADV-4病毒復(fù)制、增殖。這些結(jié)果豐富了宿主抵抗FADV-4感染天然免疫應(yīng)答機(jī)理的研究。